新型腈水合酶的制作方法

专利名称：新型腈水合酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型腈水合酶及编码其的基因、含有该基因的质粒、经该质粒转化了的细胞株、及用所述细胞株生产腈水合酶的方法、以及利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。另外，本发明还涉及一种改变具有腈水合酶活性的酶的性质的方法。此外，本发明还涉及一种改变了性质的酶及编码其的基因、含有所述基因的质粒、经所述质粒转化了的细胞株、用所述细胞株生产腈水合酶的方法，以及利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。本发明可有效用于利用生物催化剂的物质生产领域中。
背景技术：
已经发现了作为具有腈水合活性的酶的腈水合酶，该酶能够通过水合作用将各种化合物的腈基转换成酰胺基，并且公开了多种生产该酶的微生物株。为了在工业上利用腈水合酶从腈化合物制造酰胺化合物，降低该酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤显重要。具体而言，必须提高每单位重量酶制备物中该酶的含量。因此为了利用所述酶的基因通过基因工程学方法大量表达所述酶，尝试对所述酶的基因进行克隆的方法。作为具有腈水合酶活性的微生 物，有紫红红球菌J-1株(根据布达佩斯条约，保藏在茨城县筑波市东1-1-1号中央第6独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERMBP-1478)、嗜热假诺卡氏菌(本菌株保藏在理化学研究所微生物系统保存处(埼玉县和光市广泽2-1)，保藏编号为JCM3095，任何人都可经申请获得；另外，根据布达佩斯条约，保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-73790 )(参照专利文献I及3)。另外，从上述菌株中分离出了腈水合酶，已经确认了该酶一般以称为α亚单位及β亚单位的2种多肽为构成要素。并且，从上述菌株中分离出了腈水合酶基因，确定了其氨基酸序列和碱基序列。进而，制备了可使上述腈水合酶在转化子内表达的质粒及经所述质粒转化了的细胞株(例如，TGl/pNHJ10H及MT-10822:根据布达佩斯条约，前者保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-2777 ;后者于1996年2月7日保藏在茨城县筑波市东1-1-1号中央第6独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-5785)。除此之外，能够经上述细胞株生产腈水合酶、以及通过使所述细胞株或者由其制得的腈水合酶与腈化合物接触以制备对应的酰胺化合物(参照专利文献2、4，非专利文献I)。另外，也进行了分析腈水合酶的立体结构的尝试，分析结果以PDB编号1AHJ、2AHJ、1IRE被公开。已知所述酶的基本结构单位为α亚单位及β亚单位结合而成的2聚体，该2聚体进一步结合形成4聚体、8聚体、12聚体(根据来源的生物种而不同)而发挥活性。另外，形成活性中心的区域、结构也已明确，活性中心并非表露于与反应溶剂直接接触的酶外侧的位置，而是包埋于酶的内部。也清楚发挥活性所必须的金属原子(钴原子或者铁原子:根据来源的生物种而不同)在活性中心的配位形态，并已知作为伴随金属原子配位发生的现象，形成活性中心区域的氨基酸序列中半胱氨酸残基在翻译后发生氧化。具体而言，α亚单位的氨基酸序列中序列X1CXLC1SC2X2X3X4X5(其中，C表示半胱氨酸，X表示丝氨酸或苏氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亚磺酸(cysteine sulfinicacid、3_sulfinoalanine), S 表不丝氨酸，C2 表不半胱次横酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine), X1^ X2> X3> X4> X5表示任意氨基酸)表示的区域为构成金属原子在活性中心进行配位的区域(参照非专利文献2 4)。但是，还没有任何发明公开关于在不影响腈水合酶自身活性的情况下，改变其活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等性质的具体方法。特别是着眼于腈水合酶的立体结构、通过改变结构而改变上述性质的方法还未作任何尝试。另外，专利文献5中公开了使编码腈水合酶的基因在宿主细胞中表达而生产具有酶活性的腈水合酶时，存在一种参与激活所述酶的蛋白质。专利文献1:特开平2-470号公报专利文献2:特开平4-211379号公报专利文献3:特开平8-56684号公报专利文献4:特开平9-275978号公报专利文献5:特开 平11-253168号公报非专利文献1:Kobayashi M, Nishiyama M, Nagasawa T, Horinouchi S, BeppuΤ，Yamada H.Cloning, nucleotide sequence and expression inEscherichia coli oftwo cobalt-containing nitrile hydratase genes fromRhodococcus rhodochrousJl.Biochim Biophys Acta.1991 Dec 2 ；1129 (I):23-33.
非专利文献2:Huang W, Jia J，Cummings J，Nelson M，Schneider G，LindqvistY.Crystal structure of nitrile hydratase reveals a novel iron centrein a novelfold.Structure.1997May 15 ；5 (5):691-9.
非专利文献3:Nagashima SiNakasako MiDohmae N, Tsujimura M, Takio K, OdakaM，Yohda M，Kamiya N，Endo 1.Novel non-heme ironcenter of nitrile hydratase witha claw setting of oxygen atoms.Nat StructBiol.1998 May ；5 (5):347-51.
非专利文献4:Miyanaga，A.，Fushinobu，S.，Ito，K.，and Wakagi, T.Crystalstructure of cobalt-containing nitrile hydratase.Biochem.Biochem Biophys ResCommun.2001 Novl6 ；288(5):1169-74.

发明内容
本发明的目的在于提供一种具有新型置换突变位点但功能无实质变化的腈水合酶的氣基酸序列和该基因的减基序列，还提供一种含有所述基因的质粒、经所述质粒转化了的细胞株、及用所述细胞株生产所述酶的方法，以及利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。
本发明的其它目的在于提供一种在不损害腈水合酶自身活性的情况下，改变其活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等性质中的一种或一种以上的具体方法。具体而言，提供一种通过在腈水合酶基因中引入导致腈水合酶立体结构发生变化的突变而改变上述性质的方法，进而，提供一种经修饰方法得到的腈水合酶、编码所述腈水合酶的基因、含有所述基因的质粒、经所述基因或所述质粒转化了的细胞株、用所述细胞株生产所述腈水合酶的方法、以及利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。本发明人等基于上述情况，在特开平9-275978号公报(专利文献4)中公开的腈水合酶基因中引入了未在该文献中公开的新型置换突变位点，并确定了导入所述突变后所述基因的碱基序列。进而制备出了含有所述基因的质粒、经所述质粒转化了的细胞株。另夕卜，通过反复深入地研究了利用所述细胞株生产所述酶、或利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备出对应的酰胺化合物，从而完成了本发明。本发明的腈水合酶的α亚单位的特征为，其氨基酸序列具有下述突变，S卩，在序列号I表示的α亚单位的氨基酸序列中第36、71、148、及204位氨基酸中的任何一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。本发明的腈水合酶的β亚单位的特征为，其氨基酸序列具有下述突变，即，在序列表的序列号2表示的β亚单位的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任何一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。本发明的腈水合酶的特征为，具有α亚单位和β亚单位，上述亚单位中至少一方存在上述突变。编码本发明腈水合酶的α亚单位的基因的特征为，其负责编码存在于上述α亚单位中的突变的氨基酸序列；编码本发明腈水合酶的β亚单位的基因的特征为，其负责编码存在于上述β亚单位中的突变的氨基酸序列。

编码本发明腈水合酶的基因的特征为，包含编码α亚单位的基因和编码β亚单位的基因，上述亚单位中至少一方存在上述突变。本发明的质粒的特征为，具有上述的任一种基因。本发明的转化子的特征为，通过利用上述质粒转化宿主细胞而得到。本发明中腈水合酶的制备方法特征为，其包含从上述转化子、上述转化子的培养液、或者上述转化子或上述培养液的处理物中回收腈水合酶的步骤。本发明的酰胺化合物的制备方法的特征为包含下述步骤:在水性介质中使腈化合物与上述腈水合酶接触，从而将所述腈化合物转化为对应的酰胺化合物的步骤。另外，本发明人等鉴于上述情况，以专利文献2、专利文献4中公开的腈水合酶基因为例，基于新观点规定了作为突变对象的区域，并实施对腈水合酶进行修饰的方法，即对形成该区域的氨基酸残基所对应的氨基酸序列中的氨基酸进行置换、插入、或缺失等改变而修饰腈水合酶。具体而言，参照非专利文献2、3、4、及以TOB号:1AHJ、2AHJ、1IRE中公开的腈水合酶的立体结构，经深入分析研究，确定了符合要求的修饰对象区域。更具体而言，通过解析立体结构，确定了形成孔穴的区域、以及形成界面的区域，所述孔穴是底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴，所述界面为参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间结合的界面及参与2聚体之间相互结合的界面。对氨基酸序列进行置换、插入、缺失等修饰的方法没有特别的限制，可以举出例如采用基因重组手段引入突变的方法。进一步确定了经所述修饰后该基因的碱基序列，制备了含有所述基因的质粒、经所述基因或质粒转化了的细胞株，用所述细胞株生产所述酶或利用培养所述细胞株得到的培养液、细胞、细胞处理物从腈化合物制备对应的酰胺化合物，从而观察了修饰方法对腈水合酶的性质造成了何种改变。经过反复深入研究构成作为修饰对象的腈水合酶的氨基酸序列中各位点的改变及由此得到的各种修饰酶，从而完成了本发明。S卩，除了上述特征，本发明还涉及下述[I] [22]中所述内容。[I], 一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法通过以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对特定的氨基酸残基中I个或I个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变该酶的活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中的任何I种或I种以上的性质，这些步骤为:(a)将修饰前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列与序列表中序列号98记载的氨基酸序列及序列表中序列号99记载的氨基酸序列进行对比；(b)根据对比的结果确定与下述区域对应的氨基酸残基，所述区域为，序列表中序列号98记载的氨基酸序列中从第36位的苏氨酸到第48位的天冬酰胺的区域、序列表中序列号99记载的氨基酸序列中从第31位的赖氨酸到第51位的苯丙氨酸的区域、以及从第112位的赖氨酸到第127位的亮氨酸的区域；(c)对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上位点进行置换、插入或缺失处理。[2], 一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法通过以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对特定的氨基酸残基中的I个或I个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、 底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任何I种或I种以上性质，这些步骤为:(d)将修饰前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列与序列表中序列号98记载的氨基酸序列及序列表中序列号99记载的氨基酸序列进行对比；(e)根据对比的结果确定与序列表中序列号98记载的氨基酸序列中第36、48、71、148、188、204位对应的氨基酸残基、与序列表中序列号99记载的氨基酸序列中第10、32、33、37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218 位
对应的氣基酸残基；(f)对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上位点进行置换、插入或缺失处理。[3], 一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法通过以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对特定的氨基酸残基中的I个或I个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任何I种或I种以上性质，(g)基于F1DB (Protein Data Bank)号:1IRE记载的腈水合酶的立体结构和与氨基酸序列进行对比的结果推定修饰前的具有腈水合酶活性的酶的立体结构；(h)根据推定的立体结构确定与PDB号:1IRE记载的腈水合酶立体结构的A链(Chain IIRE:A)中从N末端算起的第2个螺旋对应的区域的氨基酸残基；以及与B链(Chain IIRE:B)中从N末端算起的第I个螺旋、第2个螺旋、及夹在其间的环状部分、和从C末端算起的第3个螺旋对应的区域的氨基酸残基；(i)对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上位点进行置换、插入或缺失处理。[4], 一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法经以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任何I种或I种以上性质，(j)基于PDB号:1IRE记载的腈水合酶的立体结构和与氨基酸序列进行对比的结果推定修饰前的具有腈水合酶活性的酶的立体结构；(k)根据推定的立体结构确定与PDB号:1IRE记载的腈水合酶立体结构的A链中从N末端算起作为第89位氨基酸残基的谷氨酰胺、作为第165位氨基酸残基的谷氨酸、以及从B链N末端算起作为第37位氨基酸残基的苯丙氨酸、作为第48位氨基酸的亮氨酸对应的4个氣基酸残基；(I)确定下述氨基酸残基，所述氨基酸残基的侧链前端重原子位于立体结构中半径为5A的范围内，该立体结构分别以上述确定的4个氨基酸残基的侧链前端重原子为其中心点；(m)对上述I中确定的氨基酸残基中的I个或I个以上位点进行置换、插入或缺失处理。[5], 一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法经以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物 特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任I种或I种以上的性质，(η)基于PDB号:IIRE记载的腈水合酶的立体结构和氨基酸序列进行对比，根据对比结果来推定修饰前的具有腈水合酶活性的酶的立体结构；(ο)根据推定的立体结构确定形成下述孔穴的区域，所述孔穴是底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴；(P)在构成确定的区域的氨基酸残基中确定如下的氨基酸残基，这些氨基酸残基的改变使孔穴尺寸发生变化，进而可控制底物/产物通过的难易程度；(q)对上述P中确定的氨基酸残基中的I个或I个以上位点进行置换、插入或缺失处理。[6], 一种具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法经以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上的位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任I种或I种以上性质，(r)基于PDB号:IIRE记载的腈水合酶的立体结构和氨基酸序列进行对比，根据对比结果来推定修饰前的具有腈水合酶活性的酶的立体结构；(s)根据推定的立体结构确定以下共计4个氨基酸残基,该氨基酸残基为与F1DB号:1IRE记载的腈水合酶立体结构中从A链的N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(A89Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(A165E)对应的氨基酸残基，以及与从B链的N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、作为第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)对应的氨基酸残基;(t)规定对应于A165E的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为dl，对应于A89Q的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d2，对应于B37F的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d3，确定使dl d3中的I项或I项以上发生变化的氨基酸残基；(U)对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上位点进行置换、插入或缺失处理。[7],在[6]记载的修饰方法中，⑴的步骤如下述(t’ )所述，(t’)规定对应于Α165Ε的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为dl，对应于A89Q的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d2，对应于B37F的氨基酸残基和对应于B48L的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d3，对应于A165E的氨基酸残基和对应于B37F的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d4，对应于A89Q的氨基酸残基与对应于B37F的氨基酸残基之间的最短重原子间距为d5，确定使dl d5中的I项或I项以上发生变化的氨基酸残基。[8],如[I] [7]中任一项所述的修饰方法，其特征为，修饰前的具有腈水合酶活性的酶含有下述[A]和[B]所述的2种多肽:[A]由与序列表的序列号98记载的氨基酸序列有40%或40%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽；[B]由与序列表的序列号99记载的氨基酸序列有25%或25%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。[9],如[8]所述的修饰方法，其特征为，[A]所述的多肽为下述[C]所述的多肽，[B]所述的多肽为下述[D] 所述的多肽，[C]由下述任一种氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列为序列表的序列号98记载的氨基酸序列；对序列表的序列号98记载的氨基酸序列中的至少I个位点进行置换、插入、或缺失处理而得到的氨基酸序列；将序列表的序列号98记载的氨基酸序列中的第6、
19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中的至少 I 个氨基酸置换为其它氨基酸而得到的氨基酸序列。[D]由下述任一种氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列为序列表中序列号99记载的氨基酸序列；对序列表的序列号99记载的氨基酸序列中的至少I个位点进行置换、插入、或缺失处理而得到的氨基酸序列；将序列表的序列号99记载的氨基酸序列中的第
20、21、108、200、212位氨基酸中的至少I个氨基酸置换为其它氨基酸而得到的氨基酸序列。[10].如[8]所述的修饰方法，其特征为，[A]所述的多肽为下述[E]所述的多肽，[B]所述的多肽为下述[F]所述的多肽。[E]由与下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列为序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704位到第1315位碱基形成的ORF (Open ReadingFrame，开放读码框)所编码的氨基酸序列。[F]由与下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列为序列表的序列号104记载的碱基序列中从第I位到第680位碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列。
[11].—种修饰前具有腈水合酶活性的酶的修饰方法，该方法经以下步骤确定特定的氨基酸残基，并对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上位点进行置换、插入或缺失处理从而改变所述酶的活性、底物特异性、Vmax> Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中的任何I种或I种以上性质，其特征为，所述修饰前具有腈水合酶活性的酶中作为构成要素含有的2种多肽中，一种为[10]中的[E]记载的多肽，另一种为[10]中的[F]记载的多肽，(d’)将修饰前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列与序列表的序列号99记载的氨基酸序列进行对比，(e’)根据对比的结果确定与序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第48、51位对应的氣基酸残基，(f’ )对确定的氨基酸残基中的I个或I个以上位点进行置换、插入或缺失处理。[12].如[8]所述的修饰方法，其特征为，[A]所述的多肽为下述[G]所述的多肽，[G]含有氨基酸序列为X1CXLC1SC2X2X3X4X5的区域的多肽(其中，C表示半胱氨酸，X表示丝氨酸或苏氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亚磺酸(cysteine sulfinicacid、3_sulfinoalanine), S 表不丝氨酸，C2 表不半胱次横酸(cysteine sulfenic acid、S-hydroxy-cysteine), X1^ X2> X3> X4> X5 表示任意氨基酸)。[13].如[12]所述的修饰方法，其特征为，所述序列中X1表示缬氨酸，X4表示色氨
酸，X5表示脯氨酸。[14].如[13]所述的修饰方法，其特征为，所述序列中X2表示酪氨酸，X3表示脯氨酸。[15].如[12] [14]中任一项所述的修饰方法，其特征为，通过X1CXLC1SC2X2X3X4X5序列表示的区域与金属原子结合。[16].如[15]所述的修饰方法，其特征为，所述金属原子为钴原子。[17].—种修饰酶，其特征为，所述酶是利用[I] [16]中任一项所述的修饰方法而得到的。[18].—种基因，其特征为，所述基因是编码[17]所述修饰酶的基因。[19].一种质粒，其特征为，所述质粒含有[18]所述的基因。[20].—种转化子，其特征为，所述转化子是利用[18]所述基因或[19]所述质粒转化微生物而得到的。[21].—种制备修饰酶的方法，其特征为，所述方法包含从培养[20]所述的转化子而得到的培养液、细胞、或其处理物中回收修饰酶的步骤。[22].—种制备酰胺化合物的方法，其特征为，所述方法包含以下步骤:在溶剂中，使培养[20]所述的转化子而得到的培养液、细胞、或其处理物、或者经[21]所述的制备方法得到的修饰酶与腈化合物接触，从而将该腈化合物转化为对应的酰胺化合物。本发明提供一种 腈水合酶的氨基酸序列及所述基因的碱基序列，所述腈水合酶来源于嗜热假诺卡氏菌，具有新型突变位点，但其本质功能未发生变化。本发明进一步提供一种含有所述基因的质粒、含有所述质粒的转化子、用所述转化子生产所述酶的方法、以及利用所述转化子从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。本发明还提供一种酶的修饰方法，其采用以改变具有腈水合酶活性的酶的立体结构为特征的方法来修饰在修饰前具有腈水合酶活性的酶。作为采用上述方法的修饰方法可获得的效果的特征可以举出，能够改变活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等性质中的I种或I种以上性质。另外本发明提供一种具有新型突变位点的腈水合酶、及编码构成所述酶的多肽链的基因。还可以提供一种含有所述基因的质粒、含有所述基因或所述质粒的转化子、利用所述转化子生产所述酶的方法，以及利用所述转化子从腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。


图1表示从MT10822提取的质粒pPT_DBl的限制性核酸内切酶的酶切图。(参考例1、实施例1、83)图2表示用于表达具有活性的来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶而构建的质粒PJlH-DBl的限制性核酸内切酶的酶切图。(实施例84)图1及图2中使用的省略符号的含义如下:bla表示编码β -内酰胺酶的0RF。Col El-ori表示Col El系统的复制起始位点。IacZ表示来源于pUC 18的乳糖操纵子中的启动子和操纵基因区域。NHa表示编码来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的a亚单位的ORF。NHβ表示编码来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的β亚单位的0RF。Ρ16表示编 码下述蛋白质的0RF，所述蛋白质的特征为，其参与来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的激活。nhhA表示编码来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶的a亚单位的0RF。nhhB表示编码来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶的β亚单位的0RF。
具体实施例方式
下面更详细地说明本发明。本发明的腈水合酶是在具有腈水合酶活性的酶中引入突变而得到的，例如，在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中引入突变而得到。具体而言，其基本上可通过序列表的序列号I及2表示的氨基酸序列中至少I个或I个以上特定位点的氨基酸经其它氨基酸置换而构成。即，本发明包含以下腈水合酶:以序列表的序列号I中的205个氨基酸的序列所表示的α亚单位内至少I个或I个以上氨基酸被其它氨基酸置换而得到的序列为构成要素的腈水合酶、以序列表的序列号2中的233个氨基酸的序列所表示的β亚单位中至少I个或I个以上氨基酸被其它氨基酸置换而得到的序列为构成要素的腈水合酶、以及同时以上述两种序列为构成要素的腈水合酶。本发明中在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中引入突变而得到的腈水合酶中所使用的具体氨基酸序列中包括以下序列:(a-Ο)序列号I表示的α亚单位的氨基酸序列，(a-Ι)具有突变的氨基酸序列，即，序列号I表示的α亚单位的氨基酸序列中第36、71、148、204位氨基酸中的任一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。(a-2)具有突变的氨基酸序列，即，序列表中序列号I表示的α亚单位的氨基酸序列中第 6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203 位氨基酸中的任一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。(b-Ο)序列表中序列号2表示的β亚单位的氨基酸序列，(b-Ι)具有突变的氨基酸序列，即，序列表的序列号2表示的β亚单位的氨基酸序列中第 10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、217 位氨基酸中的任一个或一
个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。(b-2)具有突变的氨基酸序列，即，序列表的序列号2表示的β亚单位的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中任一个或一个以上氨基酸被置换为其它氨基酸。上述各突变至少能够维持突变前的腈水合酶的活性。本发明在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中引入突变而得到的腈水合酶由以下构成要素形成，所述构成要素具有选自上述(a-Ο) (b_2)的氨基酸序列。(A-1)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a-Ι)所述突变的氨基酸序列。(A-2)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突变的氨基酸序列。(B-1)腈水合酶的β亚单位具有包含上述(b-Ι)所述突变的氨基酸序列。(B-2)腈水合酶的β亚单位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。(A-3)腈水 合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有上述(b-Ο)所述氨基酸序列。(A-4)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-Ι)所述突变的氨基酸序列。(A-5)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-2)所述突变的氨基酸序列。(A-6)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。(A-7)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有上述(b-Ο)所述氨基酸序列。(A-8)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-Ι)所述突变的氨基酸序列。(A-9)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-2)所述突变的氨基酸序列。(A-10)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。(B-3)腈水合酶的α亚单位具有上述(a_0)所述氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-Ι)的突变的氨基酸序列。(B-4)腈水合酶的α亚单位具有上述(a_0)所述氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。(B-5)腈水合酶的α亚单位具有包含上述(a_2)所述突变的氨基酸序列、且β亚单位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。另外，对于上述确定的突变位点以外的氨基酸，只要在不损害经上述特定位点突变而得到的目标腈水合酶活性的范围内，也可以进行氨基酸的置换、插入、缺失处理。本发明在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中引入突变而得到的腈水合酶基因包括编码腈水合酶的α亚单位的基因和编码腈水合酶的β亚单位的基因。作为本发明所述基因的一族，可以举出在来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶基因中实施引入突变处理而得到的基因，其中包括编码α亚单位的氨基酸序列的基因、编码β亚单位的基因、以及同时含有编码α亚单位的基因和编码β亚单位的基因的腈水合酶基因。具体可以举出以下基因。(G-1)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码具有上述(a-Ι)所述突变的氨基酸序列。(G-2)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码具有上述(a-Ι)和(a_2)所述突变的氨基酸序列。(G-3)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码具有上述(b-Ι)所述突变的
氨基酸序列。(G-4)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码具有上述(b-Ι)和(b-2)所述突变的氨基酸序列。(G-5)具有下述碱基序列的基因，所述碱基序列编码上述(A-ι) (B-4)所述的任
一腈水合酶。编码作为上述 突变基础的序列号I所述的α亚单位的氨基酸序列的碱基序列优选为序列号3所述的碱基序列。编码作为上述突变基础的序列号2所述的β亚单位的氨基酸序列的碱基序列优选为序列号4所述的碱基序列。例如，以序列号3为基础时，上述(a-Ι)所述突变可通过将序列号3的碱基序列中的下述任何I个或I个以上碱基序列置换为其它碱基序列而得到:第106到第108位、从第211到第213位、从第442到第444位、及从第610到第612位。另外，以序列号3为基础时，上述(a-2)所述突变可通过将序列号3的碱基序列中的下述任何I个或I个以上碱基序列置换为其它碱基序列而得到:第16到第18位、从第55到第57位、从第112到第114位、从第229到第231位、从第268到第270位、从第304到第306位、从第316到第318位、从第376到第378位、从第388到第390位、从第424到第426位、从第436到第438位、从第559到第561位、从第580到第582位、从第607到第609 位。以序列号4为基础时，上述(b-Ι)所述突变可通过将序列号4的碱基序列中的下述任何I个或I个以上碱基序列置换为其它碱基序列而得到:第28到第30位、从第94到第96位、从第109到第111位、从第121到第123位、从第136到第138位、从第142到第144位、从第151到第153位、从第214到第216位、从第352到第354位、从第379到第381位、从第436到第438位、从第478到第480位、从第556到第558位、从第649到第651位。另外，以序列号4为基础时，上述(b-2)所述突变可通过将序列号4的碱基序列中的下述任何I个或I个以上碱基序列置换为其它碱基序列而得到:第58到第60位、从第61到第63位、从第322到第324位、从第598到第600位、以及从第634到第636位。上述置换在将腈水合酶的活性保持置换前的状态、或者较之有所提高的范围内进行，所述腈水合酶中具有由各基因编码的α及β亚单位中的至少其一。另外，引入突变的方式没有特别的限制。对于本发明的腈水合酶基因中(a-1)、(a-2)、(b_l)、及(b_2)所述突变位点之外的位点，在能够作为具有腈水合酶活性的蛋白质模型而发挥功能的范围内，也可具有经碱基的置换、插入、或缺失处理产生的附加突变。上述附加突变可以举出以下例子。即使在以具有某种特定的碱基序列的基因作为模板进行转录、翻译时，因其导入的宿主细胞的种类、或培养时使用的培养基的成分或组成、或培养时的温度、PH等因素的不同，在经基因表达后宿主细胞内酶的修饰后，在保留所期望的酶活性的情况下，仍可能出现以下的突变体，即在酶的序列表中N-末端附近的I个、2个或2个以上氨基酸发生缺失、或在N-末端插入I个、2个或2个以上氨基酸而得到的突变体。因此此类突变的腈水合酶也包含在本发明的范围之内。本发明的腈水合酶生产用质粒可以利用上述腈水合酶基因进行制备，可以举出以下具体例。(P-1)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码具有上述(a-Ι)所述突变的
氨基酸序列。(P-2)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码具有上述(a-Ι)和(a_2)所述突变的氨基酸序列。(P-3)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码具有上述(b-Ι)所述突变的
氨基酸序列。(P-4)具有下述 碱基序列的质粒，所述碱基序列编码具有上述(b-Ι)和(b_2)所述突变的氨基酸序列。(P-5)具有下述碱基序列的质粒，所述碱基序列编码上述(A-1) (B-4)中所述的
任一腈水合酶。本发明的转化子或细胞株是利用上述质粒转化任意宿主细胞而得到的。本发明的腈水合酶的生产方法包括培养上述转化子、细胞株以生产腈水合酶的步骤。另外，本发明的酰胺化合物的制备方法包括下述步骤:使培养用于生产上述腈水合酶的转化子、细胞株而得到的培养液、细胞或细胞处理物在溶媒中与腈化合物接触而制备对应的酰胺化合物。下面对本发明中具有腈水合酶活性的酶的修饰方法进行详细说明。本发明的腈水合酶活性是指将腈化合物水合成为对应的酰胺化合物的水合活性。一般而言，具有所述活性的酶的特征为，以称为α亚单位、β亚单位的2种多肽链作为构成要素，腈水合酶基因是指以形成上述两种多肽链为特征的两个氨基酸序列，或构成下述两个ORF (开放读码框)的碱基序列，所述ORF的特征为编码上述两个氨基酸序列。以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶(参照序列表的序列号98及99、专利文献3、非专利文献4、PDB号:1IRE)为例进行具体说明，由序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽及PDB号:1IRE记载的腈水合酶立体结构中的A链为α亚单位；由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽及PDB号:1IRE记载的腈水合酶立体结构中的B链为β亚单位。而由序列表的序列号100记载的碱基序列形成的ORF和由序列表的序列号101记载的喊基序列形成的ORF称为臆水合酶基因。另外，对于来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶(参照序列表中序列号104、专利文献2、非专利文献I)而言，由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704位到第1315位形成的ORF编码的氨基酸序列形成的多肽为α亚单位；由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第I位到第690位形成的ORF编码的氨基酸序列形成的多肽为β亚单位。另夕卜，序列表的序列号104记载的喊基序列编码的两个ORF称为臆水合酶基因。本发明的修饰方法是指，改变修饰前具有腈水合酶活性的酶的立体结构的方法，其目的为在不损害腈水合酶本来的活性的前提下，改变该酶的活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性中任何一种或一种以上的性质，该方法的特征为包括以下步骤:通过解析立体结构，确定形成下述孔穴的区域和/或形成下述界面的区域，并对与该区域中存在的氨基酸残基对应的氨基酸序列中的氨基酸中的任一或一个以上位点进行置换、插入、缺失等修饰；上述孔穴指底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴，上述界面为参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面；以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶(参照序列表的序列号98及99、专利文献3、非专利文献4、PDB号:1IRE)为例进行具体说明，与形成底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴的区域中存在的氨基酸残基对应的氨基酸残基可以举出，形成对应于PDB号IIRE记载的腈水合酶立体结构中的B链从N末端算起第I个螺旋、第2个螺旋、以及夹在其间的环状部分的区域的氨基酸残基；侧链前端重原子位于以下述4个氨基酸残基的侧链前端重原子为各自中心点的立体结构中半径5Λ的区域以内的氨基酸残基，上述4个氨基酸残基为，PDB号IIRE记载的腈水合酶立体结构中的从A链N末端算起第89位氨基酸残基的谷氨酰胺、第165位氨基酸残基的谷氨酸、以及从B链N末端算起第37位氨基酸残基的苯丙氨酸、第48位氨基酸的亮氨酸所对应的4个氨基酸残基；序列表的序列号98记载的氨基酸序列中从第36位的苏氨酸到第48位的天冬酰胺的区域、序列表的序列号99记载的氨基酸序列中从第31位的赖氨酸到第51位的苯丙氨酸的区域、以及从第112位的赖氨酸到第127位的亮氨酸的区域所对应的氨基酸残基；序列表的序列号99记载的氨基酸序 列中第37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127位所对应的氨基酸残基等。另外，作为存在于参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面的区域中的氨基酸残基所对应的氨基酸残基，可以举出对应于下述区域的氨基酸残基，所述区域为PDB号IIRE记载的腈水合酶立体结构中从A链N末端算起第2个螺旋、从B链N末端算起第2个螺旋、序列表的序列号98记载的氨基酸序列中从第36位的苏氨酸到第48位的天冬酰胺的区域、序列表的序列号99记载的从第112位的赖氨酸到第127位的亮氨酸的区域；以及与序列表的序列号98记载的氨基酸序列中第36、71、148、188、204位、与序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第10、32、33、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218 位对应的氨基酸残基等。在构成底物从酶外部进入活性中心、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴的形成区域的氨基酸残基中，对通过修饰可改变孔穴的大小从而控制底物/产物通过的难易程度的氨基酸残基加以确定的方法可以举出，确定PDB号IIRE记载的腈水合酶立体结构中从A链N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(A89Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(Α165Ε)对应的氨基酸残基，以及从B链N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)所对应的4个氨基酸残基，规定A165E和B48L之间的最短重原子间距为dl，A89Q和B48L之间的最短重原子间距为d2，B37F和B48L之间的最短重原子间距为d3，A165E和B37F之间的最短重原子间距为d4，A89Q和B37F之间的最短重原子间距为d5，确定使dl d5中的I项或I项以上发生变化的氨基酸残基，或确定使dl d3中的I项或I项以上发生变化的氨基酸残基。因此，由下述步骤构成的修饰方法也包含在本发明的范围之内，S卩，对于作为对象的腈水合酶(以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶为代表例)中与上述确定的任何一种或一种以上氨基酸残基对应的氨基酸序列中的氨基酸进行置换、插入、或缺失等修饰的步骤。另外，本发明也包含下述修饰方法，即，将来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095以外的生物种的腈水合酶(例如，来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶)与来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的立体结构、氨基酸序列进行对比，从而找出与上述氨基酸残基对应的氨基酸残基，并修饰对应的氨基酸序列中的氨基酸。实施上述例举的修饰方法时，在基于立体结构或氨基酸序列进行的对比中使用的装置没有特别的限制，作为氨基酸序列的对比装置可以举出日立Soft社制的DNASIS、Free-Soft的CLUSTALW或BLAST等基因序列分析软件；而作为基于氨基酸序列的对比结果的立体结构模拟装置可以举出Accelrys社制的Modeler或Homology等蛋白质立体结构预测软件。举一例而言，对于来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶(参照序列表的序列号104、专利文献2、非专利文献I)，对比的结果为，对应于序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第48位的氨基酸残基Leu的氨基酸残基为Trp，该Trp与由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第I个到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列中第48位对应；对应于序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第51位的氨基酸残基Phe的氨基酸残基为Ser，该Ser与由序列表的序 列号104记载的碱基序列中从第I个到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列中第51位对应。上述结果与基于氨基酸序列的对比和基于立体结构的对比结果相一致。本发明也包含改变上述两个氨基酸残基所对应的氨基酸序列的氨基酸中的任一方或双方的修饰方法。需要说明的是，在实施上述修饰方法时，用于改变氨基酸残基所对应的氨基酸序列中氨基酸的引入突变的方法没有特别的限制，可以举出利用基因重组技术将氨基酸序列中的氨基酸置换为其它氨基酸的突变弓I入法。另外，对于计划弓I入的突变之外的附加弓I入的突变所弓I起的氨基酸序列或碱基序列的变化而言，在不影响计划突变引入得到的目标腈水合酶的活性的范围内，也可发生氨基酸或碱基的置换、插入或缺失。上述附加导入的突变可以举例如下:即使使用特定碱基序列的基因作为模板进行转录、翻译时，根据导入其的宿主细胞的种类、培养时使用的培养基的成分或组成、培养时的温度、或PH等因素的不同，经基因表达后宿主细胞内酶的修饰等作用，在保留最初酶活性的情况下，仍可能出现以下突变体，即序列表中N-末端附近的氨基酸中的I个、2个或2个以上发生缺失、或N-末端中插入I个、2个或2个以上氨基酸。因此产生上述突变的腈水合酶修饰方法也包含在本发明的范围之内。
作为本发明修饰方法的对象的修饰前的腈水合酶，可以举出例如来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶和来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶。具体可以举出下述两种腈水合酶，其中一种为，以下述两个多肽链为构成要素的腈水合酶，所述的两个多肽链分别由与下述两个氨基酸序列相同的氨基酸序列形成，即由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第I个到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列和由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704个到第1315个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列；另一种腈水合酶以下述两个多肽链为构成要素，即，以由序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽链和由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽链为构成要素。作为本发明修饰方法的对象的修饰前的腈水合酶，也包括以下述两种多肽为构成要素的腈水合酶，所述两种多肽的其中一种为，与序列表的序列号98记载的氨基酸序列有40%或40%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，另一种为与序列表的序列号99记载的氨基酸序列有25%或25%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。作为与序列表的序列号98记载的氨基酸序列有40%或40%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，可以举出序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽、对序列表的序列号98记载的氨基酸序列中至少一个位点实施置换、插入或缺失的任一种修饰后得到的氨基酸序列形成的多肽、序列表的序列号98记载的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中至少一个氨基酸被其它氨基酸置换后得到的氨基酸序列形成的多肽、与序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704到第1315个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽等。另外，由与序列表的序列号98记载的氨基酸序列有40%或40%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽可以具有如下特征，即，其序列中含有X1CXLC1SC2X2X3X4X5 (其中，C表示半胱氨酸，X表示丝氨酸或苏氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亚磺酸(cysteine sulfinicacid、3_sulfinoalanine), S 表不丝氨酸，C2 表不半胱次横酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine), X1^ X2> X3> X4> X5表示任意氨基酸)结构的区域。除此之外，其还可以具有下述特征，即，上述区域中X1为缬氨酸，X4为色氨酸，X5为脯氨酸。另外，其也可以具有下述特征，即，上述区 域中X2为酪氨酸，X3为脯氨酸。在上述情况下，其特征也可以为通过X1CXLC1SC2X2X3X4X5结构的区域与金属原子结合。另外，其特征还可为所述金属为钴。作为由与序列表的序列号99记载的氨基酸序列有25%或25%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，可以举出由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽；由序列表的序列号99记载的氨基酸序列中至少一个位点经置换、插入或缺失的任一修饰后得到的氨基酸序列形成的多肽；由序列表的序列号99记载的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中至少一个氨基酸被其它氨基酸置换后得到的氨基酸序列形成的多肽；由与序列表的序列号104记载的碱基序列中从第I到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽等。举一例而言，来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶以下述多肽为构成要素，所述多肽为由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第704到第1315个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列形成的多肽和由序列表的序列号104记载的碱基序列中从第I到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列形成的多肽，因此，本发明中作为修饰方法的对象的修饰前的腈水合酶中包括上述腈水合酶。另外，来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶以由序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽和由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽为构成要素，因此，其也包含在本发明中作为修饰方法的对象的修改前的腈水合酶的范围内。另外，作为从来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶，可以举出满足下述两种条件中任一方或双方的腈水合酶。第一种条件为，在来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的构成要素中，由序列表的序列号98记载的氨基酸序列形成的多肽被下述两种多肽之一置换而得到的酶，所述两种多肽为，由对序列表的序列号98记载的氨基酸序列中至少一个位点实施置换、插入或缺失的任一修饰后得到的氨基酸序列形成的多肽，或者由序列表的序列号98记载的氨基酸序列的第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中至少一个氨基酸被置换为其它氨基酸而得到的氨基酸序列形成的多肽；第二种条件为，在来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的构成要素中，由序列表的序列号99记载的氨基酸序列形成的多肽被下述两种多肽之一置换而得到的酶，所述两种多肽为，由对序列表的序列号99记载的氨基酸序列中至少一个位点实施置换、插入或缺失的任一修饰后得到的氨基酸序列形成的多肽，或者由序列表的序列号99记载的氨基酸序列的第20、21、108、200、212位氨基酸中至少一个氨基酸被置换为其它氨基酸后的氨基酸序列形成的多肽。作为本发明修饰方法的对象的修改前的腈水合酶也包括由来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶。本发明中修饰酶是指，以具有腈水合酶活性的酶为对象进行修饰后得到的腈水合酶。例如可以举出具有如下特征的修饰酶，即，该修饰酶是采用上述修饰方法改变修饰前的腈水合酶的特性而得到的。与修饰前的腈水合酶相比较，作为特性的改变可以举出底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物(可以举 出例如以该酶作为催化剂时，能够转化为对应的酰胺化合物的任意腈化合物)稳定性、产物(可以举出例如以该酶作为催化剂时，转化任意腈化合物而得到的对应酰胺化合物)稳定性等性质中的任一种或一种以上性质发生的改变。具体可以举出以下8种改变等，I)相对而言，空间体积更大的腈化合物容易成为底物。2)相对而言，空间体积更小的腈化合物容易成为底物。3)以任意腈化合物作为底物时，Vmax增大。4)以任意腈化合物作为底物时，Km减小。5)将酶暴露于任意热量中时，其不可逆失活率降低。6)将酶暴露于任意浓度的底物中时，其不可逆失活率降低。7)因反应中存在任意浓度产物所引起的反应抑制率降低。8)将酶暴露于任意浓度的产物中时，其不可逆失活率降低。作为本发明中以修饰前的腈水合酶为对象的修饰方法所产生的特性改变的指标，可以以底物特异性的变化作为其代表例之一。当经本发明的修饰方法得到的修饰酶为改变了底物特异性的酶时，该修饰酶也包含在本发明的修饰酶的范围中。作为得到的修饰酶的底物特异性变化的观察方法，可以举出如下方法:以空间体积不同的多种腈化合物作为底物进行反应，测定生成的对应酰胺化合物的量的差异。例如，比较以丙烯腈为底物反应生成的丙烯酰胺与以甲基丙烯腈为底物反应生成的甲基丙烯酰胺的摩尔比的方法。此时，与修饰前的对象相比较，可以认为[生成的甲基丙烯酰胺的摩尔量]+[生成的丙烯酰胺的摩尔量]的值向增大的方向变化的修饰酶表现出使空间体积更大的腈化合物容易成为底物的特性变化；上述值向减小的方向变化的修饰酶表现出使空间体积更小的腈化合物容易成为底物的特性变化。以来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶、以及从来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶为对象的例子中，实施包括下述步骤的修饰方法时，与修饰前的对象比较，得到了以丙烯腈为底物反应生成的丙烯酰胺与以甲基丙烯腈为底物反应生成的甲基丙烯酰胺的摩尔比发生变化的修饰酶，该步骤为:通过解析立体结构，确定形成下述孔穴的区域和/或形成下述界面的区域，所述孔穴是底物从酶外部进入活性中心时、或产物从活性中心移至酶外部时通过的孔穴，所述界面为参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面；并对与所述区域中存在的氨基酸残基对应的氨基酸序列中的氨基酸的任一或一个以上位点进行置换、插入、缺失等修饰的步骤。上述性质可称为底物特异性，即，特性改变的产物，因此得到的修饰酶包含在本发明的修饰酶范围内。在以来源于紫红红球菌J-1株的腈水合酶为对象的例子中，序列表的序列号104记载的碱基序列中从第I个到第690个碱基形成的ORF所编码的氨基酸序列的第48位所对应的氨基酸残基Trp被变更为其它氨基酸残基，采用上述修饰方法时，与修饰前的对象相比较，显示出空间体积更大的腈化合物易作为底物的特性变化。因此，获得的表现出特性改变的蛋白质也包含在本发明的修饰酶范围内。另外，容易推测，通过组合得到的修饰酶的突变位点，可获得附加的特性改变。因此，上述经突变位点组合而得到的修饰酶也包含在本发明的修饰酶范围之内。本发明中编码修饰酶的基因是指，以形成构成修饰酶的2种多肽链为特征的2个氨基酸序列，或形成以 编码上述2个氨基酸序列为特征的2个ORF的碱基序列。本发明中以含有基因为特征的质粒是指具有下述特征的质粒，S卩，该质粒的序列中含有形成下述2个ORF的碱基序列，所述2个ORF的特征为编码下述2个氨基酸序列，而所述2个氨基酸序列的特征为形成构成修饰酶的2种多肽链。上述质粒除本发明的基因之外，还可具有能够通过转化任意宿主细胞得到的转化子或细胞株生产修饰酶的所需的结构，如各基因表达中必需的控制区域及自我复制的必需区域等。此处所谓任意的宿主细胞，例如为下述实施例中举出的大肠杆菌，但并不限定于此，也可以使用枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属菌、酵母菌或链霉菌属等其它微生物。作为表达中必需的控制区域，可以举出启动子序列(含有控制转录的操纵基因序列)、核糖体结合序列(SD序列)、转录终止序列等。具体的启动子序列，可以举出来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子的Trp启动子、乳糖操纵子的Lac启动子、来源于λ噬菌体的PL启动子和PR启动子；以及来源于枯草芽胞杆菌的葡糖醒酸合成酶启动子(gnt)、碱性蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)和α-淀粉酶启动子(amy)等。另外也可以利用人为设计、改良的序列,如tac启动子或trc启动子。
作为核糖体结合序列可以举出来源于大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的序列或红球菌属/假诺卡氏菌属固有的序列，只要是能在诸如大肠杆菌或枯草芽胞杆菌等所希望的宿主细胞中起作用的序列即可，没有特别的限制。例如，可以利用由DNA合成制备的下述共有序列，所述共有序列由4个或4个以上连续碱基组成，并可与16S核糖体RNA的3’-末端区互补。转录终止序列不是必须的，然而，可以利用P-因子非依赖性序列，例如，脂蛋白终止子或trp操纵子终止子等。上述控制区域在质粒上的序列顺序优选为，启动子序列和核糖体结合序列位于靠近5’ -末端侧本发明基因的上游位置，转录终止序列位于靠近3’ -末端侧本发明基因的下游的位置。编码构成本发明基因的各种ORF的碱基序列可以通过上述控制区域以各自独立的顺反子形式进行表达，也可以通过共同的控制区域以多顺反子形式进行表达。作为满足上述要求的质粒载体实例，可以举出在大肠杆菌中具有可自我复制的区域的pBR322、pUC18、pBluescript、pKK223_3、pSClOl ;在枯草芽胞杆菌中具有可自我复制的区域的pUB110、pTZ4、pC194、P 11、Φ1、Φ 105等。另外，作为可在2种或2种以上宿主细胞中进行自我复制的质粒载休实例可以举出，PHV14、TRp7、YEp7和pBS7。本发明中表达基因以生产具有所期望的活性的腈水合酶时，有时需要参与腈水合酶激活的蛋白质。参与腈水合酶激活的蛋白质是具有下述性质的蛋白质，S卩，所述蛋白质表达与否直接影响腈水合酶的激活，可以举出专利文献4中记载的参与来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶激活的蛋白质(腈水合酶激活蛋白质)。具体而言，作为腈水合酶激活蛋白质可以举出由序列号102的氨基酸序列所表示的144个氨基酸的序列构成的蛋白质。另外，将序列号102的氨基酸序列的一部分氨基酸置换、插入或缺失等得到的突变蛋白质只要参与腈水合酶的激活，则也 包含在腈水合酶激活蛋白质的范畴内。作为上述突变蛋白质，可以举出具有对序列号102的氨基酸序列中一个或一个以上氨基酸进行置换、插入或缺失等处理而得到的突变并保持参与腈水合酶激活的性质的蛋白质。作为编码腈水合酶激活蛋白质的基因，只要是编码腈水合酶激活蛋白质的基因即可，并无特别的限制。作为上述基因，可以举出具有编码上述序列号102的氨基酸序列的碱基序列的基因、及编码上述突变蛋白质的基因。另外，作为编码上述腈水合酶激活蛋白质的基因的优选例，可以举出具有序列号103的碱基序列的基因。编码腈水合酶激活蛋白质的基因中，即使是对序列号103记载的碱基序列中的I个、2个或2个以上碱基进行置换、插入、缺失而得到的序列，只要其能够作为编码腈水合酶激活蛋白质的基因而发挥作用，则也包含在编码腈水合酶激活蛋白质的基因的范围之内。在使用编码腈水合酶激活蛋白质的基因时，可以举出例如将其ORF与本发明中形成基因的2个ORF共同包含在本发明的质粒中。此时，上述ORF在质粒上的顺序没有特别的限制，另外，可以是3个ORF被同一个控制区域控制；也可以是2个ORF被同一个控制区域控制、而剩余I个ORF被不同于前2个ORF的控制区域的控制区域控制；还可以是3个ORF各自被不同的控制区域控制。如上所述，将本发明的基因与本发明中修饰酶的活性表达所必需的区域一同插入上述质粒载体中，从而构建本发明的质粒的方法、或利用所述质粒将所希望的宿主细胞转化的方法、以及在上述转化子内生产腈水合酶的方法，可以利用例如“《分子克隆第三版》(J.Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) ”等记载的分子生物学、生物工程学和基因工程学领域中公知的普通方法和宿主细胞。本发明中以通过转化而获得为特征的转化子中，包含利用本发明的基因或质粒转化宿主细胞而得到的转化子。作为培养所述转化子的例子，可以举出以下述步骤特征的方法:将其接种到培养基中之后，在适当的培养温度(一般而言为20°C 50°C )下进行培养。需要说明的是，当宿主细胞为微生物时，一般使用LB培养基或M9培养基等作为培养上述转化子的培养基，但也可以在上述培养基成分中添加金属离子。作为添加的金属离子可以举出Fe离子及Co离子。添加量例如为0.1 μ g/mL或0.1 μ g/mL以上。本发明中修饰酶的制备方法以下述步骤为特征:从培养转化子得到的培养液、细胞、或其处理物中回收修饰酶，可以举出具有如下特征的方法，即，该方法包含从上述转化子、所述转化子的培养液、或者所述转化子或培养液的处理物中回收活性腈水合酶的步骤。本发明中以包含将腈化合物转化为对应酰胺化合物的步骤为特征的酰胺化合物制备方法，可以举出以含有下述转化步骤为特征的方法，所述步骤为使用上述转化子、所述转化子的培养液、或所述转化子或所述培养液的处理物、或经上述制备方法回收的活性腈水合酶作为催化剂，从而将腈化合物转化为对应的酰胺化合物的步骤。本发明中作为利用修饰酶或具有该酶活性的转化子从腈化合物制备对应的酰胺化合物的例子，可以举出包含下述步骤的方法，即，将所希望的腈化合物与所述酶的精制物或酶的粗产物、本发明中转化子的培养液、从培养液得到的转化子、或者转化子的处理物在溶剂中接触的步骤。此处所谓处理物包括从所述转化子得到的提取物、粉碎物；分离上述提取物或粉碎物中腈水合酶活性成分而得到的酶粗产物；进一步精制而得到的酶精制物等后分离物；以及将所述转化子或所述转化子的提取物、粉碎物或后分离物用适当的方法固定化而得到的固定化物 。接触温度没有特别的限制，优选在所述腈水合酶不失活的温度范围内，更优选为凝固点或凝固点以上,60 °C或60 °C以下。作为腈化合物，只要是能够作为本发明的改良酶的底物发挥作用的化合物即可，可以举出碳原子为2 4的腈化合物，例如，乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、异丁腈、丁烯腈和α-羟基异丁腈等。所述腈化合物在溶剂中的浓度没有特别的限定，另外，反应温度也无特别的限定，但优选在所述腈水合酶不失活的温度范围内，更优选为凝固点或凝固点以上，50°C或50°C以下。下面通过实施例对本发明进行更加详细地说明，但本发明并不受到下述实施例的任何限定。应予说明，各实施例及比较例中的HPLC分析使用日本分光制的FiMpak SIL018-5(250Χ4.6Φ )作为色谱柱，并以含有4体积％乙腈的IOmM磷酸水溶液为流动相。利用210nm处的吸光度检测丙烯酰胺、丙烯腈、丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯腈、甲基丙烯酸。[参考例I]保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的获得(I)为了将α亚单位中的第6位的Leu置换为Met，使用宝酒造社制的“LA PCR invitro mutagenesis Kit” 引入位点特异性突变。下文中 “LA PCR in vitro mutagenesisKit”简称为试剂盒。在以下参考例中基本按照试剂盒的原理和操作方法来进行。在30ml试管中装入IOml的LB液体培养基，并通过高压灭菌锅进行121°C、20分钟的灭菌处理。向上述培养基中加入氨苄青霉素使其最终浓度为100 μ g/ml后，使用钼金接菌环将MT-10822接种在培养基上，并在37°C、300rpm下培养约20小时。取出Iml上述培养液放入适合的离心管中，离心分离(15000rpmX5分钟)出该菌体。接着，利用碱性SDS提取法由该菌体制备质粒pPT-DBl。分别以IOng的pPT-DBl为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应N0.1通过下述步骤完成:在分别含有50pmol序列表的序列号7记载的引物和M13引物M4(序列表的序列号8中记载有其序列)的总计50 μ I的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，将下述反应重复进行25次循环，所述反应为，热变性(98°C)15秒、退火(55°C)30秒、链延长反应(72°C ) 120秒。PCR反应N0.2通过下述步骤完成:在分别含有50pmol MUT4引物(序列表的序列号9中记载有其序列)和M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)的总计50 μ I的反应系统(组成遵照试剂盒中记载的条件)中，进行与PCR反应N0.1同样的操作。取PCR反应N0.1及N0.2的最终反应液各5 μ I进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖的浓度为1.0重量％ )以分析DNA扩增产物时，可以确认存在扩增DNA产物。使用Microcon100 (宝酒造社制)从各PCR最终反应液中除去过量的引物和dNTP后，加入TE分别配制成50 μ I的溶液。配制总计47.5 μ I的分别含0.5 μ I上述TE溶液的退火溶液(组成遵照试剂盒中记载的条件)，实施10分钟热变性处理(98°C )后，经60分钟以恒定的速度冷却至37°C，接着在37°C下保持15分钟进行退火处理。将0.5 μ I TaKaRa LA Taq加入至退火处理液中，并在72 °C下加热处理3分钟，由此形成了异源双链。使其进行PCR反应N0.3，S卩，向其中加入M13引物M4 (序列表的序列号8中记载有其序列)及M13引物RV(序列表的序列号10中记载有其序列)各50pmol，使总量达到50μ I后，将下述反应重复25次循环，所述反应为，热变性(98°C ) 15秒、退火(55°C )30秒、链延长反应(72°C ) 120秒。取5μ I PCR反应N0.3的最终反应液进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.8重量％ )以分析DNA扩增产物时，可以确认存在约2kbp的扩增DNA产物。接着从琼脂糖凝胶中仅切出约2kbp的DNA片段，将该琼脂糖片(约0.1g)微细地粉碎并混悬在Iml的TE溶液中，在55°C下保温I小时使琼脂糖完全熔化。对所得熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段。最后，将该片段溶于10μ1的TE中。用限制性核酸内切酶EcoRI及HindIII切割上述纯化后的约2kbp的扩增DNA片段，然后对该限制性核酸内切酶处理液 进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化所述DNA片段，最终使其溶于10 μ I的TE中。同样用EcoRI及HindIII切割pPT-DBl后，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma社制VII型低熔点的琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.7% )，仅将约2.7kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将切下的琼脂糖凝胶(约0.1g)微细地粉碎并混悬在Iml TE溶液中，将其在55°C下保温I小时使琼脂糖完全熔化。对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，从而纯化该DNA片段，使该片段最终溶于10 μ I的TE中。用DNAligation试剂盒(宝酒造社制)将上述得到的约2kbp及约2.7kbp的DNA片段进行连接后，转化大肠杆菌HB 101感受态细胞(东洋纺绩社制)，得到转化子N0.1。利用下述方法求出用得到的转化子制备酰胺化合物时的转化率和选择率。在500ml装有挡板的三角烧瓶中配制含有40 μ g/ml硫酸铁.七水合物和10 μ g/ml氯化钴.二水合物的LB液体培养基100ml，并通过高压灭菌锅进行121°C、20分钟的高压灭菌处理。向该培养基中加入氨苄青霉素使其最终浓度为100 μ g/ml。然后使用钼金接菌环将转化子N0.1接种在培养基上，并在37°C、130rpm下培养约20小时。通过离心分离(5000GX15分钟)从该最终培养液中分离出菌体，接着将上述分离后的菌体重悬在50ml的生理盐水中，并再次离心分离(5000GX15分钟)出菌体。将0.1g该菌体混悬在20ml、50mM的磷酸钾水溶液(PH7.0)中，向其中加入Iml丙烯腈或甲基丙烯腈，并在10°C下边缓慢地搅拌边使其反应I小时。反应结束后，用HPLC分析反应液，结果确认了在反应液中仅存在与反应液中添加的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)相当摩尔量的酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)，而不存在腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)及对应的有机酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。即，转化率和选择率都是100 %。然后，利用碱性SDS提取法从上述菌体制备质粒。接着使用ABI社制的测序试剂盒和核酸自动测序仪373A的双脱氧链终止法测定了腈水合酶基因部分的碱基序列。结果为，表I所示的克隆中腈水合酶的α亚单位中第6位的Leu被置换为Met。表1-1-1-1 *、
克隆号突变位点氨基酸序列的改变碱基序列的改变
(α亚单位内内)置换前置换后置换前置换后
权利要求
1.一种腈水合酶突变体，是具有由序列表I的序列号I的氨基酸序列构成的α亚单位及由序列表I的序列号2的氨基酸序列构成的β亚单位的腈水合酶的至少一个以上的氨基酸置换为其它氨基酸而得到的腈水合酶突变体，其中 所述腈水合酶具有形成参与2聚体形成的α亚单位和β亚单位之间的结合界面、或参与2聚体之间结合的界面的区域， 所述腈水合酶突变体包含下述突变，所述突变是选自由位于所述腈水合酶中所述结合界面或形成所述界面的区域中的、所述序列号I的氨基酸序列的第71、148、188及204位的氨基酸及所述序列 号2的氨基酸序列的第10、146、150、160、168、171、176、186、217及218位氨基酸构成的组中的任一氨基酸置换为下述(i) (XV)所示的其它氨基酸而得到的突变， (i)所述序列号I的氨基酸序列的第71位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为His， ( )所述序列号I的氨基酸序列的第148位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Asp， (iii)所述序列号I的氨基酸序列的第188位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Gly, (iv)所述序列号I的氨基酸序列的第204位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Arg、Lys > Trp 或 Thr, (V)所述序列号2的氨基酸序列的第10位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Asp、Glu、Trp> Gly、Tyr 或 Cys, (vi)所述序列号2的氨基酸序列的第146位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Gly， (vii)所述序列号2的氨基酸序列的第150位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Ser或 Asn, (viii)所述序列号2的氨基酸序列的第160位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Leu > Trp > Met 或 Cys, (ix)所述序列号2的氨基酸序列的第168位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Glu， (X)所述序列号2的氨基酸序列的第171位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Ala， (xi)所述序列号2的氨基酸序列的第176位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Ala、Met、Cys 或 Thr, (xii)所述序列号2的氨基酸序列的第186位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Glu、Asp、Lys、Arg、Asn、Ser 或 Gly, (xiii)所述序列号2的氨基酸序列的第217位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Gly、Val、Leu、Met、Cys> Ser> Thr 或 His, (xiv)所述序列号2的氨基酸序列的第218位氨基酸置换为其它氨基酸时，置换为Met或 Ser0
2.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于， 当包含所述(ii)及(iv)的突变时，包含所述序列号I的氨基酸序列第148位和第204位的氨基酸分别置换为Asp和Arg的所述α亚单位,或者 当包含所述(viii)及(xii)的突变时，包含所述序列号2的氨基酸序列第160位和第186位的氨基酸分别置换为Trp和Arg的所述β亚单位。
3.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于，当包含所述(i)的突变时，所述序列号I的氨基酸序列第71位氨基酸置换为His的所述α亚单位进一步包含在第19位和第126位氨基酸处分别成为Val和Tyr的置换,或者 当包含所述(ii)及(iv)的突变时，所述序列号I的氨基酸序列第148位和第204位氨基酸分别置换为Asp和Arg的所述α亚单位进一步包含在第36位氨基酸处成为Met的置换。
4.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于， 当包含所述(V)的突变时，所述序列号2的氨基酸序列第10位氨基酸置换为Asp的所述α亚单位进一步包含在第118位和第200位氨基酸处分别成为Val和Glu的置换,或者 当包含所述(vii)及(xii)的突变时，所述序列号2的氨基酸序列第160位和第186位氨基酸分别置换为Trp和Arg的所述β亚单位进一步包含在第127位氨基酸处成为Ser的置换。
5.如权利要求1所述的腈水合酶突变体，其特征在于: 当包含所述(V)时，所述突变体具有:包含在所述序列号I的氨基酸序列第6、36及126位氨基酸处分别成为Thr、Met和Tyr的置换的所述α亚单位，及包含在所述序列号2的氨基酸序列第10、118及200位氨基酸处分别成为Asp、Val和Glu的置换的所述β亚单位，或者 当包含所述(ii)及(iv)的突变时，所述突变体具有:包含在所述序列号I的氨基酸序列第36、148及204位氨基酸处分别成为Met、Asp和Arg的置换的所述α亚单位，且包含在所述β亚单位的序列号2的氨基酸序列第41、51及108位氨基酸处分别成为lie、Val和Asp的置换的所述β亚单位，或者 当包含所述(ii)及(iv)的突变时，所述突变体具有:包含在所述序列号I的氨基酸序列第148及204位氨基酸处分别成为Asp和Arg的置换的所述α亚单位，且包含在所述β亚单位的序列号2的氨基酸序列第108及200位氨基酸处分别成为Asp和Glu的置换的所述β亚单位。
6.如权利要求1所述的腈水合酶突变体， 当包含所述(viii)及(xii)的突变时，包含在所述ct亚单位的所述序列号I的氨基酸序列第6、19和126位氨基酸处分别成为Ala、Val和Tyr的置换，且包含在所述β亚单位的所述序列号2的氨基酸序列第127、160和186位氨基酸处分别成为Ser、Trp和Arg的置换，或者 当包含所述(i)的突变时，包含在所述α亚单位的所述序列号I的氨基酸序列第19、71和126位氨基酸处分别成为Val、His和Tyr的置换，且包含在所述β亚单位的所述序列号2的氨基酸序列第37、108和200位氨基酸处分别成为LeiuAsp和Glu的置换，或者 当包含所述(i)的突变时，包含在所述α亚单位的所述序列号I的氨基酸序列第19、71和126位氨基酸处分别成为Val、His和Tyr的置换，且包含在所述β亚单位的所述序列号2的氨基酸序列第37、108和200位氨基酸处分别成为Val、Asp和Glu的置换。
7.一种编码腈水合酶的基因，具有编码腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列的基因与编码腈水合酶的β亚单位的氨基酸序列的基因，其特征在于，编码如权利要求1或2所述的腈水合酶突变体。
8.如权利要求7所述的基因， 其特征在于，编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含下述置换的碱基序列: 序列表的序列号3的碱基序列中第211至213位碱基处成为CAT的置换，或 第442至444位成为GAC的置换,或 第562至564位成为GGC的置换，或 第610至612位成为CGC、AAA、TGG或ACC的置换，或 编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含下述置换的碱基序列: 序列表的序列号4的碱基序列中第28至第30位碱基处成为GAC、GAA、TGG、GGC、TAC或TGC的置换，或 第436至438位成为GGG的置换，或 第448至450位碱基处成为TCG或AAT的置换，或 第478至480位碱基处成为CTG、TGG、ATG或TGT的置换，或 第502至504位碱基处成为GAG的置换，或 第511至513位碱基处成为GCG的置换，或 第526至528位碱基处成为GCC、ATG、TGC或ACC的置换，或 第556至558位碱基处成为GAG、GAT、AAG、CGG, AAC, TCG或GGG的置换，或 第649至651位碱基处成为GGC、GTC、CTC、ATG、TGT、AGC、ACC或CAC的置换，或 第652至654位碱 基处成为ATG或TCC的置换。
9.如权利要求7所述的基因，其特征在于， 编码所述α亚单位的氣基酸序列的基因具有包含下述置换的喊基序列:序列表的序列号3的碱基序列中第442至444位和第610至612位碱基处分别成为GAC和CGC的置换，或者 编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含下述置换的碱基序列:序列表的序列号4的碱基序列中第478至480位和第556至558位碱基处分别成为TGG和CGG的置换。
10.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码权利要求3所述的腈水合酶突变体。
11.如权利要求8所述的基因，其特征在于， 具有所述序列号3的喊基序列中第211至213位喊基处置换为CAT的喊基序列的编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有进一步包含第55至57位和第376至378位碱基处成为GTG和TAC的置换的碱基序列，或者 具有所述序列号3的碱基序列中第442至444位碱基和第610至612位碱基处分别置换为GAC和CGC的喊基序列的编码所述α亚单位的氣基酸序列的基因具有进一步包含第106至108位碱基处分别成为ATG的置换的碱基序列。
12.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码权利要求4所述的腈水合酶突变体。
13.如权利要求8所述的基因，其特征在于， 具有所述序列号4的喊基序列中第28至30位喊基处置换为GAC的喊基序列的编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有进一步包含第352至354位和第598至600位碱基处成为GTC和GAA的置换的碱基序列，或者 具有所述序列号4的碱基序列中第478至480位碱基和第556至558位碱基处分别置换为TGG和CGG的碱基序列的编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有进一步包含第379至381位碱基处分别成为TCG的置换的碱基序列。
14.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码权利要求5所述的腈水合酶突变体。
15.如权利要求8所述的基因，其特征在于， 编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第16至18位、及第106至108位、及第376至378位碱基处分别成为ACG、ATG和TAC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第28至30位、第352至354位、及第598至600位碱基处分别成为GAC、GTC和GAA的置换的碱基序列，或者 编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第106至108位、第442至444位及第610至612位碱基处分别成为ATG、GAC和CGC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第121至123位、第151至153位、及第322至324位碱基处分别成为ATC、GTC和GAT的置换的碱基序列，或者 编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第442至444位及第610至612位碱基处分别成为GAC和CGC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第322至324位、及第598至600位碱基处分别成为GAT和GAA的置换的碱基序列。
16.如权利要求7所述的基因，其特征在于，编码权利要求6所述的腈水合酶突变体。
17.如权利要求8所述的基因，其特征在于， 编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第16至18位、第55至57位、及第376至378位碱基处分别成为GCG、GTG和TAC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第379至381位、第478至480位、及`第556至558位碱基处分别成为TCG、TGG和CGG的置换的喊基序列，或者 编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第55至57位、第211至213位及第376至378位碱基处分别成为GTG、CAT和TAC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第109至111位、第322至324位、及第598至600位碱基处分别成为CTC、GAT和GAC的置换的喊基序列，或者 编码所述α亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号3的碱基序列中第55至57位、第211至213位及第376至378位碱基处分别成为GTG、CAT和TAC的置换的碱基序列，且编码所述β亚单位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列号4的碱基序列中第109至111位、第322至324位、及第598至600位碱基处分别成为GTC、GAT和GAA的置换的碱基序列。
18.一种质粒,其特征在于,含有编码如权利要求7 17中任一项所述的腈水合酶突变体的基因。
19.如权利要求18所述的质粒，其特征为，该质粒具有在宿主细胞内表达所述腈水合酶突变体所需的结构。
20.一种转化子，是利用权利要求19所述的质粒转化宿主细胞而得到的转化子。
21.—种生产腈水合酶的方法，其特征在于含有下述步骤，即，将权利要求20所述的转化子在培养基中培养，基于所述转化子中所述质粒具有的腈水合酶基因生产腈水合酶的步骤。
22.如权利要求21所述的生产方法，其特征为，该方法进一步含有从所述培养后的转化子、培养液、及其处理物中回收腈水合酶的步骤。
23.一种制备酰胺化合物的方法，是通过在水性介质中使腈化合物与腈水合酶接触而得到对应的酰胺化合物的制备方法，其特征为，所述腈水合酶为如权利要求1 6中任一项所述的腈水合酶突变体 。
全文摘要
本发明的目的为提供一种具有新型突变位点的腈水合酶的氨基酸序列及其基因的碱基序列，另外本发明的目的还在于提供一种对具有腈水合酶活性的酶进行修饰的方法。作为解决目前问题的方法，提供了在来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095、由2种异源亚单位构成的腈水合酶中引入新型突变而得到的突变体的氨基酸序列及其基因的碱基序列。而且，通过确定腈水合酶的立体结构/氨基酸序列中作为修饰对象的区域，并对与形成所述区域的氨基酸残基对应的氨基酸序列中的氨基酸进行置换、插入、缺失等改变从而修饰腈水合酶。通过本发明，能够比现有技术更高效率地将腈化合物转化为对应的酰胺化合物。
文档编号C12N15/09GK103103175SQ20121057427
公开日2013年5月15日 申请日期2003年12月15日 优先权日2002年12月19日
发明者八卷俊文, 番场伸一, 的石香, 伊藤洁, 小林英树, 田中英司, 及川利洋 申请人:三井化学株式会社