改良型腈水合酶的制作方法
【专利摘要】通过野生型腈水合酶的改良，提供耐热性、酰胺化合物耐性以及高温累积性进一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白质。使用一种蛋白质，其为以下的(A)或(B)的蛋白质；(A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中特定的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；(B)蛋白质，其特征在于，包含在上述(A)的蛋白质的氨基酸序列中除了上述特定的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。
【专利说明】改良型腈水合酶
【技术领域】[0001]本发明涉及改良型(变异型)的腈水合酶及其制造方法。进而涉及编码该酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、和具有该重组载体的转化体以及酰胺化合物的制造方法。
【背景技术】
[0002]近年发现了酶腈水合酶、即具有将腈基水合并转换为酰胺基的腈水合活性的酶，公开了使用该酶或含有该酶的微生物菌体等通过腈化合物而制造对应的酰胺化合物的方法。已知该制造方法与现有的化学合成法相比较，由腈化合物向对应的酰胺化合物的转化率和选择率高。
[0003]作为生产腈水合酶的微生物，可列举出例如:属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) Jl株用于丙烯酰胺的工业生产中，其有用性已被证实。另外，编码该菌株所产生的腈水合酶的基因也已明确(参照专利文献I)。
[0004]另一方面，不仅利用由自然界中存在的微生物分离的腈水合酶、其基因，还出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、对底物的稳定性、对生成物的稳定性等目的，尝试了向腈水合酶中导入变异(参照专利文献2)，本发明人等取得了使耐热性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(参照专利文献3和4)。
[0005]但是，从催化剂成本等生产成本的观点出发，开发耐热性和酰胺化合物耐性更进一步提高、或在高温下能够反应的腈水合酶并用于酰胺化合物的制造是非常有用的；从反应时的酶量的削减和成本削减等观点出发，期望开发而获得具有这样的性能的酶。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本专利第3162091号公报
[0009]专利文献2:国际公开第2004/056990号小册子
[0010]专利文献3:国际公开第2005/116206号小册子
[0011]专利文献4:日本特开2007-143409号公报
【发明内容】
[0012]发明要解决的问题
[0013]因此，本发明的目的在于通过腈水合酶的改良，提供耐热性、酰胺化合物耐性以及高温累积性进一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白质。另外，本发明的目的在于提供编码该蛋白质的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。进而，本发明的目的在于提供使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。[0014]用于解决问题的方案
[0015]本发明人等为了解决上述问题进行了深入的研究。结果发现，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中将特定的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基而成的蛋白质不仅具有腈水合酶活性，耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性也提高了，至此完成本发明。
[0016]即，本发明如下。
[0017](I)以下(A)或⑶的蛋白质；
[0018](A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、
(C)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基、进而选自由下述(f)~(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；
[0019](a) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基、
[0020](b) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基、
[0021](c) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基、
[0022](d) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基、
[0023](e) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基、
[0024](f) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基、
[0025](g) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基、
[0026](h) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基、
[0027](?) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数144残基下游的氨基酸残基、
[0028](j) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数133残基下游的氨基酸残基、
[0029](k) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数112残基下游的氨基酸残基、
[0030](I) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数105残基下游的氨基酸残基、
[0031](m) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数95残基下游的氨基酸残基、
[0032](η) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数17残基下游的氨基酸残基、
[0033](ο) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数15残基下游的氨基酸残基、
[0034](p) α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起67残基下游的氨基酸残基、
[0035](q) α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起17残基下游的氨基酸残基、
[0036](B)蛋白质，其特征在于，包含在(A)蛋白质的氨基酸序列中除了前述置换后的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有I个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。
[0037](2) 一种DNA，其编码(I)所述的蛋白质。
[0038](3) 一种重组载体，其包含(2)所述的基因DNA。[0039](4) 一种转化体，其包含(3)所述的重组载体。
[0040](5) 一种腈水合酶，是从培养⑷所述的转化体而得到的培养物中提取的。
[0041](6) 一种腈水合酶的制造方法，其特征在于，培养⑷所述的转化体，从得到的培养物中提取腈水合酶。
[0042](7) 一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使⑴所述的蛋白质或培养⑷所述的转化体而得到的培养物或该培养物的处理物与腈化合物接触。
[0043]发明的效果
[0044]本发明能够提供耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性提高了的新型的改良型(变异型)腈水合酶。耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性均进一步提高了的该改良型腈水合酶由于酰胺化合物的制造效率变高而非常有用。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1为质粒pER855A的结构图。
[0046]图2-1为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列的图。
[0047]图2-2为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列的图(接着图2-1)。
[0048]图3-1为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列的图。
[0049]图3-2为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列的图(接着图3-1)。
【具体实施方式】
[0050]以下，详细地说明本发明。
[0051]需要说明的是，本说明书中，除了特别表明的情况，“上游”和“上游侧”在涉及氨基酸序列时意味着“N末端侧”，在涉及碱基序列时意味着“5’末端侧”。
[0052]另外，“下游”和“下游侧”涉及氨基酸序列时意味着“C末端侧”，涉及碱基序列时意味着“3”。
[0053]1.改良型腈水合酶
[0054](a)野生型腈水合酶
[0055]本发明的改良型腈水合酶为野生型腈水合酶的改良型，对于其来源没有特别地限定。此处，“野生型腈水合酶”是指由自然界的生物(例如:土壤细菌等微生物)分离而得到的腈水合酶；意味着构成该酶的氨基酸序列、以及编码该酶的基因的碱基序列没有人为地缺失或插入，或者没有被其他的氨基酸或碱基置换而保持天然来源特性的状态的腈水合酶。
[0056]另外，不仅是已知的微生物来源的腈水合酶，只由未限定生物来源的DNA序列限定的腈水合酶也包含于上述“野生型腈水合酶”中。
[0057]“野生型腈水合酶”采取由α亚基和β亚基的结构域缔合而成的高级结构，具有非血红素铁原子或非咕啉核钴原子作为辅基。这些腈水合酶分别以铁型腈水合酶和钴型腈水合酶的称呼加以区分。
[0058]作为铁型腈水合酶，可列举出来源于红球菌属Ν-771株的腈水合酶作为其代表例。通过进行X射线结晶结构解析，该铁型腈水合酶的立体结构变得明确。结果，该酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(:序列号61)中的4个氨基酸残基而与非血红素铁
结合 ?
[0059]作为钴型腈水合酶，可列举出来源于玫瑰色红球菌Jl株(以下有时称为“ Jl菌”)的钴型腈水合酶，或来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的钴型腈水合酶作为代表例。来源于Jl菌的钴型腈水合酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(:序列号62)所示的区域而与钴原子结合。需要说明的是，来源于嗜热假诺卡氏菌的钴型腈水合酶的半胱氨酸簇中，上述来源于Jl菌的半胱氨酸簇中的上游侧(N末端侧)起第4位的半胱氨酸(Cys)为半胱亚磺酸(Csi),最下游侧(C末端侧)的第6位的半胱氨酸(Cys)为半胱次磺酸(Cse)。
[0060]如上所述，辅基与α亚基中的半胱氨酸簇“C(S/T)LCSC”(序列号61和62)所示的区域结合。作为包含这样的辅基结合区域的腈水合酶，可列举出例如:具有来源于玫瑰色红球菌 Jl (FERM BP-1478)、玫瑰色红球菌M8 (SU1731814)、玫瑰色红球菌M33 (VKM Ac_1515D)、玫瑰色红球菌ATCC39484 (日本特开2001-292772)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)(日本特开平9-248188)、嗜热假诺卡氏菌(日本特开平9-275978)或热葡糖苷地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于上述菌的基因序列所编码的腈水合酶。
[0061]将来源于各种微生物的野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对不于图3_1和图3_2中。需要说明的是，在图3_1、3_2中，从上方的氨基酸序列起依次表不序列号4、和49~60。
[0062]另一方面，认为β亚基的功能涉及结构的稳定性。将来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图2-1和图2-2中。需要说明的是，在图2-1、2-2中，从上方的氨基酸序列起依次表示序列号2、和35~48。
[0063](b)改良型腈水合酶
[0064]本发明为对野生型腈水合酶实施了氨基酸置换的改良型(变异型)腈水合酶。成为实施置换的对象的野生型腈水合酶的氨基酸序列由GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)等NCBI的数据库公布。
[0065]例如:来源于玫瑰色红球菌J1(FERMBP_1478)的α亚基的氨基酸序列如序列号4所示，碱基序列如序列号3所示。另外，β亚基的氨基酸序列如序列号2所示，碱基序列如序列号I所示，登录号为“P21220”。另外，来源于玫瑰色红球菌M8(SU1731814)的α亚基的登录号为“ΑΤΤ79340”，β亚基的登录号为“ΑΑΤ79339”。进而，来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila) JCM3095 的 α 亚基的登录号为 “1IRE Α”, β 亚基的登录号为 “1IREB”。
[0066]另外，由在特定的氨基酸残基被置换的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加有I个或数个(例如I个~10个左右、优选为I个~5个左右)氨基酸残基(其中，除了上述置换后的基酸残基之外)的氨基酸序列构成且具有腈水合酶活性的改良型腈水合酶也在本发明的范围内。
[0067]作为本发明中的“改良型腈水合酶”可列举出一种蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基，进而选自由下述(f)~(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。需要说明的是，下述(d)、(e)、 (f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(I)、(m)、(η)、(ο)、(ρ)和(q)的氨基酸残基在各种野生型腈水合酶中也分别优选为来源于属于玫瑰色红球菌种的细菌的野生型腈水合酶的氨基酸序列中的氨基酸残基。
[0068](a) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基。
[0069](b) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基。
[0070](c) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基。
[0071](d) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基。
[0072](e) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基。
[0073](f) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基。
[0074](g) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基。
[0075](h) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基。
[0076](?) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数144残基下游的氨基酸残基。
[0077](j) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数133残基下游的氨基酸残基。
[0078](k) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数112残基下游的氨基酸残基。
[0079](I) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数105残基下游的氨基酸残基。[0080](m) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数95残基下游的氨基酸残基。
[0081](η) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数17残基下游的氨基酸残基。
[0082](ο) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数15残基下游的氨基酸残基。
[0083](ρ) α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起67残基下游的氨基酸残基。
[0084](q) α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起17残基下游的氨基酸残基。
[0085]另外，作为本发明的改良型腈水合酶，优选列举上述蛋白质中被置换的氨基酸残基为以下所列举的氨基酸残基的腈水合酶。
[0086](I)上述(a)~(e)、和(η)的氨基酸残基。
[0087](2)选自上述(a)~(e)、和(η)的氨基酸残基、以及选自上述(g)~(j)、(I)、(m)、(ο)和(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基。
[0088](3)上述(a)~(e)、(η)、⑴、和(ρ)的氨基酸残基。
[0089](4)上述(a)~(e)、(η)、(ρ)、和(f)的氨基酸残基。
[0090](5)上述(a)~(e)、(η)、⑴、(ρ)的氨基酸残基、以及选自由上述(f)、(k)和(m)所组成的组的至少一个氨基酸残基。
[0091]作为本发明的改良型腈水合酶的一例，优选可列举出一种酶蛋白，其包含:来源于Jl菌的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第167位的氨基酸残基(天冬酰胺)、β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第219位的氨基酸(缬氨酸)、β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第57位的氨基酸(丝氨酸)、β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第114位的氨基酸(赖氨酸)、β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第107位的氨基酸(苏氨酸)、和β亚基的氨基酸序列中由N末端侧起第17位的氨基酸(脯氨酸)，并且具有腈水合酶活性。作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出“Νβ 167S，Vi3 219Α，S3 57R、K3 114Υ、Τβ 107Κ、Ρβ 17D” 等。
[0092]需要说明的是，氨基酸的字母标记可以用通常的单字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“26”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
[0093]具体而言，关于序列号2所表示的β亚基的氨基酸序列，标记为“NM67S”的情况下，意味着β亚基的氨基酸序列(序列号2)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第167位的天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
[0094]此处，“ α I ”的标记意味着置换位置位于比CTLCSC区域的最下游侧的C残基还要下游(不包含该C残基数起，位于C末端侧)。
[0095]进而，作为本发明的改良型腈水合酶，更优选列举上述蛋白质中被置换的氨基酸残基为表1中所列举的氨基酸残基的腈水合酶。
[0096][表 I]
【权利要求】
1.一种蛋白质， 其为以下㈧或⑶的蛋白质； (A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(C)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基、进而选自由下述(f)~(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性； (a)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基、 (b)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基、 (c)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基、 (d)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基、 (e)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基、 (f)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基、 (g)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基、 (h)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基、 (?) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数144残基下游的氨基酸残基、 U) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数133残基下游的氨基酸残基、 (k) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数112残基下游的氨基酸残基、 (I)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数105残基下游的氨基酸残基、 (m) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数95残基下游的氨基酸残基、(η) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数17残基下游的氨基酸残基、(ο) β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数15残基下游的氨基酸残基、(P) α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起67残基下游的氨基酸残基、 (q) α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起17残基下游的氨基酸残基、 (B)蛋白质，其特征在于，包含在㈧蛋白质的氨基酸序列中除了所述置换后的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有I个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。
2.—种DNA，其编码权利要求1所述的蛋白质。
3.—种DNA，其与权利要求2所述的DNA在严格条件下杂交并且编码具有腈水合酶活性的蛋白质。
4.一种重组载体，其包含权利要求2或3所述的基因DNA。
5.一种转化体,其包含权利要求4所述的重组载体。
6.一种腈水合酶，是从培养权利要求5所述的转化体而得到的培养物中提取的。
7.一种腈水合 酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求5所述的转化体，从得到的培养物中提取腈水合酶。
8.一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使权利要求1所述的蛋白质或培养权利要求5所述的转化体而得到的培养物或该培养物的处理物与腈化合物接触。
【文档编号】C12N1/19GK103649312SQ201280028405
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年5月30日 优先权日:2011年5月31日
【发明者】渡边文昭, 安保贵永, 原爱 申请人:三菱丽阳株式会社