用于增强对hsp47表达的调节的类视黄醇-脂质体的制作方法
【专利摘要】描述了包含双链核酸分子的药物组合物，所述双链核酸分子包含有义链和反义链，其中所述有义链和反义链选自描述于SERPINH1_2(SEQ?ID?NO:60和127)、SERPINH1_45a(SEQ?ID?NO:98和165)、和SERPINH1_51(SEQ?ID?NO:101和168)的寡核苷酸，以及描述了包含类视黄醇和脂质媒介物的药物载体，和使用这些药物组合物来治疗hsp47相关疾病(包括纤维化)的方法。
【专利说明】用于增强对HSP47表达的调节的类视黄醇-脂质体
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求2011年6月15日提交的美国临时申请N0.61/497，447和2011年6月8日提交的美国临时申请N0.61/494，832的权益。其各自以其整体通过引用并入本文。
【技术领域】
[0003]本文提供的是药物组合物，其包含用于增强SiRNA对hsp47表达的调节的类视黄醇-脂质体。
【背景技术】
[0004]肝的纤维化可以由于激活的肝星状细胞(HSC)造成，导致多种类型的胶原分子和纤连蛋白沉积在间质组织上。这可能导致肝硬化、肝功能衰竭和/或肝细胞癌。此外，通过与肝纤维化相同的机制，胰囊性纤维化的结果发展成慢性胰腺炎(Madro，et al.，2004;MedSci Monit.10: RA166-70; Jaster, 2004, Mol Cancer.6:26)。此外，星状细胞存在于声带和喉部疾病中，例如声带瘢痕、声带粘膜纤维化和喉部纤维化。为了预防或治疗这些器官和身体其他地方的纤维化，需要开发药物载体和药物载体试剂盒。
[0005]星状细胞是治疗纤维化的重要的靶候选物之一(Fallowfield etal.，2004，Expert Opin Ther Targets.8:423-35;Pinzanij et al.，2004，Dig LiverDis.36:231-42)。在纤维化期间，星状细胞被来自附近细胞的细胞因子激活产生许多导致肝纤维化的因子。星状细胞储存维生素A，并属于成肌纤维细胞家族。
`[0006]预防或治疗纤维化的治疗方法尝试控制胶原蛋白代谢、加速胶原蛋白降解系统和抑制星状细胞的激活。然而，在所有这些情况中，作用的低特异性和/或低的器官特异性限制了效力且不良副作用产生问题。
[0007]还没有将胶原蛋白合成的抑制建立为治疗方法。由于导致副作用的可能性，靶向胶原蛋白产生的分子的潜力是有限的。抑制胶原蛋白产生直接地提供另一种预防或治疗纤维化的治疗方法。这样的方法需要控制胶原蛋白1-1v型中的一或多种不同类型。实现这的方法可以是通过热休克蛋白47 (HSP47)，其是细胞内运输必需的和多种类型的胶原蛋白的分子成熟必要的胶原蛋白特异性分子伴侣。因此，如果可以特异性地在星状细胞中控制HSP47的功能，则有可能抑制肝纤维化。
[0008]发明概述
[0009]本申请涉及药物载体和药物载体试剂盒，其使得诊断和/或治疗药物被特异性地运输至星状细胞。本申请中的药物载体可以选自聚合物微团(micelle)、脂质体、乳剂、微球体、和纳米球形式，并通过向其结合或包括在其中，类视黄醇或类视黄醇缀合物和治疗药物可以被特异性地运输至HSC。类视黄醇包括维生素A、视黄醛、视黄酸、饱和维生素A、维甲酸、阿达帕林或视黄醇棕榈酸酯、以及芬维A铵(4-HPR)。此外，通过制备所述药物载体来包括选自TGFii活性抑制剂如截短的TGFi3 II型受体和可溶的TGFi3 II型受体，生长因子制备物如HGF，产MMP启动子如含MMP基因的腺病毒载体，细胞激活抑制剂和/或生长抑制剂包括PPAR y -配体、血管紧张素1-1I型受体拮抗剂、PDGF酪氨酸激酶抑制剂、和钠通道阻滞剂如阿米洛利，和细胞凋亡诱导物如化合物861及胶霉毒素的一种分子或多种分子；以及通过将其口服、胃肠外、静脉内或腹膜内施用至具有纤维化风险或纤维化症状的患者或患有不同纤维化相关疾病如肝硬化、肝功能衰竭、肝癌或慢性胰腺炎的患者，星状细胞的激活能够被抑制，由此预防、抑制或改善所述患者中的纤维化和/或纤维化相关疾病病症。或者，或另外地，通过使用其中包装有特异性抑制HSP47或--ΜΡ (MMP抑制剂)的核酶、反义RNA、或siRNA，1-1V型胶原蛋白的分泌可以同时被抑制，结果是可以有效地抑制纤维发生。
[0010]本申请的一个实施方案是包含双链核酸分子和药物载体的药物组合物，所述双链核酸分子包含有义链和反义链，其中所述有义和反义链选自如下表4中的描述为 SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 和 127)、SERPINHl_45a (SEQ ID NO: 98 和 165)和SERPINH1_51(SEQ ID NOS: 101和168)的寡核苷酸，并且所述药物载体包含脂质囊泡(vesicle)和类视黄醇或类视黄醇缀合物的混合物。类视黄醇可以是以下的一或多种:维生素A、视黄酸、饱和维生素A、视黄醛、维甲酸、阿达帕林、视黄醇棕榈酸酯、或芬维A铵。优选地，所述类视黄醇包含视黄酸的缀合物，最优选地包含类视黄醇-PEG缀合物。所述脂质囊泡可以由脂质分子双层构成，并可以进一步包含类视黄醇。类视黄醇优选地以0.2wt%-20wt%的浓度存在于所述药物载体中。所述脂质囊泡可以包含内表面和外表面，所述内表面包囊化所述脂质囊泡的内部，所述外表面能够接近所述脂质囊泡外部的水性介质。所述类视黄醇可以与所述脂质双层相连。所述双链核酸可以被暴露于所述脂质囊泡的外表面上。
[0011 ] 在一些实施方案中，所述双链核酸分子包括反义链和有义链，所述反义链具有SEQID NO: 127并包含2’ -O-甲基(2’ OMe)-修饰的核糖核苷酸，在位置1、5、6或7至少一个处的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的3’端非核苷酸部分；而所述有义链具有SEQ ID NO:60并包含至少一个2’ -5’ -核糖核苷酸或2’ OMe修饰的核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的3’端非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向脱碱基部分。在优选的实施方案中，所述反义链是SEQ ID N0:127并包含在位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’0Me修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的非核苷酸部分；且所述有义链是SEQ ID N0:60并包含在3’端位置15、16、17、18、和19的5个连续2’ _5’ -核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向脱碱基部分。在一些实施方案中，所述双链核酸分子还包括在反义链位置I的2’ OMe修饰的核糖核苷酸或2’-5’_核糖核苷酸。(本文提及核苷酸位置，对于双链核酸分子的有义和反义链两者，均是基于寡核苷酸的5’ >3’方向。)
[0012]在多种实施方案中，有义链是SEQ ID NO:98并包含3’端位置中的2’ -5’ -核糖核酸，与3’ -端共价连接的非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向脱碱基部分；且反义链是SEQ ID NO: 165并包含2’ OMe修饰的核糖核苷酸，在位置5、6或7中至少一个的2’ _5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的非核苷酸部分。在优选的实施方案中，有义链是SEQ ID NO:98并包含在位置15、16、17、18、和19处的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C3-0H3’部分，和与5’ -端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且反义链是SEQ ID NO: 165并包含在位置4、6、8、11、13、15、17、和19处的2’0Me修饰的核糖核苷酸，在位置7的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H部分。在一些实施方案中，所述双链核酸还包含在位置2的2’ OMe修饰的核糖核苷酸。
[0013]在多种实施方案中，有义链是SEQ ID NO: 101并包含2’ OMe修饰的核糖核苷酸，任选存在的在位置9或10之一的2’ -5’ -核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的非核苷酸部分，与5’ -端共价连接的反向的脱碱基部分；且反义链是SEQ ID NO: 168并包含2’ OMe修饰的核糖核苷酸，在位置5、6或7至少一个处的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的非核苷酸部分。在优选的实施方案中，有义链是SEQ ID N0:101并包含在位置4、11、13和17处的2’ OMe修饰的核糖核苷酸，在位置9的2’ -5’ -核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的C30H非核苷酸部分，与5’ -端共价连接的反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且反义链是SEQ ID NO: 168并包含在位置1、4、8、11和15的2’ OMe修饰的核糖核苷酸，在位置6的2’ _5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H部分。在某些实施方案中，所述双链核酸分子还包括反义链中位置13和或在有义链中位置2的2’ OMe修饰的核糖核苷酸。
[0014]另一方面是药物组合物，其包含双链核酸分子和药物载体，所述药物载体包含类视黄醇和脂质的混合物，其中所述双链寡核苷酸化合物包括结构(Al):
[0015](Al) 5’(N)x-Z3’(反义链)
[0016]3，Z，-(N，)y - z"5，(有义链)
[0017]其中N和N’各自为可未经修饰或经修饰的核苷酸，或非常规部分；其中(N)X和(N’)y各自为其中每个连续N或N’通过共价键与下一个N或N’连接的寡核苷酸；其中Z和V各自独立地存在或不存在，但如果存在则独立地包括在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；其中z”可能存在或不存在，但如果存在贝U为在(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分；其中X和y各自独立地为18至40之间的整数；
[0018]其中(N，)y的序列与(N)X的序列互补；并且其中(N)X包括SEQ ID NO:1所示例的人hsp47的mRNA编码序列的反义序列，SEQ ID NO:1如下所示。
[0019]
【权利要求】
1.药物组合物，其包含药物载体和双链核酸分子，其中所述药物载体包含星状细胞特异量的类视黄醇，且其中所述双链核酸分子包含以下结构: 5’ (N)x-Z 3’(反义链) 3’ V -(N’)y-z” 5’(有义链) 其中N和N’各自为可未经修饰或经修饰的核苷酸，或非常规部分； 其中(N)j^P (N’)y各自为其中每个连续N或N’通过共价键与下一个N或N’连接的寡核苷酸； 其中Z和V各自独立地存在或不存在，但如果存在则独立地包括在其存在的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合； 其中z”可以存在或不存在，但如果存在则为在(N’ )y的5’末端共价连接的加帽部分； 其中X和y各自独立地为18至40之间的整数； 其中(N’ )y的序列与(N)x的序列互补；并且 其中(N)x包括SEQ ID NO:1所示人hsp47的mRNA编码序列的反义序列。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述siRNA包含选自序列SEQID NO:60和 127(SERPINH1_2)、 SEQ ID NO:98 和 165(SERPINHl_45a)、和 SEQ ID NO:101 和168(SERPINH1_51)的寡核苷酸序列。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述类视黄醇由选自维生素A、视黄酸、视黄醛、维甲酸、阿达帕林、视黄醇棕榈酸酯和芬维A铵(4-HPR)的分子组成。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述药物载体还包括聚乙二醇分子缀合的类视黄醇分子。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述聚乙二醇分子缀合的类视黄醇分子是diVA-PEG-diVA。
6.权利要求1的药物组合物，其中在所述药物载体到达所述星状细胞之前所述类视黄醇至少部分地暴露于所述药物载体的外部。
7.权利要求1的药物组合物，其中所述药物载体为选自聚合物微团、脂质体、乳剂、微球和纳米球的形式。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述药物载体是包含脂质分子双层的脂质囊泡的形式。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述类视黄醇是所述脂质分子的0.2wt%至20wt%。
10.权利要求8的药物组合物，其中所述脂质分子包含HEDC。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述脂质分子包含S104。
12.权利要求1的药物组合物，其中所述双链核酸分子暴露于所述脂质囊泡的外表面。
13.权利要求1的药物组合物，其中所述双链核酸分子被所述脂质囊泡包囊化。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述双链核酸分子对核酸酶有抗性。
15.权利要求1-14中任一项的药物组合物，其中所述双链核酸分子的一条链包含SEQID NO: 127 且第二条链包含 SEQ ID NO:60。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述反义链包含SEQID NO: 127，且所述有义链包含 SEQ ID NO:60。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述反义链还包含2’-0_甲基修饰的核糖核苷酸，在位置1、5、6或7至少一处的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含至少一个2’ -5’ -核糖核苷酸或2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的帽部分。
18.权利要求16的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含在3’端位置15、16、17、18、和19的5个连续2’ _5’ -核糖核苷酸，在3’端共价连接的非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向脱喊基部分。
19.权利要求16的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置1、3、5、9、11、13、15、17、和19处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的C3C3非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含与3’ -端共价连接的C3Pi非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向脱喊基部分。
20.权利要求16的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置1、3、5、9、11、13、15、17和19处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含在3’端位置15、16、17、18、和19的5个连续2’ -5’ -核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的C3Pi非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向脱碱基部分。
21.权利要求16的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置1、3、5、9、11、13、15、17和19处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’ _5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含在3’端位置15、16、17、18、和19的5个连续2’ -5’ -核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的C3Pi非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向脱碱基部`分。
22.权利要求16的药物组合物，其中所述反义链还包含在位置1、3、5、9、11、13、15、17和19处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7处的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H非核苷酸部分；且其中所述有义链还包含在位置7、13、16、和18处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置9处的2’ -5’ -核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的C3非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向脱碱基部分。
23.权利要求1-14中任一项的药物组合物，其中所述双链核酸分子的一条链包含SEQID NO:98 且第二条链包含 SEQ ID NO: 165。
24.权利要求23的药物组合物，其中所述有义链包含SEQID NO: 98，且所述反义链包含 SEQ ID NO:165。
25.权利要求24的药物组合物，其中所述有义链还包含在3’端处或附近的位置的2’ _5’ -核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的帽部分；且所述反义链还包含2’-0_甲基修饰的核糖核苷酸，在位置5、6或7至少一处的2’-5’_核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的非核苷酸部分。
26.权利要求24的药物组合物，其中所述有义链还包含在位置15、16、17、18、和19处的2’ -5’ -核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的C3-OH3’部分，和与5’ -端共价连接的反向脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且所述反义链还并包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17、和19处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置7的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H部分。
27.权利要求1-14中任一项的药物组合物，其中所述双链核酸分子的一条链包含SEQID NO: 101 且第二条链包含 SEQ ID NO: 168。
28.权利要求1的药物组合物，其中所述有义链包含SEQID NO: 101，且所述反义链包含 SEQ ID NO:168。
29.权利要求28的药物组合物，其中所述有义链还包含2’-O-甲基修饰的嘧啶核糖核苷酸、在位置9、或10的2’ -5’ -核糖核苷酸、与3’ -端共价连接的非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的帽部分；且其中所述反义链还包含2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸、在位置5、6或7至少一处的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的非核苷酸部分。
30.权利要求28的药物组合物，其中所述有义链还包含在位置4、11、13和17处的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置9的2’-5’-核糖核苷酸，与3’-端共价连接的C30H非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且所述反义链还包含在位置1、4、8、11和15的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置6的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H部分。
31.权利要求28的药物组合物，其中所述有义链还包含在位置4、11、13和17处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的C30H非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且所述反义链还包含在位置1、4、8、13和15的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置6的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H 部分。
32.权利要求28的 药物组合物，其中所述有义链还包含在位置2、4、11、13和17处的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，与3’ -端共价连接的C30H非核苷酸部分，和与5’ -端共价连接的反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分；且所述反义链还包含在位置1、4、8、11和15的2’ -O-甲基修饰的核糖核苷酸，在位置6的2’ -5’ -核糖核苷酸，和与3’ -端共价连接的C3P1-C30H 部分。
33.权利要求1-32中任一项的药物组合物，其中所述双链核酸分子在星状细胞中降低hsp47表达。
34.权利要求1-32中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗与hsp47相关的疾病。
35.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗选自以下的疾病:包括肝、肺、肾、胰腺、皮肤、心脏、脑、肠、结肠、声带、腹膜、眼睛、肌肉、骨髓、骨、卵巢、输尿管和子宫的器官和组织的纤维化；癌症和癌症相关纤维化组织。
36.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗肝纤维化。
37.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗肺纤维化。
38.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗肾纤维化。
39.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗腹膜纤维化。
40.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗慢性肝损伤。
41.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗原纤维生成。
42.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗归因于肝移植后的丙型肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的肝硬化；特发性肺纤维化；导致肺纤维化的放射性肺炎；糖尿病性肾病；与持续性非卧床腹膜透析(CAPD)相关的腹膜硬化或眼部瘢痕性类天庖疮。
43.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗归因于肝移植后的丙型肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的肝硬化。
44.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗特发性肺纤维化。
45.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗导致肺纤维化的放射性肺炎。
46.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗糖尿病性肾病。
47.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗与持续性非卧床腹膜透析(CAPD)相关的腹膜硬化。`
48.权利要求1-34中任一项的药物组合物，其中所述组合物预防或治疗眼部瘢痕性类天庖疮。
49.治疗或预防疾病的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效量的权利要求1-48任一项的药物组合物。
50.权利要求49的方法，其中所述疾病选自肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胰腺炎、胰脏纤维化、胰腺癌、声带瘢痕、声带粘膜纤维化、和喉部纤维化。
51.权利要求49的方法，其中所述疾病是肝炎或肝纤维化。
52.权利要求49的方法，其中所述疾病与慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染相关。
53.权利要求49的方法，其中胃肠外施用所述制备物。
【文档编号】C12N15/11GK103781909SQ201280028300
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年6月8日 优先权日:2011年6月8日
【发明者】新津洋司郎, J·E·佩恩, V·克诺波夫, V·阿科皮扬, R·P·维特, M·艾哈麦丁, L·A·佩雷尔曼, 田中康进, E·范斯坦, S·阿维肯纳胡姆, H·卡林斯基, I·梅特, 味吞宪二郎, 应文斌, 刘芸 申请人:日东电工株式会社