在发酵期间用于酶促生产醇酯的脂肪酶的原位表达的制作方法

在发酵期间用于酶促生产醇酯的脂肪酶的原位表达的制作方法
【专利摘要】本文公开了在发酵期间通过提供醇生产微生物生产醇酯的方法，所述微生物还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸。
【专利说明】在发酵期间用于酶促生产醇酯的脂肪酶的原位表达
【技术领域】
[0001]本发明涉及包括乙醇和丁醇的醇的发酵生产、以及采用原位产物移除方法的用于改善醇发酵的方法。
【背景技术】
[0002]醇在工业和科学中具有多种用途。例如醇可用作饮料(即，乙醇)、燃料、试剂、溶剂、和防腐败剂。例如丁醇是一种醇，它是重要的工业化学品，具有多种用途，包括用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和风味剂工业中用作食品级的提取剂。因此，高度需求醇如丁醇以及不依赖不可再生资源的高效生产方法。
[0003]利用微生物发酵生产醇是一种这样的生产方法，其利用来自可再生原料的底物。在丁醇生产中，具体地讲一些生产高产量丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性阀值，使得当生产丁醇时需要从发酵罐中去除丁醇。因此，存在对开发用于以高产率生产丁醇(尽管生产丁醇的微生物在发酵培养基中有低的丁醇毒性阈值)的有效方法和体系的持续需求。原位产物移除(ISPR)(也被称为提取发酵)可用于从其生产的发酵容器中取出丁醇(或其它发酵的醇)，从而使微生物以高产率生产丁醇。本领域已经描述过的一种用于移除发酵性醇的ISPR方法是液-液提取(美国专利申请公布20090305370)。一般来讲，关于丁醇发酵，例如，所述发酵培养基与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。丁醇被分配至有机提取剂相，降低了在与微生物接触的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。液-液提取由以下步骤引起:接触提取剂和发酵液体培养基以将产物醇传递到提取剂中；分离提取剂相与水相；以及优选地，再循环利用提取剂，同时在长期运行期间最小化提取剂分配系数的降低。
[0004]每一个循环 ，提取剂可随着时间进行而被污染，例如通过作为可水解的淀粉的原料被进料至发酵容器中的生物质中存在的脂质的积累。例如，在葡萄糖转化为丁醇的过程中加载至发酵容器的液化玉米醪可产生包含玉米油的发酵液体培养基，其通过同时的糖化和发酵产生(所述液化的醪的糖化在发酵过程中通过用于产生葡萄糖的葡糖淀粉酶的添加而发生)。在ISPR过程中，玉米油脂质溶解于提取剂中可导致脂质浓度随着每次提取剂的循环利用而积累，这使得产物醇在提取剂中的分配系数降低，因为提取剂中的脂质浓度随着每次循环利用而升高。
[0005]将液化醪中存在的脂质转化成可在ISPR中使用的提取剂是一种减少进料于发酵容器中的脂质量的方法，它通过向发酵加入作为酯化作用催化剂的脂肪酶，用脂肪酸酯化在发酵期间产生的产物醇。此类方法在例如美国申请公布20110312044和20110312043，以及PCT申请公布W02011 / 159998中有描述，上述文献以引用方式并入本文。
[0006]一直需要可供选择的提取发酵方法，其也能够减少与向发酵加入脂肪酶相关联的成本。

【发明内容】
[0007]本文提供的方法包括:a)提供发酵培养基，其包含来源于生物质原料的可发酵碳底物、产自来源于生物质原料的可发酵碳底物的醇、和醇生产微生物，其中醇生产微生物包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸，并且该微生物表达并展示或分泌所述多肽，使得发酵培养基中存在脂肪酶活性山)使发酵培养基与羧酸接触；其中脂肪酶活性以在细胞外将由微生物产生的醇的至少一部分转化成醇酯的足够量存在于发酵培养基中。在实施例中，醇生产微生物是酵母。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸是经工程化的。在实施例中，该方法还包括使发酵培养基与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。在实施例中，提取剂包括所述羧酸。在实施例中，产物醇是C2-C8烷基醇。在实施例中，产物醇是乙醇。在实施例中，醇酯包括脂肪酸乙酯。在实施例中，产物醇是丁醇。在实施例中，醇酯包括脂肪酸丁酯。在实施例中，醇酯还包括脂肪酸乙酯。
[0008]在实施例中，本文提供的具有脂肪酶活性的多肽展示在微生物表面上。在实施例中，分泌出具有脂肪酶活性的多肽。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含与具有 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273的多核苷酸具有至少约70%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与具有 SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274的多肽或它们的活性片段具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。
[0009]在实施例中，羧酸包括游离脂肪酸，所述游离脂肪酸来源于玉米油、低芥酸菜子油、棕榈油、亚麻籽油、麻风树油、或大豆油。在实施例中，羧酸来源于与可发酵碳底物相同的生物质原料。在实施例中，羧酸包括具有C12-C22直链或支化的脂肪链的羧酸。在实施例中，与提取剂的接触和与羧酸的接触同时发生。在实施例中，至少约60%有效滴度的由微生物产生的醇被转化成醇酯。在实施例中，发酵培养基还包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合，并且脂肪酶活性甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分水解以形成游离脂肪酸。
[0010]在实施例中，在发酵期间产生的醇的有效滴度大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效滴度，并且该微生物表达并分泌或展示所述多肽,使得发酵培养基中存在该脂肪酶活性。在实施例中，在发酵期间产生的醇的有效速率大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效速率，并且该微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得发酵培养基中存在该脂肪酶活性。
[0011]本文也提供了重组宿主细胞，其包含工程化的醇生产途径；和工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID N0:2、
4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或 274 或它们的活性片段具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID N0:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个 具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸包含与 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。
[0012]本文也提供了重组宿主细胞，其包含醇生产途径；和工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽，其中该具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或 274 或它们的活性片段具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽还包含与SEQ ID NO:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，醇生产途径是丁醇生产途径。在实施例中，丁醇生产途径是异丁醇生产途径。在实施例中，宿主细胞还包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。
[0013]本文也提供了提高醇生产微生物对所产生醇的耐受性的方法，该方法包括:工程化微生物以表达并分泌或展示具有脂肪酶活性的多肽；在使得微生物产生醇的条件下，使工程化的微生物与甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂、游离脂肪酸、或它们的混合物以及碳底物接触。在实施例中，使工程化的微生物与甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合接触，并且其中分泌的或展示的脂肪酶将甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分转化成游离脂肪酸。在实施例中，脂肪酶催化醇酯的形成。在实施例中，微生物产生醇的有效滴度大于由未经工程化以表达并分泌具有脂肪酶活性的多肽的微生物产生的醇的有效滴度。在实施例中,微生物还包含工程化的醇生物合成途径。在实施例中，工程化的醇生物合成途径是1-丁醇、2-丁醇、或异丁醇生物合成途径。在实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化:丙酮酸至乙酰乳酸；乙酰乳酸至2，
3-二羟基异戊酸；2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；2_酮异戊酸至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
[0014]本文提供了在发酵期间生产丁酯的方法，该方法包括提供发酵培养基，所述发酵培养基包含碳底物以及甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的混合物；以及使发酵培养基与包含丁醇生物合成途径的醇生产微生物接触，其中所述微生物还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并分泌或展示该多肽，使得发酵培养基中存在脂肪酶活性。在实施例中，发酵培养基还包含一种或多种羧酸。在实施例中，碳底物来源于生物质。在实施例中，生物质是玉米或甘蔗。在实施例中，碳底物以及甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂来源于相同的生物质。
[0015]本文提供了发酵培养基，其包含醇生产微生物、丁酯和丁醇，该醇生产微生物包含丁醇生物合成途径并且还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，所述多肽被表达并分泌或展示。
[0016]还提供了包含本文所述的微生物的动物饲料产品。
[0017]附图和序列说明
[0018]并入本文并成为说明书的一部分的附图和序列表示出了本发明，并且与说明书一起进一步用来解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。[0019]图1示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中微生物与羧酸和/或天然的油一起被提供至发酵容器。
[0020]图2描绘了从丙酮酸生物合成异丁醇的生物合成途径例子。
[0021]图3 是质粒 pRS423::TEF1 (M4) -CdLIPl (“pNAK10”;SEQ ID NO:45 ;参见实例 I)的图谱，该质粒携带畸形假丝酵母(Candida deformans) LIPl脂肪酶,它在组成型TEFl (M4)启动子(Nevoigt E, Kohnke J, Fischer CR, Alper H, Stahl U, &Stephanopoulos G (2006),Engineering of promoter replacement cassettesfor fine-tuning of gene expressionin Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol72:5266-5273)和 CYCl 转录终止子的转录控制下，位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
[0022]图4 是质粒 pRS423::TEF1 (M4)-THlip ( “pTVAN2”；SEQ ID NO:100 ;参见实例 2)的图谱，该质粒携带疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus) Tlan脂肪酶,它在组成型TEF1(M4)启动子(Nevoigt E等人)和CYCl转录终止子的转录控制下,位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
[0023]图5 是质粒 pRS423::TEF1 (M4)-CalB (“pTVAN3”;SEQ ID NO:101 ;参见实例 7)的图谱，该质粒携带南极假丝酵母(Candida antarctica) CalB脂肪酶,它在组成型TEFl (M4)启动子(Nevoigt E等人)和CYCl转录终止子的转录控制下,位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
[0024]图6是质粒pYZ090AalsS(SEQ ID NO:43 ;参见实例)的图谱，该质粒携带酮醇酸还原异构酶(KARI)的0RF,位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
[0025]图7质粒pBP915 (SEQ ID NO:44 ;参见实例9和10)的图谱，该质粒携带编码二羟基酸脱水酶和醇脱氢酶的0RF，位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
[0026]SEQ ID NO:1和2是来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B( “CalB”)的核酸和氨基酸序列。
[0027]SEQ ID NO:3和 4是来自畸形假丝酵母(Candida deformans)的脂肪酶 I (“LIP1”)的核酸和氨基酸序列。
[0028]SEQ ID NO:5 和 6 是来自疏棉状嗜热丝抱菌(Thermomyces lanuginosus)的 Tlan脂肪酶(“Tlan”)的核酸和氨基酸序列。
[0029]SEQ ID NO:255 和 256 是来自塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的脂肪酶3( “lip3”)的核酸和氨基酸序列。
[0030]SEQ ID NO:7、8、9和257是来自南极假丝酵母(Candida antarctica)、畸形假丝酵母(Candida deformans)、疏棉状嗜热丝抱菌(Thermomyces lanuginosus)和塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的CalB、LIPU Tlan和lip3脂肪酶的编码序列，它们经密码子优化以在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达。
[0031]SEQ ID NO:46和47是具有修饰N99A的CalB变体的核酸和氨基酸序列。
[0032]SEQ ID NO:48和49是具有修饰N146A的LIPl变体的核酸和氨基酸序列。
[0033]SEQ ID NO:50和51是具有修饰N167A的LIPl变体的核酸和氨基酸序列。
[0034]SEQ ID NO:52和53是具有修饰N146A和N167A的LIPl变体的核酸和氨基酸序列。
[0035]SEQ ID NO:54和55是具有修饰N55A的Tlan变体的核酸和氨基酸序列。[0036]SEQ ID NO:271和272是具有修饰N59A的lip3变体的核酸和氨基酸序列。
[0037]SEQ ID NO:273和274是具有修饰N269A的lip3变体的核酸和氨基酸序列。
[0038]SEQ ID NO:275和276是具有修饰N59A和N269A的lip3变体的核酸和氨基酸序列。
[0039]SEQ ID NO:241 和 248 是来自白曲霉(Aspergillus kawachii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、嗜热踩节菌(Talaromycesthermophilus)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0040]SEQ ID NO:249和254是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的细胞表面锚定域的氨基酸序列。
[0041]SEQ ID NO:258 和 259 是来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)和印度拜耶林克氏菌(Beijerinkia indica)的醇脱氢酶的氨基酸序列。
[0042]SEQ ID NO:260和261是来自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)和格氏李斯特菌(Listeria grayi)的酮酸脱羧酶的氨基酸序列。
[0043]SEQ ID NO:262和263是来自变异链球菌(Streptococcus mutans)和乳酸乳球菌(Lactococcus I actis)的二羟基酸脱水酶的氨基酸序列。
[0044]SEQ ID NO:10_45、56—144、153-238、240、264_270、和278是实例中所述的合成构建体和引物的序列。
【具体实施方式】
[0045]除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
[0046]为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
[0047]如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B:A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
[0048]同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
[0049]如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施例。
[0050]如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化:在真实世界中用在产生浓缩物或溶液的一般测定和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10%范围内，或者在报告数值的5%范围内。
[0051]如本文所用，“生物质”指包含可水解多糖的天然产物，所述多糖提供可发酵糖，包括来源于天然来源如玉米、甘蔗、小麦、纤维素或木质纤维素材料以及包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、二糖和/或单糖、以及它们的混合物的材料的任何糖和淀粉。生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸杆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于:玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸杆、草、小麦、黑麦、小麦秸杆、大麦、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。例如，可通过本领域已知的任何加工方法，利用发酵加工生物质以从生物质中形成麦芽浆或果汁或糖蜜或水解产物，所述方法例如研磨、处理和/或液化，并且它们包含可发酵糖并可包含一定量的水。例如，可通过本领域技术人员已知的任何方法来加工纤维素和/或木质纤维素生物质以获得包含可发酵糖的水解产物。在美国专利申请公布US20070031918A1中公开了低氨预处理，该专利申请以引用方式并入本文。纤维素和/或木质纤维素生物质的酶促糖化通常利用酶聚生体来降解纤维素和半纤维素以产生包含糖的水解产物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(适于纤维素和/或木质纤维素生物质的糖化酶综述于Lynd，L.R.等人(Microbiol.Mol.B iol.Rev.，66:506-577,2002)。
[0052]麦芽浆或果汁或糖蜜或水解产物可包括如本文所述的原料12和原料浆液16。含水原料流可通过本领域已知的任何加工方法，利用发酵加工生物质来源于生物质或从生物质中形成，所述方法例如研磨、处理和/或液化，并且它们包含可发酵碳源(例如糖)和水。含水原料流可包括如本文所述的原料12和原料浆液16。
[0053]如本文所用，“产物醇”指在发酵过程中能够由微生物产生的任何醇，所述微生物利用生物质作为可发酵碳底物的来源。产物醇包括但不限于C1-C8烷醇。在实施例中，产物醇为C2-C8烷基醇。在另外的实施例中，产物醇为C2-C5烷基醇。应当理解，C1-C8烷醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。同样地，C2-C8烷基醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。“醇”本文也用于指产物醇。
[0054]如本文所用，“丁醇”特指单独的或它们的混合物形式的丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2_ 丁醇(2-BuOH)、和 / 或异丁醇(iBuOH 或 1-BuOH 或 1-BU0H，也称为 2-甲
基-1-丙醇)。
[0055]如本文所用，“丙醇”指丙醇异构体异丙醇或1-丙醇。
[0056]如本文所用，“戊醇”指戊醇异构体1-戊醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、2，2-二甲基-1-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2-丁醇、或2-甲基-2-丁醇。
[0057]如本文所用，“原位产物移除(ISPR) ”指从诸如发酵的生物过程中，当产物生成时选择性移出特定的发酵产物以控制生物过程中的产物浓度。[0058]如本文所用，“可发酵碳源”或“可发酵碳底物”是指能够由本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的碳源。适当的可发酵的碳源包括但不限于单糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉或纤维素；包括甲烷的一碳底物；以及它们的混合物。
[0059]如本文所用，“原料”是指发酵过程中的原料，所述原料包含具有或不具有不溶解的固体的可发酵碳源，并且如果适用，所述原料在通过进一步加工(例如通过液化、糖化、或其它方法)已经从淀粉中释放可发酵碳源或从复糖降解中获取可发酵碳源之前或之后包含可发酵碳源。原料包括或来源于生物质。适宜的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、甘蔗、以及它们的混合物。
[0060]如本文所用，“不溶解的固体”是指原料的不可发酵部分，例如胚芽、纤维和谷蛋 白。
[0061]如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖、溶解的固体、微生物产生的醇、产物醇及发酵容器内具有的所有其它物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物的存在下使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有时，如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”能够与“发酵液体培养基”同义使用。
[0062]如本文所用，“发酵容器”是指在其中进行发酵反应的容器，产物醇如丁醇通过发酵反应由糖制备。
[0063]如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的特定醇(例如丁醇)或通过醇的酯化作用产生的醇酯的醇等同物的总量。例如，在单位体积发酵中的丁醇的有效滴度包括:(i)发酵培养基中的丁醇量；(ii)由有机提取剂回收的丁醇量；(iii)如果使用汽提，从气相回收的丁醇量，和(iv)在有机相或水相中的丁酯的当量醇。
[0064]如本文所用，“糖化”是指低聚糖降解成单糖。“同步糖化和发酵”是指发酵和糖化在相同容器中同时发生。
[0065]如本文所用，“糖化酶”指能够水解多糖和/或低聚糖例如糖原、淀粉的α -1，4_糖苷键的一种或多种酶。糖化酶也可包括能够水解纤维素或木质纤维素材料的酶。
[0066]如本文所用，“脂肪酶活性”是指催化水不溶性的或低水溶性的脂质底物中的酯化学键水解的酶活性。脂肪酶是酯酶的一个亚类，并且就其本身而言，“脂肪酶活性”也指催化酯水解成羧酸和醇的酶活性，并且如本文所用，“脂肪酶活性”也指将醇和羧酸酯化成羧酸醇酯的酶活性。
[0067]如本文所用，“糖基化”是将碳水化合物分子酶促加成到生物大分子如蛋白上，这可能发生在蛋白定向分泌到细胞外时。在O-糖基化蛋白中，碳水化合物连接到丝氨酸、苏氨酸、或酪氨酸残基的羟基上。在N-糖基化蛋白中，碳水化合物连接到共有序列NXS / T中的天冬酰胺(N)残基的酰胺侧链上，其中X是任何氨基酸并且S / T是丝氨酸或苏氨酸。如本文所用，“糖基化的”是指具有共价连接的碳水化合物的蛋白分子。
[0068]如本文所用，“液化容器”指在其中进行液化的容器。液化是其中低聚糖从原料中释放出来的过程。在其中原料是玉米的实施例中，低聚糖在液化期间从玉米淀粉内容物中释放出来。
[0069]如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，并且是指从初始混合物中移除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的所述化合物纯度或浓度更高的化合物。
[0070]术语“与水不混溶的”或“不溶的”是指化学组分如提取剂或溶剂不能够以形成单一液相的形式与水溶液如发酵液体培养基混合。
[0071]如本文所用，“提取剂”或“ISPR提取剂”是指用于提取任何产物醇如丁醇，或用于提取通过催化剂从产物醇和羧酸或脂质产生的任何产物醇酯的有机溶剂。有时，如本文所用，术语“溶剂”可与“提取剂”同义地使用。就本文所述的过程而言，提取剂是与水不混溶的。
[0072]如本文所用，“天然的油”是指从植物(例如生物质)或动物获得的脂质。如本文所用，“植物来源的油”特别地指从植物获得的脂质。有时，“脂质”可与“油”和“酰基甘油酯”同义地使用。天然的油包括但不限于:牛油，玉米，卡诺拉，癸酸/辛酸甘油三酯，蓖麻，椰子，棉籽，鱼，荷荷巴油，猪油，亚麻籽，牛蹄油，奥蒂油，棕榈，花生，菜籽，大米，红花，大豆，葵花子，油桐，麻风树油和植物油混合物。
[0073]如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液体培养基和与水不混溶的有机提取剂接触而获得的两相混合物中的非水相。
[0074]如本文所用，术语“脂肪酸”指具有C4-C28碳原子(最常见地为C12-C24碳原子)的羧酸(例如脂族一元羧酸)，其是饱和或不饱和的。脂肪酸还可以是支化的或非支化的。脂肪酸在动物或植物的脂肪、油或蜡中可来源于或包含于酯化的形式。脂肪酸可以甘油酯形式在脂肪和脂肪油中天然存在，或者可通过水解脂肪或通过合成获得。术语脂肪酸可以描述单种化学物质或脂肪酸的混合物。脂肪酸可包括质子化的和非质子化的脂肪酸的混合物，其中非质子化的脂肪酸是非质子化的脂肪酸盐(例如钠、钾、铵、或钙离子盐)。此外，术语脂肪酸还可涵盖游离脂肪酸。
`0075]本文所用术语“脂肪醇”是指具有C4-C22碳原子的脂肪链的醇，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。
[0076]如本文所用，术语“脂肪醛”是指具有C4-C22碳原子的脂族链的醛，所述脂族链为饱和的或不饱和的。
[0077]如本文所用，术语“羧酸”是指具有化学通式-COOH的任何有机化合物，其中碳原子通过双键与氧原子键合形成羰基(-C=O)并且通过单键形成羟基(-0H)。羧酸可为质子化羧酸的形式、或羧酸盐形式(例如铵、钠、或钾盐)、或质子化羧酸与羧酸盐混合物的形式。术语羧酸可描述单独的化学物质(例如油酸)或羧酸的混合物，其可通过例如水解生物质来源的脂肪酸酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂产生。
[0078]如本文所用，术语“丁醇生物合成途径”或“丁醇生产途径”是指产生1- 丁醇、2- 丁醇或异丁醇的酶途径。
[0079]如本文所用，术语“ 1- 丁醇生物合成途径”或“ 1- 丁醇生产途径”是指从乙酰-辅酶A (乙酰-CoA)产生1- 丁醇的酶途径。
[0080]如本文所用，术语“2- 丁醇生物合成途径”或“2- 丁醇生产途径”是指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。
[0081]如本文所用，术语“异丁醇生物合成途径”或“异丁醇生产途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
[0082]如本文所用，术语“醇生物合成途径”或“醇生产途径”是指将碳底物转化成醇的酶途径。包含“工程化的醇生产途径”的重组宿主细胞是指包含修饰途径的宿主细胞，该途径以与宿主细胞中通常存在的途径不同的方式生产醇。此类差异包括生产通常宿主细胞不生产的醇，或者提高产量或更有效地生产。
[0083]术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5，非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”是指包含天然地不一起存在的调控和编码序列的非天然的任何基因(即，它是从其天然状态被修饰的或是来自另外的来源的)。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来基因”或“异源性基因”指宿主生物中通常不作为天然基因存在的但是通过转基因被导入到宿主生物中的基因。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。
[0084]如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5，非编码序列)、中间或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
[0085]术语“多核苷酸”旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指核酸分子或构建体例如信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。如本文所用，“基因”是多核苷酸。多核苷酸可包含全长基因或cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5 ’和3 ’序列以及编码序列。所述多核苷酸可由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA (例如，异源性DNA)。例如，多核苷酸能够由单链和双链DNA构成，其为单链和双链区域的混合物；单链和双链RNA，其为单链和双链区域的混合物；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地、 或代谢地改性的形式。
[0086]如本文所用，“工程化的多核苷酸”是指已经从天然存在的形式发生改变的多核苷酸，或者通过转基因如转化将多核苷酸引入宿主生物。此类修饰包括例如连接两个天然不相连的序列，例如操作地连接天然不操作地连接的编码序列与启动子，或者将两个编码序列连接到一起以形成嵌合编码序列。此类修饰也包括改变天然存在的多核苷酸的一个或多个核苷酸，包括碱基替换、插入、或缺失。
[0087]多核苷酸序列可被称为“分离的”，其中它被从其天然的环境中移出。例如，包含在载体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源性多核苷酸，出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可由一个或更多个cDNA、基因组DNA或合成DNA片段构成。
[0088]如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其他任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。一条多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由一条指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。
[0089]“分离的”多肽或其片段、变体、或衍生物，是指不在其天然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。在宿主细胞中重组产生的多种多肽和蛋白质考虑以所述发明目的进行分离，即为原生的或重组的多肽，其已通过任何适宜的技术分离、分馏、或部分或大幅纯化。
[0090]如本文所用，“重组微生物”是指通过重组DNA技术的使用(例如，通过工程化宿主细胞以包含生物合成途径如丁醇的生物合成途径)被改造的微生物如细菌和酵母。
[0091]如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
[0092]术语“经密码子最优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。
[0093]包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸(其余三种密码子编码结束翻译的信号)。 显示哪个密码子编码哪个氨基酸的“遗传密码”在本文中作为表1示出。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0094]表1:标准遗传密码
[0095]
【权利要求】
1.方法，包括: 提供发酵培养基，所述发酵培养基包含来源于生物质原料的可发酵碳底物、产自来源于生物质原料的可发酵碳底物的醇和醇生产酵母微生物，其中所述醇生产微生物包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并展示或分泌所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性； 使所述发酵培养基与羧酸接触； 其中所述脂肪酶活性以在细胞外将由所述微生物产生的醇的至少一部分转化成醇酯的足够量存在于所述发酵培养基中。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述发酵培养基与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取剂包括所述羧酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物醇是C2-C8烷基醇。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物醇是乙醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸乙酯。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述产物醇是丁醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸丁酯。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述醇酯还包括脂肪酸乙酯。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽在所述酵母微生物的表面上展示。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQID NO:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70%同一性的序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含与具有 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273 的多核苷酸具有至少约70%同一性的序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与具有 SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274的多肽或它们的活性片段具有至少约70%同一性的序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸包括游离脂肪酸，所述游离脂肪酸来源于玉米油、低芥酸菜子油、棕榈油、亚麻籽油、麻风树油、或大豆油。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸来源于与所述可发酵碳底物相同的生物质原料。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸包括具有C12-C22直链或支化的脂肪链的羧酸。
19.根据权利要求2—18中任一项所述的方法，其中所述与提取剂的接触和所述与羧酸的接触同时发生。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少约60%有效滴度的由所述微生物产生的醇被转化成醇酯。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合，并且其中所述脂肪酶活性使所述甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分水解以形成游离脂肪酸。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述在发酵期间产生的醇的有效滴度大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效滴度，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述在发酵期间产生的醇的有效速率大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间醇产生的速率，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。
24.重组宿主细胞，包含: 工程化的醇生产途径；和 工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽。
25.根据权利要求24所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或 274或它们的活性片段具有至少约70%同一性的序列。
26.根据权利要求24或25所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70%同一性的序列。`
27.根据权利要求26所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。
29.根据权利要求24所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸包含与 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273 具有至少约70%同一性的序列。
30.重组宿主细胞，包含: 醇生产途径；和 工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与 SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它们的活性片段具有至少约70%同一性的序列。
31.根据权利要求30所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽还包含与SEQ ID NO:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70%同一性的序列。
32.根据权利要求24— 31中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醇生产途径是丁醇生产途径。
33.根据权利要求32所述的重组宿主细胞，其中所述丁醇生产途径是异丁醇生产途径。
34.根据权利要求24—33中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含减少的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。
35.提高醇生产微生物对所产生醇的耐受性的方法，所述方法包括: 工程化微生物以表达并分泌或展示具有脂肪酶活性的多肽； 在使得所述微生物产生醇的条件下，使所述工程化的微生物与下列接触: 甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂、游离脂肪酸、或它们的混合物；以及 碳底物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中使所述工程化的微生物与甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合接触，并且其中所述分泌的或展示的脂肪酶将所述甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分转化成游离脂肪酸。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述脂肪酶催化醇酯的形成。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述微生物产生的醇的有效滴度大于由未经工程化以表达并分泌具有脂肪酶活性的多肽的微生物产生的醇的有效滴度。
39.根据权利要求35—38中任一项所述的方法，其中所述醇生物合成途径是工程化的醇生物合成途径。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述工程化的醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化: 丙酮酸至乙酰乳酸； 乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸； 2，3- 二羟基异戊酸至2-酮异戊酸； 2-酮异戊酸至异丁醛；以及 异丁醛至异丁醇。
42.在发酵期间生产丁酯的方法，包括: 提供发酵培养基，所述发酵培养基包含碳底物以及甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷月旨、或它们的混合物；以及 使所述发酵培养基与包含丁醇生物合成途径的醇生产微生物接触，其中所述微生物还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述发酵培养基还包含一种或多种羧酸。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述碳底物来源于生物质。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述生物质是玉米或甘蔗。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述碳底物以及所述甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂均来源于所述相同的生物质。
47.发酵培养基，包含醇生产微生物、 丁酯和丁醇，所述醇生产微生物包含丁醇生物合成途径并且还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，所述多肽被表达并分泌或展示。
48. 动物饲料产品，包含权利要求24— 34中任一项的微生物。
【文档编号】C12P7/06GK103620046SQ201280028068
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年6月15日 优先权日:2011年6月17日
【发明者】R.迪科斯莫, A.L.克鲁科伯格, T.E.范阿肯 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司