用于通过超声波破碎样本中的分子的装置制造方法

用于通过超声波破碎样本中的分子的装置制造方法
【专利摘要】根据本发明的一方面，提供了通过超声波破碎在样本中的分子的装置。装置包括平面形状的盒和具有容器状形状的破碎仪器。通过在破碎仪器中施加负压，盒被朝破碎仪器拉动且因此空间封闭由破碎仪器构成的流体隔间。之后，包含在盒的样本隔间中的样本可被进行超声波处理。在盒和破碎仪器之间设有密封层以便保持盒紧密地固定和以便防止从流体隔间泄漏。
【专利说明】用于通过超声波破碎样本中的分子的装置
发明领域
[0001]本发明涉及盒与超声波换能器的接合。尤其是，本发明涉及一种用于通过超声波破碎样本中的分子的装置。进一步，本发明涉及用于通过超声波破碎样本中的分子的破碎仪器和盒。此外，本发明涉及提供用于破碎样本中的分子的超声波的装置的方法。
【背景技术】
[0002]持续下降的测序成本打开了在肿瘤学以及如植物培育、病原体检测和研究领域的其他领域中临床使用DNA测序的可能性，除了传统领域的临床遗传学之外。
[0003]此刻，大多数用于测序的商业化仪器和作为下一代的研发中的仪器仅具有部分自动工序。每个链(strand)的碱基(base)检测被执行且DNA的结果读取被输出。大体上，测序工序本身前的样本制备仍通过受过训练的人员执行。这样花费了大量的时间和资源。目前测序过程的时间线通常跨越超过3周，其中一周是样本制备，另一周是DNA链的碱基的自动检测以及需要一周进行生物信息分析。
[0004]来自细胞的DNA被提取之后，分子必须在碱基检测在同一盒上开始发生之前被破碎。优选的是DNA链的平均尺寸大约在200碱基对(bp)。该特定长度等同于在计算分析中需要的理想读取长度。清楚的是，如果破碎工序导致分子平均尺寸Latc尽可能接近理想读取长度，则所需的DNA材料(如来自活体)的最小量可显著减少。此外，优选的是根据以下步骤的最小量需求，Lavg可被调整到一定长度。
[0005]需要注意的是用于选择带有适当长度DNA片段的通常接受的方法由以下步骤组成:a)执行给定的破碎方法，b)运行凝胶电泳试验,其中放置了校准梯(calibrationladder), c)通过切断凝胶的相应部分以便在合理长度选择片段。可选地，自动仪器能够执行类似操作以获得更多的可重复结果。这样的装置需要受过训练的人员及大约一小时的处理。
[0006]EP0353365描述了一种超声波细胞破碎机,其中不同的溶液容器设在封闭面板21内。US2002/0039783A1描述了用于溶解细胞，孢子或微生物的装置。US2002/0187547A1描述了用于保持细胞以破碎的容器。
[0007]从W02011048521A1可知带有并联气动接合面板的微流体盒(microfIuidiccartridge)。这样的装置使得液体在微流体盒上移动长的预定路径成为可能。
[0008]尽管存在多个用于DNA破碎的方法，但仅少数可考虑适用于特定目的。然而，所有这些看来至少有一个缺点需要改进。这些方法中的几个在此提及。首先，酶分解是用在DNA破碎中的一种方法。该方法的缺点在于链切断位置不能随机分配。这是在计算分析中的一个误差来源。其次，流边界层法(flow boundary layer method)是用于破碎的射流方法(fluidic method)。该方法需要在盒上施加实质压力。包含DNA分子的流体以约为数百ml/min的很高流速Q穿过喷孔。例如报告称需要LAve = IOOObp, Q = 125ml/min。使用的喷孔具
有L = 1_的长度和R = 125 y m的半径。在这些情况下形成的压差是
清楚的是，由于使用的部件如红宝石制成的剪切喷孔，结合在盒中的此方法需要不能接受的破碎成本。第三，声处理是另一种可成功用于剪切DNA分子的方法。该方法实际具有约200bp的LaH。其包括将超声波换能器或声波导浸入样本流体。该工序带来样本污染风险且使用的最小容积约为数百微升。另外，当使用一些缓冲材料时，样本产生泡沫的风险是较大的。当试图在长保存时间后再分散气泡沉淀时，也容易产生泡沫。同样，声波降解法这一解决方案不是用于带有封闭的一次性盒的测序系统。第四，超声波空化的原理的使用是已知的。施加声压场以便引发气泡成核继之以空化。结果沿着DNA分子产生压力梯度，从而导致破碎。样本放置于位于超声波换能器的焦域(focal region)内的封闭容器。使用这种空化的已知装置可用于范围从50 Ul到毫升的样本容积。此外已知装置具有主动冷却装置，以控制其中放置换能器的水槽。需要大的水容器(> 25cmX25cmX25cm)来容纳超声波换能器，冷却电路和样本固定装置。由于其尺寸，该装置很难或不可能结合到样本制备台中。第五，风应力边界层和边界感应声流用于破碎是已知的。在该情况下样本放置在超声波换能器附近。在固体材料存在于超声波传播路径中的情况下，在处理期间换能器温度和其他物理参数的内在增加可能发生。因此，固体材料的阻抗性能可从试验到试验变化，这导致严重的可再现性问题。

【发明内容】

[0009]因此，可看到本发明的目的在于提供一种改进的通过超声波对分子破碎的方法。
[0010]该目的通过独立权利要求中限定的主题解决。本发明的进一步的方面和优点在从属权利要求中限定。本发明专注于上述需求且提供了用于通过超声波破碎在样本中的分子的组件和方法，以及为了该目的提供了用于提供超声波装置的组件和方法。
[0011]需要注意的是，在此关于该装置描述的特征和优点应理解为同时关于破碎仪器、盒以及方法进行了描述，反之亦然。因而，本领域技术人员在不带有任何过度的负担的情况下把例如关于该装置描述的特征结合到破碎仪器、盒和/或方法中，反之亦然。
[0012]根据本发明的第一方面，展示了用于通过超声波处理或破碎在样本中的分子的装置。该装置包括盒、带有超声波换能器和流体隔间的破碎仪器。从而，盒包括样本隔间，所述样本隔间用于包含带有需通过超声波破碎的分子的样本。此外，流体隔间特别地和样本隔间分离。当盒和破碎仪器组装在一起时，盒和破碎仪器通过建立流体隔间的空间封闭的方式装配在一起。建立的空间封闭可以是流体隔间的整个的空间封闭。
[0013]当流体隔间例如填充有水用于从换能器传送所发射的超声波能量到包含在封闭的盒中的样本时，流体隔间建立的封闭可以是不透流体的封闭。
[0014]因此，术语“流体隔间”可理解成传动流体隔间。此外，术语“盒”本发明文中可理解成作为一次性盒或微流体盒或一次性微流体盒(disposable microfluidic cartridge)。
[0015]此外，流体隔间可通过盒构成或它可通过破碎仪器构成。它也可以是下述部件，该部件是需要与破碎仪器和/或盒组装的分离元件。
[0016]通过将破碎仪器和盒组装到一起，样本隔间及因此样本自动地和/或固有地定位在破碎仪器的超声波换能器的焦点和/或焦体(focal volume)内。因为破碎仪器适合于接收盒且盒适合于插入仪器中，所以当他们被组装时，他们构造成机械单元。然而，他们可由两个分离的物理部分构造而成。破碎仪器和盒的组装可例如通过施加真空或负压(under-pressure)来建立。然而,其他固定组件如螺钉或磁力也可用于建立流体隔间的封闭。从而，封闭是流体隔间的开口靠着仪器的周围的空间封闭。通过将盒放置在破碎仪器上，流体隔间成为其中流体或任何媒介可填充其中以便传递来自换能器的超声波到盒中样本的封闭容积。因此，在盒和破碎仪器之间存在提供不透流体的闭合或不透流体的接合的需求。
[0017]盒和破碎仪器是否以期望方式装配在一起的事实可直接地和明确地通过在此描述的和/或本领域技术人员已知的测试或程序来验证。
[0018]此外，当盒和破碎仪器组装在一起时，不需要过度试验来验证盒和破碎仪器是否以建立流体隔间的空间封闭的方式装配在一起。
[0019]本发明允许在一个盒上集成所有用于DNA测序的样本制备步骤。
[0020]此外，本发明提供将封闭盒(测序)与破碎仪器的的接合和在用于DNA测序的平台中集成破碎方法的解决方案。换言之，在此提出了用于如DNA分子的破碎的装置和方法，从而解决了上述的盒集成和再现性问题。
[0021]本发明不需要用于分子破碎的主动冷却装置，其简化了破碎处理过程且可减少力气和成本。
[0022]在本发明的上下文中，换能器不在盒中。盒可为用聚合物材料制成的一次性产品，这在保持盒的低成本方面是希望的。因此，根据本发明的盒可不包括电子的和/或电气的部件。
[0023]此外，本发明的上下文中的术语“分子”可理解成包括核酸，DNA、RNA、组织、生物样本和病理样本。然而，术语“分子”不限于这些例子。
[0024]根据本发明的示例性实施例，盒具有平面形状以及破碎仪器具有容器状形状。
[0025]换言之，提供了用于通过超声波破碎在样本中的分子的装置，其中破碎仪器是包括容器开口的容器状物体，所述开口可定位成与破碎仪器的底部相对。
[0026]此外，盒适合于成为破碎仪器的盖或罩。容器状破碎仪器可不透流体地封闭，且使得在将盒置于破碎仪器上之后的超声波处理变得可行。因此，只有当破碎仪器和盒组装在一起时，可行的且工作的装置才可被提供。
[0027]在样本包含在盒中的同时，数个盒可随后置于破碎仪器上，其中各个盒分别建立用于破碎仪器的流体隔间的盖或封闭罩。期间，可应用数个冲洗工序如充水到流体隔间中、施加负压或真空以将盒固定和稳定到破碎仪器的侧壁上。这将在下文中更加详细地描述。
[0028]根据本发明的另一示例性实施例，流体隔间包括开口且其中盒和破碎仪器分别适合以流体隔间的开口被不透流体地密封的方式建立流体隔间的封闭。
[0029]从而，通过破碎仪器的侧壁限定了开口，所述侧壁例如可成形为管。侧壁的轮廓可形成如从以下图片描述中获得的开口的边界。
[0030]从而，开口通过将盒放置、插入和/或结合到破碎仪器中来封闭。例如，盒可通过滑动来结合。因此，滑动组件如滑动导轨或轨道可通过盒和/或破碎仪器提供。然而，利用同时或随后施加的负压把盒布置到破碎仪器的外壳的侧壁上也是可行的。
[0031]根据本发明的另一示例性实施例，该装置进一步包括在盒和破碎仪器之间的密封层。
[0032]密封层可以是如PDMS或橡胶材料的可弹性变形的柔性层。其他聚合物或非聚合物材料也可使用。密封层可以是破碎仪器的一部分，可以是盒的一部分和/或可以是分离的第三物理元件。在一示例性实施例中，柔性密封层可以固定在盒上且可以作为隔膜以致动流体。这样的柔性橡胶层可设在盒的底部。
[0033]根据本发明的另一示例性实施例，盒包括泵，其中泵适合于泵送流体进入流体隔间。
[0034]根据本发明的另一示例性实施例，破碎仪器包括液体入口且盒包括溢流通道。
[0035]该示例性实施例例如可从图2看出。盒与破碎仪器一起建立了流体腔室，设置该流体腔室以将超声波能量从换能器传送到样本。因此，液体可通过液体入口从破碎仪器的外部运送进入流体隔间。就溢流或排出通道而言，已经定位在破碎仪器的顶部上的盒提供这样的通道。因此，破碎仪器和盒组合在一起建立了全处理容积以便能提供如DNA破碎的破碎。
[0036]根据本发明另一示例性实施例，装置包括温度探针，其中温度探针位于样本隔间处或位于流体隔间中。
[0037]根据本发明另一示例性实施例，装置包括密封层，所述密封层是挠性隔膜，其中挠性隔膜提供流体隔间的空间封闭。此外，挠性隔膜适合于当换能器发射超声波时，即当挠性隔膜被来自超声波换能器的超声波福射时致动包含在样本隔间中的样本。样本和下部的液体可保持良好热接触。此外，在样本隔间中的样本流体和在流体隔间中的流体之间的声阻抗和没有这样的隔膜的情况下相比可能不会显著变化，所述在流体隔间中的流体直接接触换能器。换言之，根据本发明的样本腔室可直接悬挂在流体隔间中。
[0038]换言之，挠性隔膜适合于通过超声波或气动力上下移动以便致动样本。值得注意的是，挠性隔膜的该移动部分可以是在盒的与样本隔间分离的一部分中。换言之，该装置适合于以该方式使得样本通过垂直或基本上垂直于流体被加压的方向移动的挠性隔膜而沿着盒移动。因此，样本可通过利用不同类型的可能的力平移挠性隔膜被运送到样本隔间。
[0039]因此，在超声波不能推动挠性隔膜进入样本隔间的情况下，挠性隔膜可延伸到特定程度以便提供复位力。因此，密封层适合作为盖来封闭液体隔间。由于挠性隔膜作为致动组件的第二个并行功能，当其可移动地定位在盒和超声波仪器之间时，挠性隔膜能够施加机械压力到样本。
[0040]根据本发明的另一方面，提供了用于通过超声波破碎在样本中的分子的破碎仪器。仪器包括超声波换能器、流体隔间，其中流体隔间包括开口。根据本发明下述的一方面，破碎仪器适合于接收盒。从而，盒包括样本。此外，破碎仪器适合于在接收盒之后与盒组合而建立流体隔间的开口的整个的空间封闭。
[0041]根据本发明的另一方面，展示了用于通过超声波破碎样本中的分子的盒。盒包括样本隔间，所述样本隔间包含带有分子的样本。此外，根据本发明前述的方面，盒适合于插入破碎仪器。盒适合于在插入盒之后与破碎仪器组合而建立破碎仪器的流体隔间的开口的整个的空间封闭。
[0042]换言之，通过组装盒和破碎仪器，提供了用于破碎的可行的且工作的装置。
[0043]根据本发明另一方面，展示了提供用于破碎在样本中的分子的超声波装置的方法。方法包括提供包括破碎仪器、盒和流体隔间的装置的步骤。从而，流体隔间可通过破碎仪器或通过盒来构成。流体隔间也可以是随后被固定到破碎仪器或盒中之一的分离的物理元件。盒包括与流体隔间空间上分离的样本隔间。方法进一步包括放置盒到破碎仪器上的步骤。从而，作为该方法的第三步骤的此步骤导致流体隔间的封闭。
[0044]当流体位于如用于温度调节的一次性物品的外部时，该方法也可视作可用在其他应用领域的接合方法。
[0045]根据本发明的另一示例性实施例，该方法进一步包括在盒和破碎仪器之间施加负压的步骤，并且还提供通过负压将盒朝向仪器抽吸的另外的步骤。如果需要，可在破碎仪器和盒之间提供密封层。
[0046]根据本发明的另一方面，盒包括作为挠性隔膜的柔性层。
[0047]挠性隔膜可如此设置使得没有超声波能量被吸收。作为示例，可以使用100微米的薄隔膜。相比于如1.7MHz超声波在充满流体隔间的水中的_波长，这个厚度是薄的。因此盒的挠性隔膜不会吸收很多。因此，薄的隔膜是希望的。如果隔膜在盒中用作致动和密封层，则隔膜的厚度可以是90 — 100微米。
[0048]换言之，盒可在其中具有两个选项。样本隔间102的底层可由硬塑料材料制成或其可由柔性隔膜形成。为了能减少柔性隔膜的厚度，本发明可确保超声波焦域很好地位于样本隔间中，从而远离挠性隔膜。
[0049]因此，通过超声波和借助于放置在样本和换能器之间的作为盒的样本隔间的壁的挠性隔膜可实现样本的混合工序。
[0050]可看到本发明的主旨是提供包含样本的盒和破碎仪器，其中盒适合于封闭仪器的流体隔间的方式使得超声波可穿过流体隔间朝盒传播并处理待被破碎的分子。盒和破碎仪器的组装可通过施加负压来建立，以便把盒抽吸到破碎仪器的外壳的边上。可设置柔性密封层以便防止流体从流体隔间泄漏。
[0051]本发明的这些和其他特征参考下文中描述的实施例将变得显而易见和清楚。
【专利附图】

【附图说明】
[0052]将在下面附图中描述本发明的示例性实施例。
[0053]图1示意性地示出根据本发明的装置的尺寸和现有技术的装置的尺寸的对比。
[0054]图2示意性地示出根据本发明示例性实施例的装置。
[0055]图3示意性地示出根据本发明示例性实施例的盒的横截面。
[0056]图4示意性地示出密封层的俯视图。
[0057]图5示意性地示出根据本发明示例性实施例的盒的横截面的俯视图。
[0058]图6示意性地示出根据本发明另一示例性实施例的装置。
[0059]图7示意性地示出采用根据本发明示例性实施例的装置进行试验的参数表。
[0060]图8和9示出采用本发明破碎DNA的试验结果。
[0061]图10示出采用现有技术的仪器获得的结果。
[0062]图11示意性地示出用在本发明示例性实施例中的超声波换能器。
[0063]图12示意性地示出根据本发明示例性实施例方法的流程图。
[0064]图13示意性地示出可与本发明组合使用的微流体盒、气动接合板和气动仪器。
【具体实施方式】
[0065]图1示出了根据本发明用于通过超声波破碎样本中的分子的装置100和现有技术的装置200之间的尺寸对比。能够清楚看到如将在下面的说明中清楚描述的本发明达到了尺寸减小。
[0066]尤其由于以下原因，根据本发明的装置的总体尺寸相对于现有技术可以减小。其内部满足用于破碎的压力条件的有效体积可和样本隔间的体积进行对比。举例带有大约2cm直径的小PZT换能器可被使用。换能器例如可具有圆形形状。来自压电换能器的声能可聚焦在直径为2-3mm且长度为5mm的笔状体积上。如果需要，DNA含量的浓缩或稀释步骤可在破碎程序之前在盒上的分离腔室中执行。因此，根据本发明的盒可包括至少一用于在破碎样本前制备样本的额外隔间。因此，用于DNA破碎的较大的含水试样的需求显著减小或甚至消除，这是本发明的一个例子。如果需要破碎大体积的样本，那么样本可循环穿过声波的焦点。
[0067]现有技术中使用了大得多的装置，如图1附图标记200所示。不同在于现有技术使用几乎比本发明上下文提及的换能器大一个数量级的换能器。现有技术中，大约200iU的较大体积的含水试样通过主动移动换能器的焦点和增加入射功率来处理。与换能器尺寸成比例的更高的能量需求结合每次运转更长的处理时间决定用于温度控制和电子单元的仪器的高档。这些是现有技术的缺点。
[0068]图2示意性地示出用于通过超声波破碎在样本101中的分子的装置100。所述装置包括盒102，盒102在此作为平面微流体盒示例性示出。装置进一步包括破碎仪器103，所述破碎仪器103提供超声波换能器104。装置进一步包括流体隔间105，实施例中的所述流体隔间是破碎仪器103的一部分。盒包括样本隔间120，具有待处理的分子的样本容纳在样本隔间中。能清楚地知道流体隔间105与样本隔间120空间上分离以便于防止样本和填充在隔间105中的流体混合。此外，当盒和破碎仪器组装在一起时，盒和破碎仪器以建立流体隔间105的空间封闭的方式装配在一起。此外，图2所描绘的密封层109放置在盒和破碎仪器之间。密封层包括用于能在破碎仪器和盒之间施加负压的孔IlOa和110b。破碎仪器包括带有一个构造负压通道或真空通道的槽111的侧壁108。所示装置100适合于通过槽111施加负压以便将盒102抽吸到破碎仪器的侧壁108或边上。因此，建立了不透流体的密封且虚线描绘的开口 106被整个封闭，并且与空间环境分离。
[0069]换句话说，提供了用于与盒一起工作的具有密封接口层的超声波(剪切)单元，所述盒保持有待被剪切的材料。
[0070]换句话说，通过将盒置于破碎仪器的顶上，开口被关闭或从周围划界或者从周围分离。这可通过例如将盒滑动到破碎仪器上来完成。此外，破碎仪器包括液体入口 112且盒包括溢流通道113，使得流体隔间105的冲洗和排出成为可能。图2的横截面图清楚示出了只有当流体隔间105的容积被盒组件封闭时，通过从换能器104发射出的超声波对样本101的处理才是可行的。
[0071]可以看出，超声波换能器放置在破碎仪器的底部，所述破碎仪器可由在超声波处理期间经得起温度和机械应力和/或张力的塑料、玻璃或其他材料制成。在短持续时间的实验中，PMMA或聚碳酸酯是可选材料。同样，可以使用合成材料以便最佳匹配上述要求。换能器104具有接近IMHz的运行范围使得声波波长与样本隔间120的尺寸有可比性。换能器可以是l_2cm的尺寸。取决于几何结构，换能器在水中的焦距是4-5cm。水入口 /出口112可连接到双向微型泵。该微型泵(未示出)也包括在本发明中。如图2所示，样本隔间120位于盒102中央使得其位置和换能器104的焦体(focal volume) 一致。样本隔间的容积具有50到IOOii I之间的容积范围，例如4mmX5mmX5mm。
[0072]因此所示装置和所示破碎仪器、盒和方法能够通过超声波以期望的可再现性破碎DNA到期望的长度。
[0073]如图2所示，提供了用于将盒102与破碎仪器103的接合的独特解决方案。由于无需主动冷却，所以改进了分子的破碎。通过控制两个因素的组合来消除对主动冷却的需求。第一个因素是在样本水平(sample level)处转换成热的声能。第二个因素是该能量被沉积的时间。需要提及的是，声波的振幅必须足够大，以满足用于气泡成核和随后针对所使用的样本的空化处理的最佳条件。为了纯的脱气水，声波的振幅应当对应于103W/cm2的声强级别。在我们的样本换能器构造中，通过施加占空比(duty cycle)获得声能的最佳传递，使得样本不超过阈值温度。在换能器和样本之间的水的量足够吸收来自样本水平和换能器的热。在处理的末尾，为了下个样本，水可以最终排出。
[0074]用于上述说明的原因，本发明提供了比当前商业化的产品更紧凑的产品。
[0075]如果需要，传感器可设在溢流通道的顶上以在利用流体加载细胞期间向泵提供反馈。窗口可设在盒的顶上以提供可视途径。如果要评估反应的动力学，则这是该装置的重要特征。另外，颜料可引入样本流体以便监测温度或混合和/或破碎的程度。
[0076]从图2可看出本发明示例性实施例示出了破碎仪器，其包括带有至少一个槽的侧壁，其中装置适合于通过所述槽施加负压。此外，盒和破碎仪器分别适合使得盒可被抽吸到破碎仪器的侧壁上从而建立流体隔间的封闭。
[0077]此外图2的密封层包括用于在破碎仪器和盒之间能施加负压的孔。
[0078]因此，在组装状态下，盒通过负压被朝向破碎仪器抽吸，负压由破碎仪器施加且被引导通过密封层的孔以便机械地吸引作用在盒的表面上。密封层的孔可与破碎仪器的侧壁和/或边的槽匹配，使得负压被从槽穿过密封层引导至盒的表面。
[0079]在通过将盒和超声波仪器组装在一起而建立不透流体的密封后，空间105被填充有流体，例如水。且反之亦然，在取出盒之前，腔室105中的至少一些水被移除。
[0080]换句话说，大体平面的盒提供了可与例如可成形为管的破碎仪器的边机械接触的平坦表面。如果提供了不透流体的密封，则密封层与负压一起通过抽吸和/或按压盒到破碎仪器的外壳的边上来防止流体泄漏出流体隔间。随后，超声波处理可开始以便破碎分子到期望尺寸或长度。
[0081]图3示出了盒102，其包括样本隔间120，其上面设有光学窗口 116以便用户获取视觉途径。盒设置有提供密封层109的柔性接触层。该密封层也可从下面的图4获得。从其可知密封层109包括几个孔110a，110b，110c，IIOd以便能够将负压从破碎仪器(未示出)引导至盒102的表面。图3的盒102还包括溢流通道113。从图4可看出，密封层具有圆形形状且在中央具有开口 123。盒可具有长方形或方形形式，但是圆形形式或其他形式也是可能的。
[0082]提供了位于在盒和如流体隔间(参见图2或图6)的边之间的密封层109以便建立不透流体的密封。此外，该层可提供保持样本相对于超声波换能器的焦点处于适当位置的特征。当密封层阻止流体隔间的液体泄漏时，在试验处理期间没有空气进入流体隔间。因此，在超声波处理期间声波模式保持恒定且因此通过密封层提供了高可靠性。因此，当通过置于密封层中的孔与置于破碎仪器的边上的通道槽组合来施加真空或负压时，实现了密封。试验观察报告显示了这是一种适合于带有能够在制作流程、处理期间或由于局部温度变化而弯曲的塑料表面的盒的有效方法。
[0083]图5是所给的盒102的俯视图。虚线指示的是溢流和通气通道113。此外，调节标记和/或凹口 121置于盒上以便使盒的样本隔间相对于破碎仪器(未示出)的超声波换能器(未示出)的对准容易。
[0084]图6示出用于通过超声波能量破碎样本中的分子的装置100的另一示例性实施例。图6描述了通过换能器104发射的聚焦的超声波能量束118。和图2相比，液体入口112基于破碎仪器103的底部107。比图2更进一步地，光学窗口 116通过盒102提供以便提供光轴。此外，描绘了温度探针115，其中温度探针位于样本隔间处和位于流体隔间中。图6进一步示出流体隔间包括由虚线描述的开口 106，其中由于通过槽111和密封层109的孔IlOa施加的且因此起作用为盒102的表面上的拉力的负压，开口被不透流体地密封。盒进一步包括溢流通道113及该通道内的阀114。阀114是盒的一部分以便当例如盒被充满时封闭水池。这些阀可以是气动可寻址的阀。可选地，这些阀也可由可透气疏水隔膜组成，所述可透气疏水隔膜例如可由Gore Tex材料组成。为了保护外部真空泵，装置任选地具有收集任何溢出水或泄露进真空通道的水的容器。
[0085]关于气动可寻址的阀，本领域技术人员可没有过多负担地利用从W02011048521A1得知的用于带并联气动接口的微流体盒的技术。因此，本发明的盒可包括三维流体通道，其中流体通过气动仪器的气动泵来运送。此外，微流体盒可包括挠性隔膜，其中挠性隔膜跨越平面且其中挠性隔膜建立盒的外表面。另外三维流体通道通过盒的内壁和通过挠性隔膜在三维上进行空间限定，其中，当没有压力或真空施加到挠性隔膜时，挠性隔膜处于基态(ground state)。当盒置于并联气动接合面板上时，挠性隔膜可从基态与挠性隔膜的平面垂直地沿两个方向气动偏转。换言之，流体不是沿着平坦表面传送而是沿着三维液体通道移动。此外，挠性隔膜可以在作为盒的外表面的一部分的区域内气动地偏转。换句话说在是盒的外表面的一部分的第一区域内，挠性隔膜跨越流体通道。根据该示例性实施例，挠性隔膜可另外延伸到盒的外表面下方的第二区域，使得在该第二区域中隔膜不能从盒外部接近。此外，“挠性隔膜的基态”描述了既没压力也没真空施加于挠性隔膜的情况。从该情况开始，挠性隔膜能够朝盒的内部偏转且也能够远离盒偏转。在此实施例或任何其他实施例中例如可以是一次性盒的该盒允许通过在气动仪器盒和盒之间的可逆的气动互连来实施的气动致动，所述互连通过挠性隔膜形成。为了盒的低成本和可靠解决方案，气动驱动器被集成在仪器中。包含在盒内的流体通道中的流体的致动通过附接至盒的主要表面的挠性隔膜的偏转来实现。因此当盒附接或插入气动接合面板时，隔间通过盒的挠性隔膜和气动接合面板的多个部分形成。可通过分离的气动仪器产生的在这些隔间中的压力决定挠性隔膜的偏转，所述挠性隔膜又致动通过其产生移动的流体。该移动也可用做阀功能。该微流体盒采用了气动致动的高功率和大冲程同时保持盒简单且低成本并且允许容易地引入经过接合面板的其他物理输送(如热或声学振动)的优点。可以看到，在微流体盒中提供的阀的本质特征是实现或停止/阻止盒中流体通过气动仪器的致动。气动驱动利用柔性盒隔膜且在隔膜下面的气动腔室能可逆地组装的事实是很重要的。这意味着，在盒和气动仪器之间的分离平面与气动腔室交叉。上面描述的特征将参考图13以更详细的方式描述，所述特征可以是根据本发明的装置的一部分，和/或可以是本发明的盒的一部分和/或可以是本发明的破碎仪器的一部分。
[0086]此外，在图6中，提供了在通道之上且接近盒的边缘的窗口 117，其中该窗口适合于提供流体探测。密封层109可以是PDMS。当盒和破碎仪器组装在一起时，边111提供了真空通道以便建立流体隔间的空间封闭。通过高度信息119可看出，作为示例性实施例，该装置制造成具有4.5cm的高度。此外，盒可包括泵(未示出)，以将水泵送到流体隔间中。
[0087]图6中示出其提供了用于将超声换能器与微流体盒机械联接的解决方案的装置。这通过在盒和包含换能器的空腔的壁之间使用软橡胶类接合来实现。可以使用该解决方案在封闭的(一次性)盒中破碎DNA分子。以这种方式破碎的DNA分子的平均尺寸分布可以通过调节由超声波换能器产生的声波的振幅和通过占空比来控制。在DNA分子的破碎期间，不需要主动冷却单元。
[0088]图7示出了采用测量持续时间和温度变化为入口的测量的参数表。
[0089]图8和图9提供了采用关于图6描述的装置获得的试验结果。这些结果在此描述以便证实通过本发明装置获得的有效的DNA破碎。该装置的示例性实施例具有4.5cm的高度和约Icm2的横截面。因此，在4.5cm3的体积下，这样的DNA破碎在不需要主动冷却的情况下实现。这些结果证明了集成遵循如上下文描述的原理的超声波破碎的潜力。
[0090]对于图8和9的结果，进行以下实验计划。使用的换能器在1.7MHz下运行且连接到宽带功率放大器ENI(50dB)。RF放大器具有IVems的最大输入电压和50 Q的输入/输出阻抗。通过信号发生器(function generator)提供输入电压,其中每次粹发(burst)的循环数目和猝发长度(burst period)被调节。值得注意的是，尽管在所示试验中使用的电源相当大从而提供所需的灵活性，但是驱动电子器件的小得多的印迹区是可行的。使用的换能器如图11所示。
[0091]选择585 u s的猝发长度，其中在1.7MHz下每次猝发200个。输入电压为800mVMS。在图7所示的表中，指示了处理的持续时间和在换能器附近的温度测量结果。可看出的是，对于试验的持续期间，温度没有超过使得运行变化的临界值。而且在样本隔间中获取的温度测量结果(在此未示出)没有超过70°C。样本容积为lOOiil，其中初始核酸浓度为65ng/Ul0因此结论是对于所提出的破碎工序不需要主动冷却。
[0092]在处理工序之后，样本通过凝胶电泳进行分析。使用商业化梯(ladder，也称分子量标准)以便将从像素(Pixel)起的迁移距离确定为以bp计的分子长度。可以看出的是在这些操作条件下，Lavg = 200bp可被获得，这由于上述需求而成为本发明的优点。
[0093]在图8中，由本发明破碎的DNA分子的尺寸分布在图表700中不出，从而分子长度在横轴701上示出，且数目在纵轴702上描绘。
[0094]在图9和图10两图中示出了图表800和900，其中分子长度分别通过横轴801和901描述。纵轴802和902示出了在任意单元中使用的超声波强度。
[0095]图9和图10之间的比较描述了根据本发明的装置和/或方法获得的尺寸分布结果即图9和利用现有技术获得的尺寸分布结果即图10之间的对比。依赖时间的测量顺序在如上指出的类似工况下执行。采用现有技术装置执行的处理以相同时间间隔进行(利用仪器面板指示的18W的功率输入和20%的占空比进行5分钟)。值得注意的事实是改变温度不会显著地改变处理的输出。这可以在经典的成核理论中得到理解，其中气泡成核被描述为遵循玻尔兹曼统计。图9和10中显示的数据已经采用具有处理之前相同的初始DNA浓度和用于执行电泳测量的相同条件的样本获得。在两种测量中，使用相同的暴露时间。
[0096]图11显示了带有外壳1001、电源线1002以及电路1003的换能器104。
[0097]图12示意性地描述根据本发明实施例的方法的流程图。用于提供用于破碎在样本中的分子的超声波装置的所示方法包括提供包括破碎仪器、盒和流体隔间的装置的第一步骤。该第一步骤用SI表示。第二步骤S2是将盒放置在破碎仪器上。从而盒包括样本隔间，所述样本隔间与流体隔间空间上分离。所示第三步骤S3通过将盒放置在破碎仪器上引起流体隔间的封闭。
[0098]如果需要，方法也可包括一个或多个以下步骤。在盒和破碎仪器之间施加负压，以及通过负压将盒朝仪器抽吸。
[0099]此外，如果需要，方法也可进一步包括在盒和破碎仪器之间提供密封层和通过施加负压基本上不透流体地密封流体隔间的步骤。
[0100]在另一个示例性实施例中，方法可包括打开在盒中的通道的阀，将液体传送到液体隔间中，关闭该阀，产生超声波从而破碎在样本中的分子，打开该阀和从液体隔间排出液体的步骤。
[0101]此外本发明的替代示例性实施例可以是如下采用超声波处理分子如DNA的方法:将盒放置在破碎仪器的流体隔间的顶部上。例如这可通过滑动来完成。进一步，施加真空以便提供密封效果，打开在装置的顶部处的阀并泵送液体到流体隔间中。进一步，当水到达用来流体感测的窗口时，停止泵送的步骤。随后根据期望计划可以执行给超声波换能器通电。下一步可以打开在装置顶部的阀以允许从流体隔间排出流体。进一步，通过使由泵产生的流反向来将流体从流体隔间排出的步骤。进一步，停止真空泵是可选步骤。这是DNA破碎的末尾。
[0102]功率输出计划取决于初步试验。换能器可被通电使得参数像占空比和每周期的循环数可以变化。
[0103]图13示出了盒1100，其以下述方式与例如类似图6的破碎仪器的破碎仪器(图13未示出)装配在一起,所述方式指当盒和破碎仪器组装在一起时建立了破碎仪器的流体隔间的空间封闭。图13在上部分示出了第一阶段中用于在微流体盒1100内的流体致动的系统1121，其中图13的下部分示出了第二状态下的系统1121，其中在盒中容纳的流体1104已经被传送。所示的上部分和下部分的两个系统1121由相同元件组成。
[0104]此外，图13示出了用于插入气动仪器的并联气动接合面板1101中的微流体盒1100，其中盒包括流体1104被在其中传送的三维流体通道1103。这样的并联气动接合面板1101可以例如是破碎仪器(未示出)的一部分。然而，并联气动接合面板也可以是与盒和破碎仪器物理分离的组件，但是可以是能够集成到后者中的一个中的。此外，盒1100包括挠性隔膜1105，其中挠性隔膜跨过一个平面。该平面沿着1107方向扩展。此外，挠性隔膜构造了盒的外表面，其中通过盒的壁和通过挠性隔膜空间地限定了流体通道。此外，当没有过压、负压或真空被施加到挠性隔膜时，挠性隔膜处于放松状态。挠性隔膜能够从放松状态垂直于挠性隔膜的平面沿两个方向气动偏转。换言之，隔膜1105可首先沿向上取向且其次沿向下取向被沿着方向1106引导。
[0105]此外，可以看出挠性隔膜在几个点1109和1110通过气动泵送1108偏转。从而气动泵送意味着施加过压和/或负压到在气动腔室如1137中的隔膜。外部气动仪器1102可产生这样的气动泵送1108。外部气动仪器1102可以是破碎仪器(未示出)的一部分但也可以是外部装置。通过在气动接合面板1101内的两气动通道1122和1123处施加相应的负压，挠性隔膜1105被抽吸到这些气动通道上方的凹部。通过改变气动接合面板的气动通道内的压力情况，如图13的下图所示，挠性隔膜被在盒的中间气动通道处被朝向盒的内侧按压。另外，负压被在气动通道1138处施加在右手侧上使得流体被在流体通道内从图13的左手侧传送到图13的右手侧。该机械原理尤其可以用在图1和图6所示装置中。
[0106]从图13可看出，当接合面板被插入仪器1102时，接合面板具有朝向仪器的仪器侧1119。此外，当盒插入接合面板时，接合面板具有朝向盒的盒侧1120。设置气动通道1122，1123和1138以将气动流体如空气从仪器侧连接到盒侧以便能够气动驱动微流体盒的挠性隔膜。凹部1124到1126允许挠性隔膜被抽吸到凹部中。从图13的下部分可看出，在中间气动通道1122内，隔膜封闭流体通道以提供在流体通道内的阀1114。
[0107]通过应用这样的方法以及随后以相应方式施加过压和/或负压，流体能够在微流体盒内从流体通道的开始1112传送到流体通道1113的末尾。
[0108]可以看出，接合面板的盒侧具有带有凹部和气动通道的阶梯状表面，当以横截面观察气动通道和凹部时，所述凹部和气动通道以类似于T形的方式形成。
[0109]换言之，该实施例提供了一种盒，所述盒包括覆盖流体路径的外部挠性隔膜。在盒插入仪器后，隔膜通过仪器的气动力学而局部偏转使得流体沿着流体路径移动。这能用于传送样本120到图1和6所示盒102的样本隔间101中。隔膜可被局部抽离或推向盒，从而在是用于样本的流体通道的流体路径中且在隔膜作用下产生变化容积。因此，流体被通过盒传送。盒可包括壁，所述壁和挠性隔膜一起限定流体被传送通过的变化容积。
[0110]值得注意的是，本发明示例性实施例是参考不同的主题来描述的。尤其是，一些示例性实施例参考产品型权利要求来描述，然而一些不例性实施例参考方法型权利要求来描述。然而，本领域技术人员将从上述及以下描述中得知，除非特别说明，除了属于一种类型的主题的特征的任何组合之外，涉及不同主题的特征之间，特别是产品型权利要求的特征和方法型权利要求的特征之间的任意组合也被认为在本申请中公开。然而，可组合所有特征从而提供大于特征的简单相加的协同效果。
[0111]尽管本发明在附图和先前说明书中已被说明和描述，但是这样的说明和描述被认为是说明性的或示例性而不是限制性。本发明不限于公开的实施例。公开的实施例的其他变化可由本领域技术人员在实践所要求保护的发明时从附图、公开和从属独立权利要求的研究中被理解和实现。
[0112]权利要求中，“包括” 一词不排除其他元件或步骤，且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。单个处理器或其他单元可执行权利要求中列举的几个物品的功能。仅在相互不同的从属权利要求中列举的措施的事实不意味着这些措施的组合不能被利用以便有益。权利要求中的任何附图标记不应当被认为是限定了范围。
【权利要求】
1.一种用于通过超声波破碎在样本(101)中的DNA或核酸的装置(100)，所述装置包括: 盒(102)， 带有超声波换能器(104)的破碎仪器(103)， 其中所述破碎仪器被构造用于通过超声波破碎DNA或核酸， 流体隔间(105)， 其中所述盒包括样本隔间(120)，所述样本隔间用于包含带有分子的样本， 其中所述流体隔间与所述样本隔间空间分离，并且 其中当所述盒和所述破碎仪器组装在一起时，所述盒和所述破碎仪器以建立所述流体隔间的空间封闭的方式装配在一起。
2.根据权利要求1所述的装置， 其中所述盒具有平面形状，并且 其中所述破碎仪器具有容器状形状。
3.根据权利要求1或2所述的装置， 其中所述流体隔间包括开口(106)，并且 其中所述盒和所述破碎仪器分别适合于以所述流体隔间的开口被不透流体地密封的方式建立所述流体隔间的封闭。
4.根据上述权利要求之一所述的装置， 其中所述流体隔间由所述破碎仪器构成， 其中所述流体隔间包括底部(107)和至少一个侧壁(108)，并且 其中所述流体隔间包括与所述底部相对的开口(106)。
5.根据前述权利要求之一所述的装置，所述装置进一步包括: 在所述盒和所述破碎仪器之间的密封层(109)。
6.根据权利要求5所述的装置， 其中所述密封层包括能够在所述破碎仪器和所述盒之间施加负压的孔(110a、110b、IlOcUlOdO o
7.根据前述权利要求之一所述的装置， 其中所述破碎仪器包括带有至少一个槽(Ul)的侧壁(108)， 其中所述装置适合于通过所述槽施加负压，并且 其中所述盒和所述破碎仪器分别适合使得所述盒能够被抽吸到所述破碎仪器的侧壁从而建立所述流体隔间的封闭。
8.根据前述权利要求之一所述的装置， 其中所述破碎仪器包括液体入口(112)，并且 其中所述盒包括溢流通道(113)。
9.根据权利要求5所述的装置， 其中所述密封层是挠性隔膜， 其中所述挠性隔膜提供所述流体隔间的空间封闭，并且 其中所述挠性隔膜适合于当所述换能器发射超声波时致动包含在所述样本隔间中的样本。
10.一种提供用于破碎在样本中的DNA或核酸的超声波装置的方法，所述方法包括步骤: 提供包括破碎仪器、盒和流体隔间的装置(SI)， 其中所述破碎仪器被构造用于通过超声波破碎DNA或核酸， 其中所述盒包括与所述流体隔间空间分离的样本隔间， 将所述盒放置到所述破碎仪器上(S2)，以及 从而引起所述流体隔间的封闭(S3)。
11.根据权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括步骤: 在所述盒和所述破碎仪器之间施加负压， 借助于所述负压将所述盒朝向所述破碎仪器抽吸。
12.根据权利要求10或11之一所述的方法，所述方法进一步包括步骤: 在所述破碎仪器和所述盒之间提供密封层， 通过施加所述负压来大致不透流体地密封所述流体隔间。
13.根据权利要 求10到12之一所述的方法，所述方法进一步包括步骤: 打开在所述盒中的通道的阀， 将液体传送到所述流体隔间中， 关闭所述阀， 产生超声波从而破碎在所述样本中的分子， 打开所述阀，以及 从所述流体隔间排出液体。
【文档编号】C12M3/08GK103764292SQ201280028118
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年6月5日 优先权日:2011年6月6日
【发明者】C·B·克劳斯, J·M·J·登东德, R·彭特曼, P·J·范德扎格 申请人:皇家飞利浦有限公司