一种原位合成的纳米金比色法检测脂肪酶酶活的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学领域，具体涉及一种原位合成的纳米金作为信号元件，吐温既作为脂肪酶的底物又作为原位合成的纳米金的保护剂的检测脂肪酶酶活的化学比色法。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一种长链三酰基甘油酯水解酶，只能在异相或有机相中作用，其主要催化酯化、水解、氨解和酯交换等反应，已经被广泛应用于食品、洗涤齐U、皮革、纺织品、化妆品、造纸与制药等诸多工业领域。随着脂肪酶应用领域不断拓宽，因而建立一种成本低、操作简单、方便快捷的检测脂肪酶酶活的方法显得尤为重要。
[0003]众所周知，检测脂肪酶活性的方法很多，如滴定法、光谱法、色谱法、放射法、界面张力测量法、浊度法、电导法和免疫化学法等，其中最为常用的是滴定法和光谱法。滴定法是通过定量从三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯和橄榄油中释放出的游离脂肪酸的一种检测脂肪酶活性的方法。在光谱法中，检测脂肪酶活性主要使用的底物是对硝基苯基棕榈酸酯(P-NPP)，利用它水解的有色产物-对硝基苯酚在410nm处进行光谱检测，从而间接定量脂肪酶活性。这两种方法所使用的底物都需要乳化，乳化剂的加入会影响酶活的测定，且都受到PH范围的限制。另外，利用p-NPP的光谱法虽然操作简单快速，但是p-NPP试剂昂贵且灵敏度不高，所以此法不能广泛地作为检测脂肪酶标准的试验方法。
[0004]目前，基于原位构建纳米探针用于目标物的检测越来越受到关注。CarlosBendicho等人利用原位合成的碳量子点来检测甲基萊，Mehmet Bayindir等人基于原位形成的聚多巴胺纳米颗粒来传感多巴胺，Apurba K.Das等人采用原位合成的纳米金来定量碱性磷酸酶等等。这种方法同时实现了纳米探针的构建和目标物的传感，简化了操作步骤，并且具有较好的选择性和灵敏度。
[0005]现有技术未公开基于原位合成的纳米金比色法检测脂肪酶酶活的技术方案。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种基于原位合成的纳米金用于检测脂肪酶的简单、廉价、有效和可视化的分析法。此方法利用吐温自氧化产生过氧化氢的特点，将氯金酸还原成纳米金作为显色信号元件，同时吐温既作为脂肪酶的底物又作为原位合成的纳米金的保护剂。
[0007]本发明在解决上述技术问题所采用的技术方案如下:
[0008]一种原位合成的纳米金比色法检测脂肪酶酶活，具体包括如下步骤:
[0009](I)分别向2mL A、B离心管中加入吐温溶液；
[0010](2)向步骤(I)中得到的A、B离心管溶液分别加入缓冲溶液进行pH的调节；后向B离心管加入待测脂肪酶溶液，A离心管不需要加入待测脂肪酶溶液；混匀，调节反应温度；可通过调节待测脂肪酶溶液反应的时间，得到一定时间后检测溶液的紫外可见光谱，以Λ A530为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线；
[0011](3)向步骤(2)中得到的A、B离心管溶液加入氯金酸溶液，混匀，调节反应温度和时间；在A离心管中，不存在待测脂肪酶溶液，吐温溶液仍然保持它的原始胶束结构，所以吐温溶液的自氧化发生在胶束相内，在B离心管中，存在待测脂肪酶溶液，吐温溶液的胶束结构遭到破坏，吐温溶液依然可以发生自氧化，但是这一过程发生在胶束相外，其反应速率和机理存在不同，因此，当加入氯金酸溶液时，会形成不同颜色的纳米金溶液，然后进行紫外检测，以吸光度作为纵坐标，波长为横坐标，绘制紫外吸收曲线。
[0012]本发明所述的方法，所述步骤(I)中加入吐温溶液的最终浓度为0.1% -3% (V/V)，优选吐温溶液的最终浓度为I %。
[0013]其中，所述步骤(2)中的缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，该缓冲液的浓度及具体用量为本领域技术人员所理解和掌握，具体以最终形成纳米金溶液PH值调至6-9为准，优选8.5。
[0014]其中，所述步骤⑵中待测脂肪酶溶液反应温度为30_60°C，优选45°C ;待测脂肪酶溶液的加入量为0.25-4mg/mL，优选2mg/mL。
[0015]其中，所述步骤(3)中氯金酸溶液的最终浓度为0.1-2.0mmol/L,优选1.5mmol/L ；吐温溶液和氯金酸溶液反应温度为10_40°C，优选25°C ；吐温溶液和氯金酸溶液反应时间为10_300min,优选 210min。
[0016]更具体地，本发明所述的一种原位合成的纳米金比色法检测脂肪酶酶活，包括如下步骤:
[0017](I)分别向2mL A、B离心管中加入吐温溶液的最终浓度为0.1% -3% (V/V)；
[0018](2)向步骤(I)中得到的A、B离心管溶液分别加入缓冲溶液进行pH的调节，将PH值调至6-9 ;后向B离心管加入待测脂肪酶溶液，A离心管不需要加入待测脂肪酶溶液；混匀，调节反应温度至30-60°C ;可通过调节待测脂肪酶溶液反应的时间，得到一定时间后检测溶液的紫外可见光谱，以Λ A530为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线.
[0019](3)向步骤⑵中得到的Α、B离心管溶液加入氯金酸溶液的最终浓度为0.1-2.0mmol/L，混匀，调节反应温度为10_40°C和时间为10_300min ;在八离心管中，不存在待测脂肪酶溶液，吐温溶液仍然保持它的原始胶束结构，所以吐温溶液的自氧化发生在胶束相内，在B离心管中，存在待测脂肪酶溶液，吐温溶液的胶束结构遭到破坏，吐温溶液依然可以发生自氧化，但是这一过程发生在胶束相外，其反应速率和机理存在不同，因此，当加入氯金酸溶液时，会形成不同颜色的纳米金溶液，然后进行紫外检测，以吸光度作为纵坐标，波长为横坐标，绘制紫外吸收曲线。
[0020]本发明采用吐温自氧化产生过氧化氢的特点，将氯金酸还原成纳米金作为显色信号元件，同时吐温既作为脂肪酶的底物又作为原位合成的纳米金的保护剂。在不存在待测脂肪酶溶液，吐温溶液仍然保持它的原始胶束结构，所以吐温溶液的自氧化发生在胶束相内；在存在待测脂肪酶溶液，吐温溶液的胶束结构遭到破坏，吐温溶液依然可以发生自氧化，但是这一过程发生在胶束相外，其反应速率和机理存在不同，当加入氯金酸溶液时，会形成不同颜色的纳米金溶液，然后进行紫外检测，两者吸光度的差值AA53tl的变化与脂肪酶酶活有关，因此能够用于检测脂肪酶酶活。
[0021]本发明所述的技术方案所采用的吐温，由于它的溶解性能好，作为脂肪酶的底物就无需加入乳化剂进行乳化，同时又作为原位合成纳米金的还原剂和保护剂，更加充分地简化了操作步骤，实现了纳米探针构建和目标物传感的一步化。此外，本发明基于纳米金比色法传感，可视化适用于高通量检测，原位合成的纳米金比较稳定，受到外界因素的干扰小，可用于实际体系中脂肪酶的检测，适宜推广应用。
【附图说明】
[0022]图1为(a)吐温(1% )还原氯金酸(1.5mmol/L)形成纳米金溶液(无脂肪酶)；(b)吐温(1% )还原氯金酸(1.5mmol/L)形成纳米金溶液(有2mg/mL失活脂肪酶)；(c)吐温(1% )还原氯金酸(L 5mmol/L)形成纳米金溶液(有2mg/mL脂肪酶)的紫外可见光
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[0023]图2 为分别为加入脂肪酶(a) Omin ； (b) Imin ； (c) 2min ； (d) 3min ； (e) 4min ；(f) 5min ； (g) 1min ； (h) 15min ； (i) 20min ； (j) 25min ； (k) 30min 后，吐温(I % )还原氯金酸(1.5mmol/L)形成的纳米金溶液的紫外可见光谱。
[0024]图3为脂肪酶酶活的动力学曲线。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026](I)分别向2mL A、B离心管中加入吐温溶液的最终浓度为1% (V/V)；
[0027](2)向步骤⑴中得到的A、B离心管溶液分别加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至8.5 ;后向B离心管加入待测脂肪酶溶液，A离心管不需要加入待测脂肪酶溶液；混匀，调节反应温度至45°C ;可通过调节待测脂肪酶溶液反应的时间，得到一定时间后检测溶液的紫外可见光谱(见图2)，以AA53tlS纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线(见图3);
[0028](3)向步骤(2)中得到的A、B离心管溶液加入氯金酸溶液的最终浓度为1.5mmol/L，混匀，调节反应温度为25°C和时间为210min ;在A离心管中，不存在待测脂肪酶溶液，吐温溶液仍然保持它的原始胶束结构，所以吐温溶液的自氧化发生在胶束相内，在B离心管中，存在待测脂