脂肪酶calb突变体、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体地说，设及一种脂肪酶CALB突变体、其制备方法 及应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶化ipase，甘油醋水解酶）是分解脂肪的酶。在动植物体和微生物中普遍存 在，它是一类特殊的醋键水解酶，催化如下反应：甘油=醋+水一甘油+游离脂肪酸。脂肪 酶的另一重要特征是，它只作用于异相系统，即在油（或脂）一水界面上作用，对均匀分散 的或水溶性底物无作用，即使作用也极缓慢，因此也可说脂肪酶是专口在异相系统或水不 溶性系统的油（脂）一水界面上水解醋的酶。脂肪酶是最早研究的酶类之一，从1834年兔 膜脂肪酶活性的报道至今，微生物脂肪酶研究已有上百年的历史。
[0003] 脂肪酶的微生物发酵法的应用前景优于提取法及化学合成法。目前，黑曲霉、白地 霉、毛霉等微生物来源的脂肪酶已制成结晶。来源于根霉、圆柱假丝酵母、德氏根霉、多球 菌、粘质色杆菌等的脂肪酶也得到高度提纯，并对它们的理化性质展开进一步研究。早在上 世纪60年代，由假丝酵母、曲霉、根霉等微生物产生的脂肪酶相继在日本进入商品化生产。 与此同时，我国也已开展脂肪酶的研究开发。1967年，中国科学院微生物所筛选到解脂假丝 酵母（Candidalipolytica)AS2. 1203,并于1969年制成酶制剂供应市场。近年来，随着非 水酶学的不断深入，脂肪酶的应用已远远超出了油一水界面上进行水解反应的范畴，被广 泛应用于醋合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基因保护、高聚物的合成、 肤合成等方面，应用前景十分广阔。尽管在产脂肪酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业 应用上已研究了几十年，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不 溶性、酶的来源不足、提纯困难W及应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用 与蛋白酶、淀粉酶相比逊色许多。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种脂肪酶CALB突变体、其制备方法及应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明利用基因体外定向进化策略中易错PCR技术构建基 因工程菌株获得高效生产脂肪酶的方法，其是通过在毕赤酵母中表达突变的脂肪酶基因， 然后对表达的脂肪酶进行分离纯化，获得高纯度高活力的脂肪酶。
[0006] 易错PCR技术具体如下： 阳007] (1)由产脂肪酶的克雷伯氏菌化lebsiellaSP.)扩增CALB的编码基因ca化； 阳00引似将ca化基因连接在表达质粒pPICZaA上，酶切位点为EcoRI和甜al，获得重 组质粒pPICZaA-ca化；
[0009] 做采用易错PCR技术，W重组质粒pPICZaA-ca化为模板，设计引物，扩增获得 ca化突变基因；
[0010] (4)将步骤做所得易错PCR产物及表达质粒pPICZaA用EcoRI和甜al双酶切 后连接，连接产物转入毕赤酵母X33感受态细胞，涂布于博来霉素抗性狂ecOYTO平板上， 即得构建好的重组ca化基因突变库；
[0011] (5)将YTO平板上长出的菌落逐一对应转接至含甲醇的S下酸甘油醋狂ecO平板 上，转板后将平板置于3(TC恒溫培养箱培养2地，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大 小，同时每个平板分别W原始菌和不含有脂肪酶的空载体作为阳性对照和阴性对照。
[0012] 本发明提供的脂肪酶CALB突变体，其为：1)由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列构 成的蛋白；或2)SEQIDNo. 1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且 同等功能的由1)衍生的蛋白。
[0013] 本发明还提供编码所述CALB突变体的基因，其核巧酸序列如SEQIDNo.2所示。
[0014] 本发明还提供含有编码所述CALB突变体的基因的载体、宿主细胞和转基因工程 -tt： 园〇
[0015] 本发明还提供含有编码所述CALB突变体的基因的毕赤酵母工程菌。
[0016] 本发明还提供含有编码所述CALB突变体的基因的毕赤酵母X33。
[0017] 本发明进一步提供所述CALB突变体的制备方法，将含有编码所述CALB突变体的 基因的毕赤酵母X33接种于含博来霉素的BMGY培养基中，30°C振荡培养至ODe。。为8-10时， 离屯、后收集菌体，将菌体转入诱导培养基BMMY中，3(TC诱导表达20h，离屯、后收集上清；将 上清加入到M2+-NTA树脂柱中，反复加入2~3次后，用5倍柱体积的NTA-1缓冲液洗涂介 质W去除杂蛋白，最后用NTA-2缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的脂肪酶突变体。
[0018] 其中，所述NTA-1缓冲液为含有80mmol/L咪挫的NTA-0缓冲液，NTA-2缓冲液为 含有 300mmol/L咪挫的NTA-0 缓冲液。NTA-0 缓冲液：20mMTris-肥 1 抑7. 9,0. 5MNaCl。
[0019] 本发明还提供所述脂肪酶CALB突变体在洗涂剂加工领域中的应用。
[0020] 本发明进一步提供含有所述脂肪酶CALB突变体的洗涂剂制品。
[0021] 本发明利用基因体外定向进化策略中易错PCR技术，对来源于克雷伯氏菌属 (KlebsiellaSP.)的野生型脂肪酶基因进行体外诱变，通过鉴别培养基进行筛选，获得高 效生产脂肪酶的菌株。获得的脂肪酶CALB突变体表达活性高，是野生型脂肪酶催化活性的 8. 7倍，可用于脂类水解相关行业中。通过对含有编码所述CALB突变体的基因的工程菌进 行大规模发酵，可实现脂肪酶CALB突变体的批量生产。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例2中PCR扩增脂肪酶CALB突变体基因的电泳检测结果；其 中，M为DNAMarker, 1为目的基因。 阳02引 图2为本发明实施例3中质粒pPICZaA-ca化的酶切电泳图。
[0024] 图3为本发明实施例4中CALB突变体的SDS-PAGE电泳检测图；其中，M为蛋白Marker, 1为上清浓缩沉淀蛋白。
【具体实施方式】
[00巧]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 阳0%] 实施例1构建脂肪酶CALB突变体文库
[0027] 1、由产脂肪酶的克雷伯氏菌aUebsiellaSP.)扩增CALB的编码基因ca化； 阳02引 2、将ca化基因连接在表达质粒pPICZaA上，酶切位点为EcoRI和甜al，获得重组 质粒pPICZaA-ca化；
[0029]