一种脂肪酶lipase6及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶LIPASE6及其编码基 因和应用。
【背景技术】
[0002] 手性化合物虽然原子组成是一样的，但它们的立体结构却互为镜像，在生物学和 药学性质上却相差甚远。比如L-薄荷醇具有清凉味，而D-薄荷醇则发霉味；S-天冬酰胺 是甜的，R-天冬酰胺是苦的；R型的"反应停"是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的"反应停" 对胎儿则有致畸作用，历史上曾出现使用反应停导致大规模新生儿畸形的事件。可见合成 手性药物过程中，前体原料的光学纯度是重要环节。
[0003] 手性化合物的合成主要有：（1)化学法，即利用对映体的物理和化学性质的差异 进行分离。通常有盐析法、包结法、以及组合拆分。其缺点是要求对映体之间的性质差异要 大，适用的化合物不多。（2)合成法，通过设计反应来进行手性化合物的化学合成。这种方 法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能量，而且反应中使用大量有毒的有机溶剂。（3) 色谱拆分，这种方法是利用填料对手性对映体吸附性质的差异来实现，其缺点是设备昂贵， 普及性较差。
[0004]脂肪酶（Lipase，EC 3. 1. 1. 3)，又叫作三酰甘油水解酶，是一类能够将三酰甘油水 解为甘油和脂肪酸的酶，其来源非常广泛，微生物、植物和动物中都有存在。脂肪酶作为生 物催化剂多数可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立体选择性高，不需要辅助因子， 是一种重要的手性催化剂。
[0005] 1-苯乙醇是精细化工利用中重要的骨架和中间体，在化妆品行业的香料，染料和 医药行业中都有较大的应用范围。R和S两种对映异构体各有各自的应用，R-1-苯乙醇主要 用于化妆品行业中，还可应用于变色染料、眼科防腐剂、胆固醇肠道吸收抑制剂等；S-1-苯 乙醇主要是药物合成的前体，如左旋咪唑、（S)-异丙肾上腺素、抗抑郁药物取舍林等。
[0006] 但是，大多数在工业中应用的脂肪酶都是源于进口，比如Novo Nordisk公司的 月旨肪酉每Novozym 435(来自Candida antarctica)，Amano Pharmaceutical公司的Lipase PS(来自Burkhold eriacepacia)，Fluka公司的Lipase A(来自Candida antarctica)等 等。这些脂肪酶价格昂贵，生产技术受到制约，因此开发具有自主产权的脂肪酶十分必要。
【发明内容】
[0007] 本发明的针对现有技术中脂肪酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提供一种 新的脂肪酶LIPASE6及其编码基因和应用。
[0008] 本发明从一株海洋放线菌（Marinactinospora thermotolerans)中开发了一种新 的脂肪酶LIPASE6及其编码基因lipase6,构建了含有lipase6的重组表达载体和基因工程 菌，培养基因工程菌后获得脂肪酶LIPASE6,其可应用于制备手性1-苯乙醇。
[0009] 本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶LIPASE6,其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2的 第45-297位氨基酸序列所示。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因 lipase6〇
[0011] 优选，所述的脂肪酶基因lipase6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第133-894位 碱基所示。
[0012] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipase6的重组表达载体。所述的表达 载体，优选pET28a(+)载体。
[0013] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipase6的基因工程菌。所述的基因工 程菌，优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0014] 本发明的第三个目的是提供所述的脂肪酶LIPASE6在制备手性1-苯乙醇中的应 用。
[0015] 优选，脂肪酶LIPASE6在拆分（±)-1_苯乙醇制备得到（R)-1-苯乙醇中的应用。
[0016] 进一步优选，其步骤为：取脂肪酶LIPASE6于反应介质中，再加入（±)_1_苯乙醇 和酰基供体，进行反应，得到（R)-1-苯乙醇。
[0017] 所述的反应介质，优选为1，4-二氧六环、四氢呋喃、叔丁醇、异丙醇、二氯甲烷、甲 苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种。
[0018] 所述的酰基供体，优选为乙酰乙烯酯、乙酸异丙烯酯、丁酸酐、丁酸、戊酸、葵酸和 乙酸乙酯中的一种。
[0019] 优选，脂肪酶LIPASE6在水解乙酸苏合香酯制备得到（S)-1-苯乙醇中的应用。
[0020] 进一步优选，其步骤为：取脂肪酶LIPASE6于pH为6. 0-9. 5的缓冲液中，加入乙酸 苏合香酯及其助溶剂，进行反应，得到（s)-i-苯乙醇。
[0021] 所述的助溶剂，优选为1，4-二氧六环、四氢呋喃、叔丁醇、异丙醇、二氯甲烷、甲 苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种。
[0022] 所述的缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠、磷酸缓冲液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH溶液 中的一种。
[0023] 本发明的脂肪酶基因lipase6来自深海样品中筛选得到的一株海洋放线菌 (Marinactinospora thermotolerans)，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本发明 用生物信息学分析的方法，从基因组测序的放线菌（M. thermotolerans)中得到脂肪酶基 因lipase6,全长为894bp (从起始密码子到终止密码子），编码297个氨基酸，该基因是一 个全新的脂肪酶基因，与其它脂肪酶基因序列的最大相似度为57 %。经分析序列中包含44 个氨基酸残基的信号肽，成熟的脂肪酶LIPASE6由253个氨基酸残基组成。通过克隆编码成 熟的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因lipase6并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠 杆菌BL21 (DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂肪酶LIPASE6。脂肪酶LIPASE6可 用于制备手性1-苯乙醇，利用重组表达的脂肪酶LIPASE6作为催化剂，制备得到了光学纯 度可达99 %的（R)-1-苯乙醇（得率达85 % )和光学纯度可达90 %的（S)-1-苯乙醇（得 率达65% )。脂肪酶LIPASE6在生物化工和生物医药等领域具有非常大的应用价值。
【附图说明】
[0024] 图1是不同侧链长度的对硝基苯酚酯对脂肪酶LIPASE6酶活的影响。
[0025] 图2是脂肪酶LIPASE6的最适pH及pH稳定性。其中，a为最适pH曲线图，b为 pH稳定性曲线图。
[0026] 图3是脂肪酶LIPASE6的最适反应温度和温度稳定性。其中，a为最适反应温度 曲线图，b为温度稳定性曲线图。
[0027] 图4是脂肪酶LIPASE6拆分（±)_1_苯乙醇反应产物GC图。其中，a是标样GC 图，按照保留时间依次为：1，内标十二烷；2,（S)-乙酸苏合香酯；3,（R)-乙酸苏合香酯；4， (R)-1-苯乙醇；5,（S)-1-苯乙醇；b是脂肪酶LIPASE6拆分（±)-1_苯乙醇反应36h后的 GC图；c是脂肪酶LIPASE6水解消旋乙酸苏合香酯反应24h后的GC图。
[0028] 图5是脂肪酶LIPASE6的蛋白表达纯化情况。其中，M为蛋白Marker，1为未经 IPTG诱导的含有pET-28a(+)-lipase6的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有 pET-28a(+)-lipase6的大肠杆菌BL21 (DE3)，3为Ni柱纯化后得到的脂肪酶LIPASE6。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0030] 下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生 产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径 得到。
[0031] 本发明的脂肪酶基因lipase6来自深海样品中筛选得到的一株海洋放线菌 (Marinactinospora thermotolerans)，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。
[0032] 实施例1:脂肪酶基因lipase6引物设计及开放阅读框边界确定
[0033] 提取海洋放线菌（M. thermotolerans)的基因组DNA，经16S rRNA验证无误后，交 至上海美吉生物科技有限公司测序。利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的 脂肪酶基因，确定了其中脂肪酶基因lipase6的开放阅读框，其