碱基序列如SEQ ID N0.1所 示，共编码297个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示，通过信号分析工具http:// WWW.cbs. dtu. dk/services/SignalP/，分析发现其中含有包含44个氨基酸残基的信号肽 (SEQ ID N0. 2第1-44位所示的氨基酸残基），成熟的脂肪酶LIPASE6由253个氨基酸残 基组成（SEQ ID N0. 2第45-297位所示的氨基酸残基），其对应的编码基因区为如SEQ ID NO. 1第133-894位所示的碱基序列。脂肪酶基因lipase6是一个全新的脂肪酶基因，与其 它脂肪酶基因序列的最大相似度为57%。根据分析得到的lipase6基因序列，设计不含信 号肽的引物如下：正向引物：5 ' -CACGGATCCGCCCAGGACGTCGACTACGTCGC-3 '，下划线部分 为BamH I酶切位点；反向引物：5' -CCGCTCGAGTCACACGGCGGGAACCGCTC-3，，下划线部分为 Xho I酶切位点。
[0034] 实施例2:脂肪酶基因lipase6的克隆及载体构建
[0035] 2. 1PCR 扩增
[0036]将实施例 1 设计的引物（正向引物：5 ^ -CACGGATCCGCCCAGGACGTCGACTACGTCGC-3 '，反向引物：5' -CCGCTCGAGTCACACGGCGGGAACCGCTC-3,)送至上海生物工程有限公司合 成引物，合成的引物使用TE稀释到10 yM，提取放线菌（M. thermotolerans)的总DNA作为 DNA模板，建立如表1所示反应体系：
[0037] 表1 PCR反应体系
[0038]
[0039] 使用以下PCR扩增程序扩增脂肪酶基因lipase6 :a. 95°C变性5min ;b. 95°C变性 lmin，55 ~65°C退火 0? 5min，72°C延伸 lmin20s，进行 30 个循环；c. 72°C延伸 lOmin，冷却 到 l(TC〇
[0040] 将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观 察。回收760bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20yL无菌 水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。
[0041] 2. 2 酶切
[0042] 将纯化回收的PCR产物使用以下体系进行双酶切，酶切时间lh。酶切体系为：BamH II y L，XhoIl y L，DNA〈0. 3 y g，灭菌的双蒸水加至30 y L。酶切后纯化回收得到经过双酶切 的PCR产物。
[0043] 质粒pET_28a (+)的双酶切：挑取含有质粒pET_28a (+)的大肠杆菌DH5 a单菌落， 过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamHI和Xhol按以下体系双酶切，酶切时间 111。酶切体系为：1^1]1111111]^，乂11〇1111]^，质粒0嫩〈1118，灭菌的双蒸水加至2〇11匕酶切 后纯化回收得到经过双酶切的pET_28a(+)载体。
[0044] 上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯 化回收使用核酸纯化回收试剂盒（Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，质粒提取试 剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
[0045] 2. 3 连接
[0046] 将经过双酶切的PCR产物和pET_28a(+)载体按照3 :1的摩尔比例进行连接。连 接使用的T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司，连接使用的酶量为5U/5 y L连接体 系，连接温度为22 °C，连接时间20min。
[0047] 2. 4转化及筛选
[0048] 取5 y L连接产物于50 y L大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，于42°C水浴 锅热激90s，冰浴2min后加入500 y L LB液体培养基，37°C 200rpm培养lh。培养物4000rpm 离心lmin后，弃上清400 y L，吸取余下的100 y L涂布于含50 y L/mL卡那霉素的LB平板， 培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证， 酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。
[0049] 2. 5基因核苷酸序列测定
[0050] 将获得的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与脂 肪酶基因lipasee核苷酸序列进行比对，确认是将编码成熟的脂肪酶LIPASE6 (氨基酸序列 如SEQ ID N0. 2的第45-297位氨基酸序列所示）的脂肪酶基因lipase6(其核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1的第133-894位碱基序列所示）插入到pET-28a(+)质粒中，结果完全正 确后确认得到带有编码成熟的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因lipase6的pET-28a(+)质粒 (pET_28a (+) -1 ipase6)，可用于进行下一步试验。
[0051] 实施例3 :脂肪酶基因lipase6在大肠杆菌BL21 (DE3)中的高效表达
[0052] 3. 1大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞制备
[0053] a、将大肠杆菌BL21 (DE3)接入5mL LB液体培养基中，37°C过夜摇培，250rpm;
[0054] b、按1 %的体积比的接种量将过夜摇培后的大肠杆菌BL21 (DE3)菌液接种到LB摇 瓶中，37°C摇培3h (多300rpm)，得到原培养物；
[0055] c、将摇瓶在冰水中迅速冷却至0°C，将原培养物分装至冰预冷的离心管（50mL)， 冰置数分钟；
[0056] d、4°C，4000rpm离心10min回收细胞，将残留液空干（迅速）；
[0057] e、用冰预冷的10mL 0. 1M的CaCl2重悬细胞，4°C，4000rpm离心10min回收细胞；
[0058] f、用10mL 0. 1M的CaCl^悬细胞，冰浴lh以上；
[0059] g、4°C，4000rpm 离心 lOmin 回收细胞；
[0060] 11、每5〇1^原培养物得到的回收细胞用211^含15%甘油的0&(：12来重悬，分装于 1.5mL离心管，200 yL每管。-80°C保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
[0061] 3. 2 转化
[0062] 取实施例2中得到的口￡1'-28&(+)-11口3866质粒0.5~11^与5〇1^大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42°C水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500 y L LB液体培养基，37°C 200rpm培养lh。培养物离心后涂布50 y L/mL的卡那霉素LB平板，培 养20h后挑选单菌。由此得到含有pET-28a(+)-lipase6的大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0063] 实施例4:脂肪酶LIPASE6的表达和纯化
[0064] 4.1蛋白诱导表达
[0065] 含有pET-28a (+) -1 ipase6的大肠杆菌BL21 (DE3)在LB培养基中37 °C培养至 0D600为0? 5左右之间，加IPTG至浓度0? 2mM，22°C培养16个小时。300mL菌液4000rpm， 4°C离心10min，收集菌体，用30mL(50mM，pH 7. 2)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，工 作4s，暂停6s，破碎lOmin分钟，在4°C，lOOOOrmp离心10min，收集上清。上清于-80°C冷 冻过夜，冷冻干燥制备成粗酶粉。
[0066] 4. 2脂肪酶的纯化
[0067]用镍离子亲和层析柱对步骤4. 1中收集的上清进行纯化得纯化的脂肪酶 LIPASE6 (图5)，纯化的蛋白大小约30kD，符合理论预期。具体实施方案如下：使用5mM的咪 唑洗脱5个柱体积，20~100mM咪唑洗脱30个柱体积，最后使用100~lOOOmM咪唑洗脱5 个柱体积，收集中间3. 5mL。用脱盐柱S印hadexG25对上述脂肪酶进行脱盐，具体操作方法 参照GE公司的操作手册进行。
[0068] 4. 3脂肪酶酶活测定
[0069] 脂肪酶活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①配制lOmM的对硝基苯酚 酯；②在 lmL 反应体系中加入 940 y L Tris-HCl buffer (50mM，pH 8. 0)，40 y L 乙醇，10 y L 脂肪酶酶液；③于35°C下，3~5min