一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体R485P及其应用，属于遗传工 程和发酵工程领域。
【背景技术】
[0002] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有：遗传 信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，分离提取工艺成本低廉；在低pH条件下（甚 至pH〈3. 0)生长良好；能够耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRAS (General Regarded As Safe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸（乳酸、丙酮酸、苹果酸、延 胡索酸、琥珀酸、a-酮戊二酸等）的潜在最适微生物。然而，酿酒酵母在高浓度糖及通风 的条件下分批发酵会产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产物的发酵来说，乙醇的大量积 累使得碳流大量的损失。通过弱化乙醇途径中的关键酶的活性，可以减少通往乙醇的碳代 谢流，从而减少碳流的损失；在此基础上，可通过阻止或弱化目标羧酸的进一步代谢，来构 建目标羧酸的合成途径。
[0003] 丙酮酸羧化酶的作用是将丙酮酸转化为草酰乙酸，进而可将碳流引入到目标羧酸 的合成途径，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地描述为"生物阀门"，如何强化丙酮酸羧化 反应，将碳流更有效地引入到目标羧酸的合成途径，成为代谢工程改造酿酒酵母生产羧酸 的一个关键问题。已有研究表明细胞中丙酮酸羧化酶活性的高低对苹果酸、琥珀酸、谷氨酸 的积累有着重要作用。任何以二元羧酸为目标产物的酿酒酵母发酵工艺，都将面临同样一 个问题：如何强化丙酮酸羧化反应，促进碳流由丙酮酸流向目标羧酸的合成途径？如何提 高丙酮酸羧化酶的活性？本发明所提供的方案，对于利用酿酒酵母生产羧酸的研究具有普 遍的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种丙酮酸羧化酶突变体，所述突变体是在氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示的亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基础上，将第485位的精氨酸突变成 为脯氨酸。
[0005] 在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基因的核苷酸 序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以酿酒酵母为宿主。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以同时缺失了丙酮酸脱羧酶 PDC1、乙醇脱氢酶ADH1、延胡索酸酶FUM1的酿酒酵母为宿主。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶基因roCl的核苷酸序列如Gene ID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示，延胡索酸酶 基因FUM1的核苷酸序列如Gene ID:855866所示。
[0010] 本发明的第三个目的是提供一种利用表达所述突变体的基因工程菌发酵生产二 元羧酸的方法。所述二元羧酸，包括延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、a-酮戊二酸等。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述二元羧酸是延胡索酸。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，在发酵培养过程中添加生物素。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，在发酵培养过程中添加32 y g/L生物素。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，将过表达丙酮酸羧化酶突变体的三基因缺失菌株 Saccharomyces cerevisiae CEN. PK2-1C A F*DC1 A ADH1 A FUM1 的种子液，接种至发酵培 养基，与28-32°C、150-250rpm条件下进行培养。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，将30°C、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以5% 的接种量转入发酵培养基于30°C、220rpm条件下培养96h。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，发酵培养基含有：无氨基酵母氮源3. 4g/L、硫酸铵 5g/L、葡萄糖40g/L，亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L，碳酸?丐 5g/L〇
[0017] 本发明还涉及所述突变体以及所述突变体得到的延胡索酸在食品、饲料、化工、药 物制备等方面的应用。
[0018] 本发明的突变体命名：是以SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列为基准，采用"原始氨基 酸、氨基酸位点、替换的氨基酸"来表示突变体。比如R485P代表将位置485的氨基酸由亲 本的精氨酸（Arginine，R)替换为脯氨酸（Pro, P)。
[0019] 本发明的有益效果：（1)将米根霉的丙酮酸羧化酶的第485位的精氨酸突变成为 脯氨酸，所得突变体的比酶活较亲本提高了 24. 8%; (2)通过构过表达丙酮酸羧化酶突变体 的酿酒酵母，能够有效提高二元羧酸的产量，为高效生产延胡索酸及其它二元羧酸创造了 条件，具有很好的工业应用价值和前景；在丙酮酸脱羧酶roci、乙醇脱氢酶ADH1和延胡索 酸酶FUM1同时缺失的酵母菌的中表达RoPYC的突变体R485P，延胡索酸产量提高了达到了 312±14mg/L，较表达野生型的RoPYC提高了 31. 1%;(3)通过添加32yg/L的生物素，可使 延胡索酸产量进一步提高到332±12mg/L，与对照组（290±10. 7mg/L)相比提高了 16. 1%。
【附图说明】
[0020] 图1 :RoPYC-GFP蛋白定位观察；
[0021] 图2 :各种丙酮酸羧化酶突变菌株的延胡索酸产量对比图；
[0022] 图3 :RoPYC R485位点定点突变对丙酮酸羧化酶活性的影响；
[0023] 图4 :不同生物素添加量对表达RoPYC R485P的工程菌的延胡索酸积累的影响。
【具体实施方式】
[0024]乙醇、残糖含量及延胡索酸的测定方法：采用高效液相色谱仪（HPLC)检测。发酵 液经处理且上清液经0. 22 y m微孔滤膜过滤后，利用RID (示差折光检测器）检测乙醇和残 糖含量，利用VWD(紫外检测器）检测延胡索酸含量，液相色谱方法如下：高效液相色谱仪为 美国Waters公司产品，型号为1515,色谱柱为Aminex HPX-87H column (Bio-Rad)。柱温： 35°C;流动相：0. 0275% (v/v)稀硫酸，经0. 22 ym滤膜过滤并除气；流速：0. 6mL/min ;检测 时间：25min ;进样量：20yL。
[0025] 生物量的测定方法（Bio-Rid核酸仪）：用0. 1M HC1稀释适当的倍数，设定波长为 600nm，取200 y L测定其吸光值。
[0026] 种子培养基：葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去离子水容，pH自然，高压 灭菌（115°C，20min)。
[0027] 发酵培养基：无氨基酵母氮源3. 4g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分别添 加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，添加碳酸钙5g/L，装液量 为40mL/250mL。可添加0-128 y g/L的生物素。
[0028] 酵母转化方法（质粒）：（1)在3mLYro液体培养基中接入平板活化的酿酒酵母 单菌落，30°C、220rpm培养过夜；⑵倒满EP管菌液，在4000rpm条件下进行室温lmin离 心；（3)适量无菌水水洗，在4000rpm条件下进行室温lmin离心；(4)依次加入1. 0M LiAc 36 y L，10mg/mL ssDNA 10 y L(ssDNA 提前沸水浴 5min，冰上放置 5min)，质粒 500ng，50% PEG240 y L，温和混匀；（5)42°C热激30分钟；（6)在4000rpm条件下进行室温lmin离心， 加lmL无菌水水洗；（7) 4000rpm离心lmin，留适量水吹吸细胞，涂布选择性平板，30°C培养 3-5d〇