一种源于绿色巴夫藻的二磷酸核酮糖羧化酶大亚基新基因的制作方法
【专利说明】一种源于绿色巴夫藻的二磷酸核酮糖羧化酶大亚基新基因
[0001]
技术领域
[0002]本申请属于基因克隆分离的技术领域，尤其涉及于一种来源于微藻的有关1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因及其分离方法。
【背景技术】
[0003]1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶广泛分布于自养生物中，是自养生物同化、还原碳元素的关键酶。1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶由大亚基(rbcL)和小亚基(rbcS)组成，其中rbcL在进化上变化较慢，因此对rbcL编码基因基因克隆和序列分析不仅有利于研究该种自养生物的合成代谢途径，同时也是确定其分类地位的重要手段。绿色巴夫藻{Pavlova viridis)是一类化能自养型真核微藻，是一类具有重要资源意义和研究价值的海洋藻类。到目前为止，绿色巴夫藻的rbcL编码基因尚属未知，制约了其合成代谢的研究和分类地位的确认。为填补此空白，本申请试图从rbcL的基因克隆和序列分析的角度展开相应的工作。
[0004]RACE全称rapid-amplificat1n of cDNA ends，是一种常用的通过PCR进行 cDNA末端快速克隆的技术。本实验采用RACE技术来获得目的mRNA片段的保守区侧向序列乃至全长序列。
【发明内容】
[0005]绿色巴夫藻ifEivlovEL viridis)为常用微藻，购自中国科学院青岛海洋研究所。
[0006]绿色巴夫藻rbcL基因的分离过程为:
(1)利用本领域常规的mRNA提取分离手段获得绿色巴夫藻的总mRNA，并使用引物OligodT以本领域常规手段将之反转录为cDNA;
(2)使用cDNA作为模板，根据rbcL同源基因的保守性设计引物PrF、PrR来进行保守区基因的扩增，其引物序列为:PrF:5’ -TGTAATTGTAGAGCGTGA-3’ ; PrR:5’-CACCTTCTAGCTTACCTACA-3’； PCR反应条件为:94°C 3 min ；94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C1 min, 30个循环；72°C 10 min;所获PCR产物大小约为540bp ;
(3)3’末端的扩增反应以cDNA为模板、使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒来进行，使用的扩增引物分别是:UPM (10 X universal primer mix) ; el orbGTATGTCAGGTGTTGACCACAT。梯度PCR反应程序为:94oC 3 min; 94oC 30 s, 72oC 3 min,5 个循环；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5 个循环；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3min, 30个循环；72oC 10 min。所获PCR产物大小约为560 bp.(4)5’末端的扩增反应使用总mRNA为模板并使用SMARTRACE cDNA扩增试剂盒来进行，使用的引物分别为:UPM5’(lOXuniversal primer mix) ; GSP1 TTAACTGTAGCACCAAGAA;GSP2 CCGAACTTGTCCATACGCT。反应程序为:加入 GSP1 于 mRNA 中后以 94oC 3 min; 94oC 30s, 6O0C 30s, 72oCl min反应1个循环；随后加入TdT于37oC反应30min获得特定末端产物；然后向体系中加入UPM5’和GSP2，以如下程序完成反应:94oC 3 min; 94oC 30 s,72oC 3 min, 5 个循环；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5 个循环；94oC 30 s，68oC30 s，72oC 3 min, 30个循环；72oC 10 min。所获目的片段约为620bp。
[0007]以上所有的片段均连入PMD18T载体后进行测序后拼接。
[0008](5)开放阅读框的扩增:在经过拼接获得了表达基因的全长之后，分别设计上下游引物 ATGGATCCTGACTACGCTATCA 和 TCAAACGTTAGCTGTTGCTG，经 PCR 扩增获得完整的 rbcL开放阅读框片段。PCR反应条件为:94oC 3 min ；94oC 30 s, 58oC 30 s, 72oC 1 min, 30个循环；72oC 10 min;片段大小为1365bp。
[0009]最终所得来自绿色巴夫藻的推定的1，5- 二磷酸核酮糖大亚基的全长多核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。该基因所编码的氨基酸序列与来自于Pavlova salina的rbcL的活性区域具有较高的序列相似性(95 %)(如图1所示)，证实其为一种典型的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基的编码基因。经过系统发育树的分析(如图2所示)，进一步确定了绿色巴夫藻的分类地位。
[0010]本申请首次从绿色巴夫藻的基因组中分离获得了 1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基的编码基因，丰富了该类酶的重要的基因资源，为进一步研究该重要真核微藻的碳同化途径以及确定其分类地位奠定基础。
【附图说明】
[0011]图1
SEQ ID N0.1与来自Pavlova salina的rbcL基因的比对结果图2
SEQ ID N0.1的系统发育树分析
【具体实施方式】
[0012]绿色巴夫藻rbcL基因的分离过程为:
(1)利用本领域常规的mRNA提取分离手段获得绿色巴夫藻的总mRNA，并使用引物OligodT以本领域常规手段将之反转录为cDNA;
(2)使用cDNA作为模板，根据rbcL同源基因的保守性设计引物PrF、PrR来进行保守区基因的扩增，其引物序列为:PrF:5’ -TGTAATTGTAGAGCGTGA-3’ ; PrR:5’-CACCTTCTAGCTTACCTACA-3’； PCR反应条件为:94°C 3 min ；94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C1 min, 30个循环；72°C 10 min;所获PCR产物大小约为540bp ;
(3)3’末端的扩增反应以cDNA为模板、使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒来进行，使用的扩增引物分别是:UPM (10Xuniversal primer mix) ; elo9_3GTATGTCAGGTGTTGACCACAT。梯度PCR反应程序为:94oC 3 min; 94oC 30 s, 72oC 3 min,5 个循环；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5 个循环；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3min, 30个循环；72oC 10 min。所获PCR产物大小约为560 bp.(4)5’末端的扩增反应使用总mRNA为模板并使用SMARTRACE cDNA扩增试剂盒来进行，使用的引物分别为:UPM5’(lOXuniversal primer mix) ; GSP1 TTAACTGTAGCACCAAGAA;GSP2
CCGAACTTGTCCATACGCT。反应程序为:加入 GSP1 于 mRNA 中后以 94oC 3 min; 94oC 30s, 6O0C 30s, 72oCl min反应1个循环；随后加入TdT于37oC反应30min获得特定末端产物；然后向体系中加入UPM5’和GSP2，以如下程序完成反应:94oC 3 min; 94oC 30 s,72oC 3 min, 5 个循环；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5 个循环；94oC 30 s，68oC30 s，72oC 3 min, 30个循环；72oC 10 min。所获目的片段约为620bp。
[0013]以上所有的片段均连入PMD18T载体后进行测序后拼接。
[0014](5)开放阅读框的扩增:在经过拼接获得了表达基因的全长之后，分别设计上下游引物 ATGGATCCTGACTACGCTATCA 和 TCAAACGTTAGCTGTTGCTG，经 PCR 扩增获得完整的 rbcL开放阅读框片段。PCR反应条件为:94oC 3 min ；94oC 30 s, 58oC 30 s, 72oC 1 min, 30个循环；72oC 10 min;片段大小为1365bp。
[0015]
说明书氨基酸和核苷酸序列表 SEQ ID N0.1:
P.Kirii/is的1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基的基因序列ATGGATCCTGACTACGCTATCAAAGAGACTGATGTTCTAGCAATGTTCCTTCTTACACCTCAACCAGGTGTAGACCCTGTAGAGTGTGCTGCAGAGGTTGCTGGGGCGTCTTCTACTGCTACTAGGACTGTAGTATGTACTGACCTACTTACTGCTTGTGACCTAGACCGTGCAAAAGCATTCCGTGTAGATCCAGTACCTAACTCTTCTGATCAGTACTTTGCTTACATCGCATACGATATCGACCTATTTGAGGAAGGCTCTCTTGCTAACCTTACTGCTTCGATCATTGGTAACGTTTTCGGATTCAAGGCTGTTAAAGCCTCGTCTAGAAGATATGCGTATTCCTTACACGCTTACTTAAAGACTTTCCAAGGTCCTGCTACTGGGTGTAATTGTAGAGCGTGAGCGTATGGACAAGTTCGGTCGTCCACTTCTTGGTGCTACAGTTAAGCCTAAGCTAGGTCTTTCTGGTAAGAACCGCGGACGTGTAGTATTCGAAGGTCTTAAAGGTGGTCTAGACTTCCTTAAGGATGATGAGAACATTAACTCACAACCATTCATGCGTAGGAGAGAGCGTTTCCTATTCTCTATGGAAGGTGTTAACCGTGCAGCTGCAGCTTCTGGAGAAGTTATTGGTCACTACCTAAACGCTACTGCTGGTACTATGGAAGAAACACGTGCAGATTACTCTAAGAGCCTTGGTTCGATCATTACAATGATTGACCTTGTTATCGGATACACAGCTATTCAAACTATGGCTATCTGGGCTCGTAAGACCTAGACGATATGATCCTTCACCTTCACCGTGCAGGTAGATCATCTTACTCTCGTCTGAATAACCACGGAAGGAACTTCCGTGTAATCTGTAAGTGGATGCGTATGTCAGGTGTTGACCACATTCACGCTGGTACTGTTGTAGGTAAGCTAGAAGGTGATCCTCTAATGGTTAAAGGATTCTACAACACTCTTCTTGAGAATCAGACTGACATCAACCTTCCAGAAGGTCTATTCTTCGAGCAAGATTGGGCGTCTCTACGTAAGTGTCTACCAGTAGCATCTGGTGGTATCCACTGTGGACAAATGCACCAACTTATCGAGTACCTAGGTGACGACGTTGTACTTCAGTTCGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCAGACGGAATCCAGGCTGGTGCGACTGCTAACCGTGTTGCTCTTGAGTGCATGGTGCTAGCTCGTAACGAAGGTCGTGATTACGTTGCTGAAGGTCCTCAAATCCTAAGAGACGCTGCTAAGTCTTGTGGTCCTCTACAAACAGCACTTGATCTTTGGAAAGATATTACATTCAACTACACTTCAACTGATACAGCAGCAACAGCTAACGTTTGA
【主权项】
1.一种从微藻中克隆得到1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因的方法，其特征在于，首先分离得到微藻的mRNA并反转录为cDNA，随后以之为模板，根据延伸酶基因保守序列设计简并引物从而扩增得到保守区基因；接下来分别对其5’末端和3’末端进行末端扩增获得全基因序列后，通过普通PCR的方法获得表达基因。2.—种来自于绿色巴夫藻的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因的开放阅读框序列，其特征在于，其序列如SEQ ID.N0.1所示。
【专利摘要】1,5-二磷酸核酮糖羧化酶是生物体进行碳同化的关键酶，rbcL是该酶的大亚基。针对于能够利用二氧化碳合成有机物的一种化能自养型微藻-绿色巴夫藻(<i>Pavlova</i><i>？viridis</i>)，本申请使用了保守区序列扩增和RACE相结合的方法克隆获得了一种新的rbcL基因。该基因的获得既有利于认识绿色巴夫藻的合成代谢，同时可助于准确鉴定其分类地位。
【IPC分类】C12N15/60, C12N15/10
【公开号】CN105274091
【申请号】CN201510825503
【发明人】不公告发明人
【申请人】徐毅
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月24日