专利名称：新型的核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因植物。更具体地说，本发明涉及在植物发育的特定阶段的转基因表达。甚至更具体地说，本发明涉及芸苔属(Brassica)的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)启动子，和包含至少一种所述启动子的DNA构建体或者表达盒，该启动子为有效生产尤其含有用途的基因产物而转化同源植物或异源植物。
背景技术：
大气中二氧化碳的同化作用和转化作用通过与核酮糖-1，5-二磷酸反应生成磷酸甘油，此作用严格依赖于核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的活性(Spreitzer，R.J.，Arch.Biochem.Biophys.414(2)，141-9，2003；Spreitzer，R.J.，等，Annu.Rev.Plant Biol.，53，449-75，2002)。结构上，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶由8个小亚基(SSU)和8个大亚基(LSU)组成。位于植物核基因组的几个基因编码SSU蛋白质，而质体基因组中发现了LSU基因。在不同的植物中核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶SSU基因的数目不同，从4拷贝直到15拷贝或在一些多倍体基因组中更多。至少已知存在于拟南芥菜(Arabidobsis thaliana)的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶SSU基因的4个拷贝和小麦中每个多倍体基因组12或甚至更多拷贝数(Sasanuma，T.，Mol.Genet.Genomics.265(1)，161-171，2001；Sasanuma，T.和Miyashita，N.T.，Genes Genet.Syst.，73(5)，297-309，1998)。
核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶是植物中最普遍存在的酶之一。无需详细说明其任何独有特性，编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的基因的启动子已经提示，其做为强启动子有助于转化植物的DNA构建体的制备(US 5,994,628，US 2002/0170096，US 2003/0097678)。
Dean，C.，等(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，40，415-439，1989)描述了高等植物中RbcS基因的结构、进化和调节，并在RbcS基因的结构和功能基础上，Dean等提出核基因可分入多基因家族。在其他植物中广泛的研究了这些家族的基因结构，例如拟南芥属(Arabidopsis)、西红柿、菊花属(Chrysanthemum)、欧洲油菜(Brassicanapus)和大豆。西红柿有5个位于3个染色体座(chromosomal loci)的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基(rbcS)基因，一个在染色体3内，其余4个在染色体2内(Sugita，M.，等，Mol.Gen.Genetic.，209(2)，247-256，1987)。此外，已知这些基因中有3个基因在10kb的区域内组织成串联排列。拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)rbcS基因家族内的情况很相似(Krebbers，E.，等，Plant Mol.Biol.11，745-759，988；Niwa，Y.，等，NA Res.，4(5)，341-343，1997；Dedonder，A.，等，Plant Physiol.，101，3，801-808，1993)。Galili，S.，等，Mol.Gen.Genet.，263(4)，674-680，2000。
Outchkourov，N.S.等(Planta，216(6)，1003-1012，2002)克隆了一种菊花种植物(菊花(Chrysantemum morifolium Ramat))的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基基因家族的高丰度转录的rbcS1，并证明了用含有UidA基因的基因盒转化的烟草植物在rbcS1启动子控制下表达GUS，提供占叶子中可溶性总量达10％的GUS。即使来自菊花属的所述核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子在烟草叶子中得到高的蛋白质表达，但未证明在其他发育阶段中高表达。
美国专利申请2002/0170096公开了用Ri-质粒或Ti-质粒的转化系统中大豆SSU基因的启动子区的应用。
欧洲油菜(Brassica napus)编码序列中，已经克隆了三个rbcS基因(检索号X75334，X55937，X61097)的5′-调节区和3′-调节区并测定了它们的序列。(Beck，I.，等，Bot.Acta，108，327-333，1995；Fiebig，C.和Link，G.，Curr.Genet.，21(2)，161-8，1995；Fiebig，C.，等，Bot.Acta，103，258-265，1990)。根据用Southern分析所得资料确信欧洲油菜仅仅包含3个rbcS基因(Nantel，A.M.，等，Plant Mol.Biol.，16(6)，955-966，1991)。Baszczynski，等(Nucleic Acids Res.16(10)4732，1988)描述了自欧洲油菜rbcS基因的mRNA得到的cDNA序列。检索号X07367提供了一个公开的cDNAs。Beck，等，Bot.Acta，108，327-333，1995描述了来自欧洲油菜的RbcS区在烟草叶肉原生质体中的瞬时表达活性。
其他芸苔种的rbcS基因家族的研究远少于欧洲油菜rbcS基因家族。事实上，基因结构和活性的有用数据不能鉴别在不同植物组织中或不同时空阶段期间或各种环境条件下芸苔属rbcS基因家族成员的不同地表达。
因为叶子大量的产生并且叶子尺寸大，所以植物中基因产物的表达和生产经常在叶子中证明并从中收获基因产物。为了能在正发育的芽中生产转基因表达产物，有强表达启动子是很重要的，例如所选的子叶发育阶段。植物种子和子叶特别有利于生产，因为在子叶发育初期，营养源来自种子，包括做为从头合成(de novo synthesis)原料的氨基酸和油类可大量得到，并且自底物溶液回收表达的基因产物比自收获的叶子中更容易和更有效率。
设计转基因植物时一个重要方面是在所需植物组织中或在所需植物发育阶段如何获得有意义的转基因表达水平。在这方面启动子的作用非常重要并因此需要有不同特性和表达模式的新型启动子。
在转基因植物中生产基因产物时，提供高水平的转基因表达不是考虑的唯一方面。尤其在封闭(contained)条件下生产外来或异源基因产物时，提供选择性、特异性、时空性的方式强表达，允许基因产物在选择性植物组织中，在选择性优选相当短的时间段内生产是尤其重要的。在在封闭条件下、适当设备下生产转基因产物需要在种子萌芽或子叶发育期间有活性的启动子。因此需要不同的新应用的新型启动子。
本发明的目的是获得时空性定向高表达水平的所需基因产物或蛋白质。因此，新型启动子不仅在不同的发育阶段表达，而且在特定发育阶段和/或在植物的特定器官内特别提供高蛋白质水平。
发明概述本发明涉及一种能得自光生长(light grown)芸苔属籽苗的新型时空性活性的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族，包括SEQ IDNO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3，并涉及特定植物器官内或植物发育特定阶段转基因表达。该启动子有利于设计DNA构建体或盒，其包含至少一种与编码所需基因产物的基因框架内功能性融合的所述启动子序列。收集转化的同源或异源零代植物种子和转化植物的后代种子，并用于基因产物的有效生产，特别在封闭条件下。
该启动子用于设计表达盒，包含至少一种选自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子，该家族包括核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3，其启动子序列操作性连接到编码所需蛋白质或基因产物的异源或同源核苷酸序列。
通过包括天然存在的分离的基因或部分由分离的天然存在的基因而设计合成的或半合成的核苷酸序列的报告基因举例说明了该核苷酸序列。例如此报告基因编码GUS、人血清白蛋白(HSA)、抗体和医学上活性的蛋白质。
DNA构建体或盒用于转化宿主植物通过芸苔种和亚麻荠种得到例证。这种转化的所谓零代植物包含一种或多种含有DNA盒的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子。所述零代转基因植物的种子可被用来提供更进一步的世代，但是天然地所述种子在种子萌芽和子叶发育期可被直接用于从所述种子的籽苗生产所需基因产物。
因此，本发明涉及携带有至少一个包含所述核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族中一种启动子的DNA构建体或盒的转基因植物、所述转基因植物的后代以及种子或籽苗。
本发明也公开了生产拥有与上述核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族基本上相似的特性的其它启动子的方法。该方法包括评价光生长籽苗中的表达的步骤，鉴别最高表达基因的步骤及从正发育子叶中能够指导基因表达的所述基因启动子中选择的步骤。
附图简述
图1显示了芜青的萌芽种子内不同3′UTR-型rbcS-基因的相对量。
图2A、2B、2C、3和4表明了与全局DNA比对程序的DNA序列比对。参照分子rbcS-300nt.1-300区.序列5.计分矩阵(Scoringmatrix)线性[错配2，OpenGAp 4m ExtGap 1]。序列视图类似格式，在相同碱基位置高度配对的有色区。
图2A显示了克隆的芜青(Brassica rapa)rbcS启动子(300bp)的序列对比。
图2B显示了克隆的芜青rbcS-4A(SEQ ID NO1)启动子和rbcS-4B(SEQ ID NO2)启动子(300bp)的序列对比，其中水平盒为同源区域。
图2C显示了启动子(上面部分)和3′UTR(下面部分)芜青rbcS-2(SEQ ID NO3)和B napus rbcS(X61097)的序列对比。
图3显示了Rbcs-4A启动子(SEQ ID NO1)(上面一行)和以检索号X61097公开的欧洲油菜核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(下面一行)的1kb序列的序列对比。这些序列显示出52％相异性。
图4显示了Rbcs-4A启动子(SEQ ID NO1)(上面一行)和以检索号AY163904公开的菊花属rbcS1启动子(下面一行)的1kb序列的序列对比。这些序列显示出57％相异性。
图5显示了特异性针对不同的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶3′UTR型单一部分的正向引物和反向引物的序列。这些引物显示出不同的3′UTR物种可用实时(real-time)PCR鉴别。正向引物分为两部分(加下划线的和斜体字)每一引物左边部分对应于核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶编码区相关的最后几个核苷酸，而右边部分对应于特异性3′UTR序列。所有反向引物与特异性3′UTR区复性。所有扩增子的大小在80-100nt范围内变化。
图6为rbcS-2(SEQ ID NO1)启动子和rbcS-4A(SEQ ID NO3)启动子中共有调控元件的图解。
图7为一个表，其表明了使用实时PCR用rbcS-2-GUS和rbcS4A-GUS(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子序列(各自为SEQ IDNO1和SEQ ID NO3))转化的转基因芸苔属植物内得自rbcS-2、rbcS-4和UidA(GUS)的mRNA的量。
图8显示了转基因烟草植物的RNA样品中HSA mRNA分子的量(实时PCR数据)。
图9显示了欧洲油菜种子中不同的萌芽时间内不同核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子的表达水平。数据表示每个样品分子数目(100ng的总RNA)。
图10显示了携带有包含构建体的rbcS-4B UidA基因的转基因烟草植物内GUS表达。
图11显示了在24℃或30℃持续光照下芸苔属种子萌芽期间在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子rbcS-4A下GUS表达。
图12显示了转基因亚麻荠属(Camelina)植物中HSA mRNA含量(Northern分析)。
图13显示了在不同的时间里转基因欧洲油菜植物的萌芽种子中HSA mRNA含量。
图14显示了转基因芸苔属、亚麻荠属和烟草植物中以％TSP(可溶性蛋白总量)计算的HSA蛋白的量。提出的是最大值和最小值的平均值。
图15显示了用包含做为报告基因的GUS并包含全长rbcS-2(SEQ ID NO2)启动子(1.6kb)或其截短型的构建体转化的转基因烟草植物中GUS的活性。用35S-启动子做为阳性对照。
图16显示了Northern印迹分析所示的正萌芽芸苔属籽苗(Brassica seedlings)中核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子的表达。
图16A为Northern印迹，显示了在气升式容器中萌芽12-168小时后芸苔属籽苗中核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶SSU mRNA的合成。
图16B显示了通过体外转录生产的未标记的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶RNA，装在同样过滤器上做为对照。对照RNA的量以pg表示。
图17显示了RbcS-4A(SEQ ID NO1)启动子(上面一行)的序列和检索号为BH 484651的芸苔属基因组计划中公开的芸苔属序列的序列对比。
图18显示了携带有TNFR-构建体的转基因亚麻荠属(Camelina)和烟草植物的定量的Northern数据。在图中Rbcs-2-TNFR-Fc-56UTRshort含有rbcs-2启动子，连接到IgG1重链恒定区(CH2+CH3域)部分的TNFR部分(489nt)和来自天然的rbcs-4基因(0，5kb长度)的终止子，这和前述构建体中的相同，但是在Fc区(仅仅在终止密码子以前)后也有KDEL信号(12nt)。Rbcs-2-TNFR-Fc-56UTRlong含有rbcs-4A启动子，连接到IgG1重链恒定区(CH2+CH3域)部分的TNFR部分(489nt)和来自天然的rbcs-4基因(2kb长度)的终止子。Rbcs-2-TNFR-Fc-56UTRlong和前述构建体相同，但是在Fc区(仅仅在终止密码子以前)后也有KDEL信号(12nt)。
图19描绘了一种人工的HSA基因(SEQ ID NO15)。这种分离的天然人基因(cDNA，即仅有外显子无内含子)的序列已经过密码子优化。
图20描绘了一种人工的或半合成的轻链(抗橡胶蛋白(anti-hevein)1C2)编码区(SEQ ID NO16)。该序列由3部分组成编码小鼠信号肽(22氨基酸)的66nt长度序列。该序列和检索号AF078548部分序列有100％相似性；从噬菌体展示文库(得自VTT)分离的324nt长度轻链抗橡胶蛋白1C2抗原可变区。检索号AB095291(Genbank)和图20(SEQ IDNO16)中可变区的16-305nt区有100％相似性；324nt长度的kappa轻链构建体区。其和检索号BC063599序列有100％相似性。
图21描绘了一种人工的rbcS-4终止序列(SEQ ID NO17)。通过基因组步移技术(genome walking technique)最早从芜青基因组克隆了该序列。在芸苔属基因组计划中公开了相似序列。检索号BH691838有88％的部分相似性。
图22描绘了一种人工的重链(抗橡胶蛋白1C2)编码区(SEQ IDNO18)。该序列由3部分组成编码小鼠信号肽(17氨基酸)57nt长度序列。检索号X67210的部分该序列有100％相似性；从噬菌体展示技术(得自VTT)制成的387nt长度重链抗橡胶蛋白1C2抗原可变区。检索号AB067222(Genbank)和图22中显示的可变区的1-295nt区有95％相似性；990nt长度的IgG1重链恒定区。检索号BC024289的序列有99％相似性。这种微小差别可能因为等位基因的差别。
图23描绘了一种加上TNFR部分(489nt)的人工信号序列(69nt)。也公开于US 5,605,690的检索号NM_001066序列和该序列有100％相似性。相似序列得自其他TNFR序列。
图24描绘了一种拟南芥属(Arabidopsisis)VSP1(植物储存蛋白-1基因)-3′UTR的人工部分和rbcS-4-终止子(Genbank检索号NM_122387)的一部分。其中RbcS-4-终止子部分为图21显示的起始于切割位点后直到nt 350的全部长度的RbcS-4-终止子。
要注意这些图中公开的报告基因不是本发明的一部分。它们仅仅用来例证本发明的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子的可行性。
发明详述本发明所用术语具有植物内重组DNA技术和转基因表达领域中通常具有的意义。但是本发明中一些术语以更宽的或有点不同的方式使用。因此下列更详细定义了一些术语。
定义术语“报告基因”是指编码同源蛋白质或异源蛋白质或者其他代谢作用的基因产物的基因，可以做为GUS酶容易的或通过适用的已知测定方法例如光谱测定方法、免疫测定等证明报告基因。报告基因是一种“结构基因”，可以编码任何选定的或需要的蛋白质或基因产物。报告基因的例证为编码GUS蛋白质的uidA基因和编码人血清白蛋白(HSA)的基因SEQ ID NO15。所述基因做为模型基因在科学研究中特别有用并且特别利于工业上有用的DNA构建体或盒的开发，因为编码易于探测的标记蛋白质。
术语“同源启动子”是指对于宿主植物物种是内源性的启动子。换句话说，其源于或存在于宿主植物相同起源的植物物种中。换句话说其天然存在于宿主植物物种。
术语“异源启动子”是指对于宿主植物物种是外源性的启动子。该启动子不出现在未转化的植物物种中。换句话说，其不天然存在于宿主植物并且转化宿主植物必需用携带所述启动子的构建体。
术语“同源系统”是指包含得自宿主植物相同物种的启动子的DNA构建体或盒。换句话说，该系统为包含天然存在于宿主植物的内源性启动子的一种DNA构建体或盒。在同源系统中，同源启动子优选与可以是异源的报告基因框架内功能性融合。
术语“异源系统”是指包含宿主植物物种外源启动子的DNA构建体或盒。宿主植物在天然条件下不包含所述启动子。换句话说，启动子不源于宿主植物并必需用得自另一生物体的外来启动子转化宿主植物。在异源系统中，异源启动子优选与可以是异源或同源的报告基因框架内功能性融合。
术语“同源基因、蛋白质或基因产物”是指对于宿主植物是内源性的基因。换句话说，该基因源于宿主植物并且未转化的宿主植物也产生所述蛋白质或基因产物。
术语“异源基因、蛋白质或基因产物”是指对于宿主植物是外源性的基因。未转化植物不产生所述蛋白质。换句话说，启动子不源于宿主植物，并且在其可产生异源蛋白质或基因产物前必需用得自另一生物体的外来启动子转化宿主植物。
术语“零代”是指转化的植物。来自所述“零代植物”的种子可直接从萌芽种子或子叶发育期间的籽苗来生产所需的基因产物，但是种子也可用来提供植物进一步的或以后的世代，植物的后代包含携带有包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或它的制品的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族中至少一种的至少一个DNA构建体或盒。检查并挑选所述植物的种子使它们携带至少一个优选的用于生产目的的DNA构建体。
发明综述本发明涉及正萌芽的籽苗和秧中转基因表达。根据本发明，强蛋白质表达通过使编码所需基因产物与自芸苔属特别是芜青的新型核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子融合而达到。这种新型启动子选自芸苔属光生长子叶中大量表达的rbcS基因得到的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子组。
这种新型启动子包含包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族。该启动子序列得自分离的天然核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子，但是相似序列可以通过其他手段包括合成和半合成方法制备。
该核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子有利于设计重组DNA构建体或包含与编码所需基因产物的报告基因框架内功能性融合的SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的表达盒。
本发明启动子通过选择和鉴别在芸苔种的光生长籽苗的正发育子叶中高表达的基因而获得。分离所述高表达基因的3′-UTR并描述其特征。使用所述方法三个强核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子的特征为有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3序列并且能够在正发育子叶中以时空性方式指导基因表达。
本发明的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族的所述的3个启动子用来设计DNA构建体或表达盒，其中包含至少一个、任选2个或更多所述核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子，其功能性连接到编码异源蛋白质或基因产物的基因或核酸序列上。通常，生产异源基因产物，但是启动子也可以功能性结合到编码同源蛋白质或基因产物的基因上。因此，可以用天然基因的几个拷贝转化宿主植物，并从而可以提高工业上重要的、急需的和天然的蛋白质的产量。在一些情况下，为进一步提高基因表达，以任何组合的一种或多种所述启动子可被串联方式插入DNA构建体或表达盒中。
本发明优选的报告基因是编码GUS的uidA基因，是一种易于检测的标记基因。另一个示范性的“报告基因”是编码人血清白蛋白(HSA)的基因。从与医学活性蛋白质的所选部分结合的免疫球蛋白Ig(G)重链的所选部分可以设计合成有用的报告基因。这种由免疫球蛋白Ig(G)重链部分和有或无ER-保留信号KDEL的肿瘤坏死因子受体(TNFR)细胞外域组成的合成基因，和包含抗橡胶蛋白1C2抗原人抗体的重链和/或轻链的抗体报告基因用来例证本发明的适用性。上面列举的“报告基因”仅为实例，并且包含本发明启动子的DNA构建体或盒可以与编码所需产物的任何其他报告基因框架内功能性融合对于本领域技术人员来说是显而易见的。
包含本发明代表同源系统的一种或多种内源启动子的本发明的重组构建体和表达盒或者包含本发明代表异源系统的一种或多种异源启动子的本发明的重组构建体或表达盒各自用于转化同源植物或异源植物。本发明中示范性植物物种为芸苔种(Brassica sp)、烟草(Nicotiana tabacum)和亚麻荠(Camelina sativa)。植物转化程序对于本领域技术人员是熟知的并因此根据本发明公开的构建体也可转化任何其他的植物物种。适用的转化系统包括但不限于例如常规的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化系统。尤其可以使用根据WO02/38779和US10/416,091中描述的一种新型转化系统转化的亚麻荠属(Camelina)植物。
用一种或多种上述DNA构建体或表达盒转化宿主植物。收集代表零代的来自转化宿主植物的种子并用于生产提供转基因种子的后来植物世代，此转基因种子通过在封闭条件下例如在缓冲的琼脂平板上或适当的通气容器例如发酵设备中使所述种子萌芽而用于生产所需蛋白质或基因产物。这种转化的种子提供极好的营养源并且转化的种子可以在主要包含水的、可为适当的缓冲液并含有生长激素和其他利于生长并促进萌芽的成分的溶液中萌芽成籽苗。这种培养使在无菌条件下生产并使基因产物易于回收。
在本发明中也提供了一种生产核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的方法。可以使用所述方法提供与本发明的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)启动子相似有用特性的进一步的启动子。这样使这种方法能够生产在封闭条件下自转化种子生产所需基因产物的新型有用启动子。在方法中评价轻微成熟光生长籽苗的表达，鉴别子叶发育期高表达的基因并鉴定了它们的启动子。挑选能够指导子叶发育期子叶中表达的启动子来设计DNA构建体和表达盒。
下列实施例是描述性的并决不限制本发明的各种实施方案。
实施例1.表达于萌芽芜青(油菜(campestris)种子的子叶中核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA类型为了鉴别萌芽芜青(油菜(campestris))种子的子叶中表达的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA的最丰富类型，构建一种cDNA库。
自4日龄芸苔属籽苗分离总RNA，并用oligo(d)T纤维素自总RNA制剂分离mRNA片段。用oligo(d)T和M-MLV(点突变体)逆转录酶合成cDNA第一条链。用核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶SSU编码区的第3外显子特异性正向引物e3a5′-CAUCAUCAUCAUCAACCGTCAAGTCCAGTGCATCAGTTTCAT-3′(SEQ ID NO4)和根据CloneAmp程序(Life Technologies)专门设计的一种oligo(d)T衍生物的反向引物atu5′-CUACUACUACUATTTTTTTTTTTTTTT-3′(SEQ ID NO5)进行下一步PCR步骤。两个引物在5′-末端都包含几个被酶UDG(尿嘧啶DNA转葡糖基酶)破坏的dUMP残基。进行PCR步骤2个循环，随后用UDG消化PCR产物并直接插入到含有和RT-PCR产物的3′-凸端相容的特异性3′-凸端的线性化的pAMP1载体(Life Technologies)。转化含有插入片段的载体进入感受态E.coli菌株XL-1。挑选并分析100个噬斑。通过PCR扩增来自质粒DNA的插入片段并测定所得PCR产物序列。通过序列分析的帮助计算含有每个类型插入片段分离的菌落的相对数。
参考
图1克隆的3′UTR的序列分析显示不同的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA物种之间显著的量的差别。包含所有克隆的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA的56％命名为‘56’序列。其他包含所有克隆的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA的29％命名为‘29’序列。剩下的15％的克隆对应于核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNAs的其他类型。
比较收自cDNA库的29-型和56-型序列和已公开序列。序列对比表明这些核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNAs自新型的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子表达。分别地，29-型序列称为rbcS-2和56-型序列称为rbcS-4。
实施例2.克隆得自芜青的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子基于′56′型和′29′型序列设计反向引物用于以后步骤的启动子克隆。
rbcs-2启动子的克隆首先构建EST-文库。发现的UTR的最普通类型是UTR2。用该UTR-2设计用于基因组步移步骤的反向引物。通过EcoRV、Dral、HincII、PvuII、SmaI和Sspl消化芜青的基因组DNA并连接到衔接子(5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT(SEQ ID NO6)和5′-p-ACCAGCCC-NH2-3′(SEQ IDNO7)以得到6个DNA文库。
用衔接子引物AP15′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(SEQID NO8)和UTR2-特异性L1引物5′-GGCCACACTTGACAATCCGATATAACATGCCTCA-3′(SEQID NO9)进行下一个PCR扩增(首先并嵌套的)。
用AP2引物5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′(SEQ ID NO10)和嵌套UTR2-s特异性L2引物5′-CAAATGGAAATGAAATGAGGTAG-3′(SEQ ID NO11)进行嵌套式PCR。
通过使用DraI DNA文库获得最长900bp产物。这种片段克隆入pGEM3Zf(+)载体并测序。比较该序列和GenBank数据库中序列。发现最同源序列是B.napus rbcS(检索号X61097)。
临近一个所得克隆(Rud3)的5′端是自B.napus rbcS(自B.napusrbcS的1037nt起始)缺失的一个22nt长片段。设计推定转录起始位点(基于和X61097的同源性)下游区两个反向引物RbNco和RbSiB和基于X61097同源性的两个正向引物BNRb1和BNRb3。使用BNRb1做为正向引物和UTR2-L2做为反向引物扩增全长rbcS-2-基因。然后使用BNRb3做为正向引物和RbSiB(有信号肽)做为反向引物的组合或者BNRb3做为正向引物和RbNco(无信号肽)做为反向引物的组合在嵌套式PCR中扩增不同长度的2个启动子。
rbcS-4启动子的克隆在几个步骤中进行启动子克隆。两个反向引物(首先并嵌套的PCR)和三个公开的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因的第一外显子的起始部分的相同序列匹配，用于基因组步移的第一步骤。
自芜青叶分离基因组DNA并分成6个组分。每个组分通过6个限制性酶(EcoR V，DraI，PvuII，StuI，SspI，XmnI)的一种消化并连接到上述的基因组步移衔接子(Clontech)。每个限制-连接混合物代表一种基因组DNA文库。
下一步包括使用衔接子特异性AP1和AP2(正向)与基因特异性(反向)引物的两个连续PCR(首先并嵌套的)。通过3种不同反向引物开始PCR，为了得到下面列出的重叠PCR产物与核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶SSU基因第一外显子的不同部分复性。
(RbcS-RN5′-ACCCGGGCCCAGGAGAGCATAGAGGAAGCC-3′(SEQ ID NO12)，RbcS-R15′-CGGTGAATGGAGCGACCATCGTGGCTTGAG-3′(SEQ ID NO13)，RbcS-R25′-CTGTGAATGGAGCAACCATGGCCGCTTGAG-3′(SEQ ID NO14)。
以上描述的这种6基因组DNA文库在嵌套式PCR后生产了扩增产物。使用TA-克隆直接克隆这些产物进入pGEM-T-Easy载体(Promega)。使用PCR和M13-通用且反向引物筛选菌落。携带质粒DNA和插入片段的菌落生长在液体培养物中并分离质粒DNA用做序列分析。
分析含有总数约90质粒DNA插入片段的克隆。基于序列分析获得的数据，根据序列相似性把序列分为5组。3种启动子经鉴别相似于GenBank中公开的启动子。另外，使用特别设计的特异性针对克隆的启动子区的正向引物和特异性针对3′UTR(3′UTR的rbcS-4类型)的′56′-型的反向引物的PCR，鉴别基因组中有3′UTR(3′UTR的rbcS-4类型)的′56′-型推定启动子。该启动子称为′56A′。
基于获得的序列，设计了新型反向引物使下个PCR设置相同正向引物(AP1，AP2)和该新型反向引物并使用相同基因组DNA文库。这种程序重复4次。在第4个PCR循环后所得序列允许指定特定启动子正向引物。设计的反向引物包括BpiI特定位点以产生NcoI相容的限制性酶切位点。PCR使用这些引物和HiFi KOD聚合酶能够鉴别其他序列中的启动子rbc-4A(SEQ ID NO1)的′56′型。通过基因组步移技术手段发现了有′56′型3′UTR另一启动子绑定在基因组中。这种rbcS-4B启动子(SEQ ID NO2)与rbc-4A在(SEQ ID NO1内1953-2175nt 和SEQ ID NO2内794-1016nt)的约230nt区的长度上有98％相似性，但是rbcS-4A和rbcS-4B的末端部分显示低于40％相似性。图2B给出了这两种启动子-267-+33nt区的序列对比。也用校正读码KOS聚合酶克隆rbcS-4B启动子并进一步研究它的功能活性。
使用相同方法，应用全部4步基因组步移克隆rbcS-4A启动子(SEQ ID NO1)及2步克隆rbcS-1、rbcS-3和rbcS-5启动子(各自为SEQID NO21、SEQ ID NO22和SEQ ID NO23)。基因组步移的最后一步后使用校正读码Pfu酶克隆全长启动子。设计克隆的启动子序列的3′-末端以使它们可连接到报告基因。使用Genbank BLAST系统分析获得的启动子序列。经鉴别芸苔属启动子与检索号各自为X55937和X75334的rbcS-3和rbcS-5启动子有相似性(高达98-99％)。通过计算机序列对比程序相互比较所有克隆与已知的启动子。这种分析显示所有启动子都有大多数位于约300nt区的或多或少相似部分。这些rbcS启动子(除rbcS-4B(见下列))的300bp长度近端(proximal)的序列比对列于图2A(rbcS-2为SEQ ID NO3；rbcS-4A为SEQ IDNO1)。基因组步移数据显示有两种部分不同的rbcS-4(称为rbcS-4A和rbcS-4B)启动子连接到相同3′UTR并且在它们的3′-末端的最后230bp非常相似(图2B)(rbcS-4A为SEQ ID NO1；rbcS-4B为SEQ IDNO2)。另一方面，该启动子的其余(远端(distal))部分显示出低水平的同源性(40％)，与和其他核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子序列对比时显示的相同。
一种已公开的欧洲油菜核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(检索号X61097)和rbcS-2(SEQ ID NO1)的序列对比表明它们间的一些差异(91％相似性)(图2C)。在3′UTR区内也有差异。因此这两种启动子不是同一种并且可能在芸苔种的rbcS基因家族进化或选择过程中分化了。
参考图3 rbcS-4A(SEQ ID NO1)启动子序列和公开的芸苔属核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(X61097)的序列对比显示了52％的相异性。
相似的，参考图4 rbcS-4A启动子序列和公开的菊花属rbcS-1启动子(AY163904)的序列对比显示了57％的相异性。
显著的，rbsC-4A启动子中仅有三段序列(SEQ ID NO1的1007-1440nt，1776-1950nt和1959-2175nt)和芸苔属基因组计划数据库有相当高的同源性(约93％的相似性)(
图17)。检索号BH484651代表甘蓝(Brassica oleracea)的基因组克隆，CD811761代表欧洲油菜的cDNA克隆。在包括芸苔属基因组计划的任何数据库内没有发现rbcS-4A启动子的其他部分。
很明显，如本发明所描述，rbcS-2(SEQ ID NO3)与rbcS-4A和B(各自为SEQ ID NO1和2)的核苷酸序列是新型的和有用的。实施例3.融合构建体rbcS-4A-GUS、rbcS-4A-HSA、rbcS-4B-GUS、rbcS-2-GUS、rbcS-2-HSA、rbcS-2-Ab(L+H)-IC2、rbcS-4A-Ab(L+H)-IC2、rbcS-2-TNFR-Fc和rbcS-4A-TNFR-Fc用反向引物扩增启动子以得到3′-末端上的NcoI相容的限制性酶切位点。使用NcoI位点在其5′-末端的含有GUS基因的载体pCAMBIA1301(CAMBIA)。在具有插入的HSA基因的基于pBIN19质粒pGPTV内设计HSA融合构建体。加入具有polyA人工信号的密码子优化的HSA基因序列，如
图19中所示。使用Bpil、HindIII酶切出RbcS-4A和rbcS4B。使用Ncol、HindIII酶切出RbcS-2。启动子RbcS 4A、rbcS-4B和rbcS-2克隆进被NcoI、HindIII酶切开的载体pCAMBIA1301或pGPTV。用于这些构建体的终止子如下含有GUS的pCAMBIA1301载体中的nos-终止子，已知的来自GenBank芜青rbcS终止子的rbcS-4类型3UTR plus部分用于含有HAS的pGPTV质粒。
构建体Rbcs-2-Ab(L+H)-1C2和RbcS-4-Ab(L+H)-1C2含有相同抗体区和来自天然芸苔属核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶RbcS-4基因(直接来自基因组)的相同终止子(polyA)信号。该抗体蛋白质分子源于抗橡胶蛋白1C2抗原。RbcS-2-Ab(L+H)-1C2由RbcS-2启动子、如图20所示轻链(抗橡胶蛋白1C2)编码区、如图21所示RbcS-4终止子(SEQ ID NO17)、另一个RbcS-2启动子、如图22所示重链(抗橡胶蛋白1C2)(SEQ ID NO18)编码区和另一个Rbcs-4终止子(SEQ IDNO20)组成。RbcS-4-Ab(L+H)-1C2构建体由Rbes-4启动子、轻链(抗橡胶蛋白1C2(SEQ ID NO16)编码区、RbcS-4终止子、另一个RbcS-4启动子(SEQ ID NO2)、重链(抗橡胶蛋白1C2)(SEQ ID NO18)编码区和另一个RbcS-4终止子(SEQ ID NO20)组成。
构建体Rbcs-2-Ab(L+H)-1C2和RbcS-4-Ab(L+H)-1C2，用SalI、HindIII酶切rbcS-2和rbcS-4启动子，并连接到用SalI和HindIII消化的pVK1-CHC(恒定重链)-rbcS-4-终止子上，得到pVK1-RbcS-2(Rbcs-4A)启动子-CHC-RbcS-4-终止子。用CHC通过BsiWI、EcoRI最早克隆了RbcS-4终止子。通过Bpil、Bsp120I酶切1C2抗体的可变重链区(VH-1C2)并克隆进pVK1-Rbcs-2(Rbcs-4)-启动子-CHC-RbcS-4-终止子载体的同一位点。所得质粒是含有整个H(重)链单位的质粒。用相同策略得到整个L(轻)链单位。L链单位然后克隆进清除了35S-gusA或35SuidA基因的pCAMBIA1301载体。这样得到pCAMBIA1301-L-链。在最后一步中H-链单位插入到pCAMBIA1301-L-链载体以得到最终的pCAMBIA1301-H-L。使用土壤杆菌属(Agrobacterium)介导策略把这种质粒用于植物转化。
Ig-TNFR(ENBREL)构建体含有rbcS-2或rbcS-4启动子，如图23所示TNFR(肿瘤坏死因子受体)部分(489nt)(SEQ ID NO19)包含Ig CHC部分(CH2和CH3域)和终止子。自人mRNA通过逆转录直接克隆TNFR部分，接着为PCR步骤，通过TA-克隆程序连接进pGEM-T-Easy质粒并从双方向用M13-通用且反向引物测序。通过PCR和其后测序获得Ig CHC部分。克隆策略包括将Ig CHC部分连接到BsiWI位点并将启动子引入含有rbcS-终止子的pVK1质粒(pUC19衍生物)。然后将由BsmBl消化的TNFR部分引入这种质粒，并且整个插入片段再克隆进大pCAMBIA1300或pCAMBIA2300质粒中。
在两种变异体中获得IgCHC部分。第一种在它的3′末端没有任何变化，第二种在它的3′末端含有KDEL信号。这种信号是12nt长度的序列AAAGACGAGCTG(SEQ ID NO24)并恰好引进在终止密码子前。在Ig-TNFR构建体中使用几种终止子。一种是与抗体构建体中使用的相同的rbcS-4终止子(约500nt)。另外一种是更长的rbcS4-终止子(约为2kb)。使用的另外一种终止子来自于拟南芥(Arabidopsis)VSP1(植物储存蛋白-1基因)，使用刚好在终止密码子后和切割位点前的部分并与如图24所示的rbcS-4终止子(SEQ ID NO17)的部分相连接。在一些构建体中也引入一种或两种MAR(基质附着区)序列(约2kb)。假使构建体含有两个MAR序列，在启动子前和终止子后引入它们。
实施例4.植物转化为例证本发明的新型启动子的功能性，我们转化了芸苔种植物、烟草(Nicotiana tabacum)植物和亚麻芥植物。本领域技术人员能转化其他物种的植物。
通过叶片圆盘接种(leaf disk inoculation)用携带pCAMBIA1301或pGPTV-HPT二元载体的根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株LBA4404转化芸苔属植物。通过叶片圆盘接种用携带pGPTV-HPT二元载体的根癌土壤杆菌菌株LBA4404转化烟草植物Nicotiana tabacum cv.Samsung。在30mg/l潮霉素上挑选推定的转化体。阳性株系转移进温室以进一步研究。
通过叶片圆盘接种用携带pCAMBIA1300二元载体的根癌土壤杆菌菌株C58(辅助质粒pGV3850)转化亚麻荠属植物。在20mg/l潮霉素上挑选推定的转化体。阳性株系转移进温室以进一步研究。
实施例5.用于表达分析的定量GUS试验用烟草叶或亚麻荠属籽苗进行本实验。在含有2-MET的tris-缓冲液中机械性分散新鲜植物材料。用Bio-Rad测定法测定浓缩于提取物中的蛋白质。使用甲基伞形酮基(methyl-umbelliferyl)做为酶促反应的底物在分光光度计中测定GUS活性。在+37℃孵育30分钟并在450nm波长用分光光度计测量显色。非转基因植物做为阴性对照。
实施例6.用实时RT-PCR和Northern analysis分析mRNA的表达用基因特异性反向引物逆转录自正萌芽芸苔属子叶或亚麻荠属种子或烟草叶分离的总RNA。为已知的所有3′UTR非相似部分和HSA、GUS、抗橡胶蛋白1C2抗体的重链和轻链及核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶SSU编码区的第3个外显子设计该反向引物。使用正向引物和相同反向引物将所得cDNA用于实时PCR步骤。
主要根据手册使用本方法的SYBRgreen定量变通方法在API7000仪器上进行Real-Time程序。被动参比染料(passive referencedye)为ROX。使用来自基因组的PCR扩增产物构建校正曲线并用Real-Time过程中相同引物纯化。结果以每1ng的最初取的RNA样品中分子数目表示。
就Northern分析而言，从植物材料分离总RNA并进行琼脂糖凝胶电泳并转移到膜上。然后通过短暂UV光线照射，使RNA交联在膜上。接下来用自细菌的T7或SP6启动子体外合成的特异性RNA探针杂交。在最适温度尤其适于每个探针的温度下杂交持续一整夜。洗膜后与探针上识别DIG-标记的抗体孵育。通过提高了的发光性使用阴性和阳性对照(不同浓度)检测RNA探针(即特异性mRNA)的量，从而测定实验的样品中特异性mRNA的量。
实施例7在正萌芽种子中核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因和总核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA的表达水平增加直到子叶发育终止在连续光照条件下总RBCS mRNA含量在头3-4天内增加并在接下来的5-7天保持高水平(
图16)。
为了测定不同核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因的表达水平和萌芽期欧洲油菜种子中的总核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA产量，我们通过实时PCR测量了连续光照条件下萌芽0、1、2、3和4天时种子中总核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA的量。如图9所示。
图9(柱1)显示的定量数据表明了每一平均样品1ng的总mRNA内核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶mRNA分子的量或数目。显然，mRNA分子的量从0天-第4天增加，显示出在第4天为最高量。在萌芽的第4天测定大多数样品中RBCS mRNA的量约为每4ng的总mRNA4-7×107分子。
实施例8.在植物正萌芽种子发育阶段RBCS mRNA的rbcS-4类型是最占优势和活性最高的mRNA类型通过上述实时过程分析不同类型的RBCS mRNA的量。通过使用那些mRNA物种(图5)3′UTR的非相似部分特异性引物测定欧洲油菜种子萌芽0天-第4天时rbcS-2、rbcS-3、rbcS-4和rbcS-5的表达水平。设计正向引物使它们有对应于特异性3′UTR类型的长的右部分。每个引物的短的左部分对应于RBCS编码区的末端。其余部分有助于增加长度并从而提高引物Tm，但不干扰其特异性(图5)。
图9(柱3-6)概述的数据表明表达水平的显著不同。在种子萌芽的4天期间最大量表达类型为rbcS-4 RBCS mRNA，但是前面我们注意到至少有两种rbcS基因被部分相似启动子(分别为rbcS-4A和-B、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)驱动并连接到相同3′UTR(3′UTR的rbcS-4类型)。这就可意味着每个rbcS-4基因能促成基因的总活性。但是根据得自rbcS-4B-GUS转基因烟草植物(
图10)的GUS表达定量数据，该启动子活性很低并似乎不显著影响包含3′UTR的rbcS-4型的mRNA总量。
此处提出的数据清楚的表明在植物种子萌芽发育的以后阶段内RBCS mRNA的rbcS-4型的优势。
参考图9显示的结果，实时PCR显示出rbcS-4启动子在萌芽的第4天比任何其他检验的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子更有活性。不同RBCS基因的表达水平遵循不同动力学，例如在第3天rbcS-2(SEQ ID NO3)和rbcS-3(SEQ ID NO21)比rbcS-4(SEQ ID NO22)和rbcS-5(SEQ ID NO23)更有活性。在为萌芽种子或芽内生产外来蛋白质或其他所需基因产物的生产方法挑选启动子时这些特征是非常重要的。
因为在萌芽种子的组织内植物细胞能蛋白质的活动能力提高，所以不稳定的转基因蛋白质可相当快的降解。当使用延迟的动力学活性的启动子例如rbcS-4时，有更多机会保护转基因蛋白质产物的积累不受裂解泡的作用。而且，种子萌芽后期中分析的4种启动子中rbcS-4A是最强启动子，鉴于这一事实，在转基因构建体中使用rbcS-4A有其他好处。
图13比较了在萌芽B.napus种子rbcS-4-HSA转基因或(rbcs-2-HSA)x2转基因中HSA mRNA的积累。(rbcS-2-HSA)x2是一种rbsS-2-HSA的变异体，其中2单位的rbcS-2以串联排列。(rbcS-2-HSA)x2转基因种子中HSA mRNA积累开始更早是显而易见的，另一方面在rbcS-4-HSA转基因植物中HSA mRNA积累开始晚些但积累量稍大。正如图9中可见的，rbcS-4启动子活性动力学比rbcS-2更为延迟，因此甚至在非天然条件下两种启动子均有功能是明显的。在此，天然条件指正常的非转基因，植物含有核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子外加置于基因组适当位点的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因。非天然条件是指象我们的例子的人工环境，芸苔属核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因外加偶然插入到基因组位置的外来报告基因。
实施例9.用于生产所需基因产物的含rbcS-2和rbcS-4启动子的异源或同源转基因植物在芸苔属、烟草和亚麻荠属植物的转化实验中，rbcS-2(SEQ IDNO1)和rbcS-4(SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)启动子用来测定‘启动子强度’并用来比较同源和异源系统中表达水平(即用含有来自相同或不同物种的启动子的构建体转化的植物)。
用反向引物扩增启动子以得到其3′末端上的Nco I相容的限制性酶切位点。使用如实施例2中描述设计的NcoI位点在它的5′末端上的含有GUS基因的pCAMBIA1301载体。
含有启动子rbcS-2(SEQ ID NO3)或rbcS-4A和B(SEQ ID NO1and 2)的构建体插入芸苔属基因组，代表同源系统，相同构建体插入烟草和亚麻荠属植物基因组代表异源系统。如实施例3所述设计与报告基因框架内融合的含有rbcS-2或rbcS-4启动子的重组构建体，并且如实施例4所述转化进植物。
含有rbcS-4A-GUS或rbcS-2-GUS的转基因芸苔属植物的表达数据描述于图7。从萌芽4天的转基因芸苔属植物的种子子叶中检测报告基因的mRNA表达水平。
图7所示的表格证明了1)植物转化体中转基因(GUS)mRNA的表达低于对应的天然核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)基因(rbcS-2或rbcS-4A)的表达约5-6倍；2)转基因植物中天然rbcS-4A基因的表达水平相当于非转基因植物中的表达水平(图9)，但是rbcS-2转基因植物中天然rbcS-2基因的表达水平看起来低于非转基因植物的表达水平。
这种结果可以指出两种启动子的一些性质，换句话说，在同源植物中rbcS-2启动子更多沉默依赖性。
为烟草转化实验使用rbcS-2-HSA和rbcS-4A-HSA构建体，并分别收集7个产HSA植物的每个株系。转基因烟草种子萌芽的第5天时测定HSA基因的mRNA表达水平，结果表明在这些植物株系的所有类型中表达水平大致相同(图8)。这种烟草转化实验清楚的表明在rbcS-2和rbcS-4启动子强度没有显著区别，但是它们二者均在异源体系中表达。
获得并分析带有(harbouring)RbcS-2-GUS、RbcS-4-GUS、Rbcs-2-TNFR-Fc-56UTRshort、Rbcs-2-TNFR-FcKDEL-56UTRshort、Rbcs-4-TNFR-Fc-56UTRlong、Rbcs-4-TNFR-FcKDEL-56UTRlong的转基因亚麻荠属和烟草植物。结果以表格显示于
图18A和B。GUS-活性测定表明rbcS-2(rbcS-4)-GUS转基因植物中酶活性水平高于做为阳性对照的携带常规35Sp-GUS构建体的植物。对于一些含TNFR-Fc的亚麻荠属和烟草植物Northern数据是现有的。该表达水平(对于rbcs-4-TNFR-Fc)与天然rbcS基因的表达水平相当(芸苔属内整个RBCS基因家族总RNA的约50-100pg/μg)。
实施例10.转基因植物中蛋白质表达包含GUS基因编码区的构建体连接到核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子rbcS-4A并用土壤杆菌属介导转化进入油籽油菜(oilseedrape)(芜青)植物。转基因植物生长在温室中直至种子产生。在20℃通气的水中、24℃通气的20mM硝酸钾水中或者在30℃通气的水中使转基因植物的种子发芽。通过在适当的缓冲液中匀化并离心自芽分离不同培养时间后表达的GUS蛋白。用分光光度计测定特异性GUS活性(
图11)。清楚的，在生长培养基中使用KNO3培养72小时后每个芽中GUS活性最高。
也分析了在rbcS-2或rbcS-4控制下携带HSA的转基因欧洲油菜、亚麻荠和烟草植物中蛋白质表达。分析了携带有串联的RbcS-2-HSA构建体的相似植物。从在连续光照和24℃下萌芽4天的芽中分析蛋白质表达。
图15显示了作为总可溶性蛋白质百分数的数据。显然，携带串联构建体的植物比携带单个构建体的植物有更高蛋白质表达水平。而且，显然，在rbcs-4启动子下蛋白质表达水平比在rbcS-2启动子下更高。有两个rbcS-2-HSA构建体的串联构建体是本发明多重构建体的一个实例，并且本领域技术人员也能够用多于两个构建体串联转化植物。相类似的，本领域技术人员能使用有rbcS-4A作为驱动启动子的串联构建体来获得更高蛋白质含量。
分析携带TNFR构建体的转基因亚麻荠和烟草植物的蛋白质表达。结果显示于
图18。
实施例11.为提供最高活性，RbcS启动子必须是全长的将rbcS-2启动子的截断型(0.3和0.6kb长度)克隆到带有报告uidA基因的融合构建体中。通过携带这些构建体的土壤杆菌属(Agrobacterium)转化烟草植物并从成体烟草植物叶检测GUS活性。对比所获得的数据和携带有连接到GUS基因的rbcS-2(1,6kb)或35S启动子的高表达的成年烟草植物分析数据。如
图15显示的结果清楚表明由于启动子长度减少而降低了已记录的GUS活性。因此，显然，rbcS-2启动子的远端区包含支持基本的(非诱导的)启动子活性的必需调控元件。已知的西红柿rbcS1启动子和我们克隆的芸苔属rbcS-2和rbcS-4A启动子的比较分析能够发现在它们中都有相似的共有调控元件(图6)。显然，大多数已知盒位于-500-600nt区。提示那些启动子远端部分可有一些隐藏的调控元件或者由于MAR(基质附着区)位点可能存在于例如rbcS-4A的5′区(计算机MAR预测分析)，所以它们可参与启动子作用。
序列表<110>尤尼克罗普有限公司(UniCrop Ltd)<120>新型的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子及其应用<130>A3542PC-<150>FI 20031052<151>2003-07-10<150>US 60/484,707<151>2003-07-03<150>US 10/884,283<151>2004-07-02<150>PCT/FI2004/000426<151>2004-07-05<160>32<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2175<212>DNA
<213>芜青(Brassica rapa)<400>1gtttcctgag tgttgcacct cctcagtctg agccgtatta agttcaaacc aaactgccgc60ttctgctcta gctttactca ggactgaaac cgaggagtag tgtatcttct caaaagccag120accatttctc gccttccata gatgccagag tatccaagga aaaaacatcg tatcgctatc180ttttggagac ttcctactca tttccaggag atgatataaa cctgccaccg ggagtttgat240cgaggacctt tcccaagtgt ccttcgccat ggggcaagaa aaaagtagat ggcagatcga300ttcaatacca ccattacata ctttgcaagc agagtctact tgaatacctc tactacgaag360acgttccatg accgctaaag ccccagagag agctttccaa aggaaatgct taatttttgg420aggagcacgg atcttccaca gagatttcca aaggtatttc tccaggggag gaagagaagt480tgaaatgcta ccatcttcct caggaagcga atcgacaaat ctttaaccac tccgtgatgt540gtagattcca tcttttgtga agccccactt ataaccatct tcctgcatcc tatttggctt600caagcgaagg atgatctcag catcatgatc agtaaacgtt cttctcacaa gagctgcatc660ccaggcagaa gagttaggga gcagcaggtc tgagattgtc agcgtcagat caatgacact720atcctgtctg tagttaggag tcctcggtat agggtcgata atccaattca cgtgccacac780
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<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1016)<223>RbcS-4B<400>2aacccgaacc gaatccgatc cgataaaaat gaatccgaac cgatccgaat ccgacataaa60taccgaatgg atcctgtttt ttggtatttt gggttatggg tattatccga accgaacccg120gacctaaatg gatatccgat agaacccgaa acatttaaaa tcacaaaaag aacttctacc180aaatatgatc ataattctta atatgtatcc aaaatacttt aagatattat tgaacttcta240aaataattat atgttacatg aaggttgatg gtggaatgtg gcggttgatg cctgaagttt300ttaggttttg gttttgtttt tattgaataa tgtttctcat ttcatgagaa cttatttttt360gttttatgat ttcatttatc tggttttctt tctatcacta actatgttta tattttgctt420gattttgaat gatcacgttt gatgtttttt cttatttttg aatcgatttt acttatgttt480tggctattaa aatatgtaca aatcatgtat tttaaattcg aagaaccgat ttcatttatg540ttttagttac aaaataggta caaatcagat atttttaaac caaagaaccg attgggaccc600gaacccgaaa gtacaatgag ttataccggt tctttgaaga tttactaacc ccgacccgaa660
cccgatagaa cccgaaccgg tcccgaaccg aacttttata taacccgaat ggggttgatt720ttgataaacc cgaaaaaccg aaacccgaat ggataaaacc gaaacccgat tgggaccccg780aatgcccatg cctaccagta accatgcgtt ttcataatac gataagataa gataacgttt840ctgtcacgtg gcattttcat tgtggtcaag tatcgagata agggtatcaa caccgttcat900attcctgtgg ctgttaacga cgatatcatg aaatatccat aagggttctc actctatata960gatgaccaaa gcaatagact aacagtaaga gttaagagaa ggaagaagaa gtagtc1016<210>3<211>1651<212>DNA<213>芜青(Brassica rapa)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1651)<223>RbcS-2<400>3cccttttccg tcataagttt tatatatata aaaacatatt tgcccttctt atctccctca60tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctccctc120
tctctctctc tctctctctc tcatccggcg agtgtaaaca tatataacta ttaaattaat180ttagaaaaca aactgtttaa tatagccaaa aatgaacgtg gggttttagt tgtaaaacaa240aaaaaccata ctaactcaaa tctgaacaca ccgtattttt cttgatgttg aattaccact300tgatttgtca attttaccaa aggaatccct caaaattgta actcaaatgt aatacattat360acatcaaaaa gtaactcaaa aatctaaaaa ctaatcttac atttaaccca aacttaatct420tataacacat tgcttttaat gtaagtatga ttttttggat taataacttt tacattcatt480aaaaaaatca taaaaaatac aacactatct gaccagagct aaatataatt tgtaatcttg540tatcattgcg atagaggcat ccgaaatttc atttaattga gaagttcggt tcggttcagc600atgtttataa aaaaaatggt ttttggctcg ttctgttcgg taatcggtta gatcggtttc660aaaaaaaatt tgttcccaaa tttcaatccg aactaaccta gctaaccaaa acttcgaatc720gaagtaacca agctacctaa aattactcaa aattttgaac cgaactaaca gaattaacca780aaacattgga ccgaattaac caattttacc caaattttta accgaaatat aatcagaacc840aaaaacttaa gttagtttcg gtaaaatttt aaaaactgaa ctacccaaat accaaactga900actgaatttt ttttatgttc gacaagattt tagtcgaacc gaactacctg aatccgcagg960
aagttaccca tcacagagag atgcacaaag cattacctaa aaacgttaca tttagtgttt1020tggtaccact tttattgatt tttttttttg acagctattg atttagttta tagtttttaa1080ctattaagta acagtttgtt tttcgtgtca aaaaaaaaag taacagtttt tatacggttt1140tacttttaac ttaccaatcg gacccactat tcttttgttt ttgttggttt gaatatggac1200atgaccatta cagtagtatc attactcata agttaattag tacgacatac atgtataatt1260caagtacatc tcgtatagta atttcaattg tgaatttaat aatgaaccta atcaaattaa1320gcgaaactaa ttcatataaa tagaaggtcc gcgaacattg aaatgtagat catgcgtcag1380aattgtcctc tctcagtagg aaggagccaa aagcattggc tcaagttgag acgagtaacc1440atacacattc atacgttttc ttacaagata agataagata atgttatttc tacacctttc1500tttaatacct gtggcagtta acgacgatat catgaaatca tgatccttcg atcattaggg1560ctttatacct cttgcgcttc tcactatata tagataacca aagcaataga caaacaagta1620agttaagaga aaagaagaag aagaagtagt a 1651<210>4<211>42
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物e3a<400>4caucaucauc aucaaccgtc aagtccagtg catcagtttc at42<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物atu<400>5cuacuacuac uatttttttt ttttttt 27<210>6<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衔接子<400>6gtaatacgac tcactatagg gcacgcgtgg tcgacggccc gggctggt 48<210>7<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衔接子<400>7accagccc 8<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衔接子引物AP1<400>8gtaatacgac tcactatagg gc 22
<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>UTR2-特异性L1引物<400>9ggccacactt gacaatccga tataacatgc ctca 34<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AP2引物<400>10actatagggc acgcgtggt 19<210>11<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>UTR2-特异性L2引物<400>11caaatggaaa tgaaatgagg tag 23<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-RN<400>12acccgggccc aggagagcat agaggaagcc 30<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-R1<400>13cggtgaatgg agcgaccatc gtggcttgag 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-R2<400>14ctgtgaatgg agcaaccatg gccgcttgag 30<210>15<211>2132<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>密码子优化的人HSA基因<400>15aagcttgaag acgacatgaa gtgggttact ttcatctctc ttcttttcct tttctcttct60
gcttactctg atgctcataa gtctgaagtt gctcatagat tcaaagatct cggagaggag120aacttcaagg ctcttgttct tatcgctttc gctcagtacc ttcagcagtg ccctttcgag180gatcatgtta agctcgttaa cgaggttaca gagttcgcta agacttgcgt tgctgatgag240tcggccgaga actgcgataa gtctcttcat actcttttcg gagataagct ctgcactgtt300gctactctta gagagactta cggagagatg gctgattgct gcgctaagca ggagcctgag360agaaacgagt gcttccttca acataaggat gataacccta accttcctag acttgttaga420cctgaggttg acgtcatgtg cactgctttc catgataacg aggagacttt cctcaagaag480tacctttacg agatcgctag aaggcatcct tacttctacg ctcctgagct tcttttcttc540gctaagagat acaaggctgc tttcactgag tgctgccagg ctgctgataa ggctgcatgc600cttcttccta agctcgatga gcttagagat gagggaaagg cttcttctgc taagcagaga660ctcaagtgcg ctagccttca gaagttcgga gagagagctt tcaaggcttg ggctgttgct720agactttctc agagattccc taaggctgaa ttcgctgaag tttctaagct cgttactgat780cttactaagg ttcacactga gtgctgccat ggtgatcttc ttgagtgcgc tgatgataga840gctgatcttg ctaagtacat ctgcgagaac caggattcta tctcttctaa acttaaggag900
tgctgcgaga agcctcttct tgagaagtct cattgcatcg ctgaggttga gaacgatgag960atgcctgctg atcttccttc tcttgctgca gacttcgttg agtctaagga tgtttgcaag1020aactacgctg aggctaagga tgttttcctt ggaatgttcc tttacgagta cgctagaagg1080catcctgatt actctgttgt tcttcttttg agacttgcta agacttacga gactactctc1140gagaagtgct gcgctgctgc tgatcctcat gagtgctacg ctaaggtttt cgatgagttc1200aagccactag tcgaggagcc tcagaacctt atcaagcaga actgcgagct tttcaagcag1260cttggagagt acaagttcca gaacgctctt cttgttagat acactaagaa ggttccacaa1320gtttctactc ctactcttgt tgaggtttca agaaaccttg gaaaagttgg atctaagtgc1380tgcaagcatc ctgaggctaa gagaatgcct tgcgctgagg attacctttc tgttgttctt1440aaccagcttt gcgttcttca tgagaaaaca ccggtgtctg atagagttac taagtgctgc1500actgagtctc ttgttaacag aaggccttgc ttctctgctc ttgaagttga tgaaacgtac1560gttcctaagg agttcaacgc tgagactttc actttccatg ctgatatctg cactctttct1620gagaaggaga gacagatcaa gaagcagact gctcttgttg agcttgttaa gcataagcct1680aaggctacta aggagcaatt gaaggctgtt atggatgatt tcgctgcttt cgttgagaag1740
tgctgcaagg ctgatgataa ggagacttgc ttcgctgagg agggaaagaa gctcgttgct1800gcttctcagg ctgctcttgg actttaagag ctcttcgctt tcatctaata atatcttctc1860atttcatttc caataagtct gtttcttttt ttctctttgg atttctgtta cgagactttc1920tatatcggat tgtaaaatgt ctgattttat gaacatgtaa tttctatatt gcttcttcgt1980cttggttact ttccgatggc tattaggttt tcaactctta ttgggataag aagccagtca2040aaataactta acaaaacagg ttagataatg ttagtggtat attgtagaat aagaaaagca2100gcaaacagca gtggtgacct ctagaaggat cc 2132<210>16<211>714<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>轻链(抗-橡胶蛋白1C2)编码区<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(66)
<223>小鼠信号肽编码序列<220>
<221>misc_feature<222>(67)..(324)<223>轻链抗-橡胶蛋白1C2抗原可变区<220>
<221>misc_feature<222>(325)..(714)<223>κ轻链恒定区<400>16atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc60agaggagaaa cgacactcac gcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga120gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag180aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc240ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg300caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagtt acagtacccc tcggacgttc360ggccaaggga cacgactgga gattaaacgt cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc420ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt540aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc600accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc660catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttga 714<210>17<211>498<212>DNA<213>芜青(Brassica rapa)<220>
<221>终止子<222>(1)..(498)<223>rbcS-4终止子<400>17ttcgctttca tataataata tcttctcatt tcatttccaa taagtctgtt tctttttttc60tctttggatt tctgttacga gactttctat atcggattgt aaaatgtctg attttatgaa120catgtaattt ctatattgtt tcttcttcgt ggttactact ttcagatggc tattaggttt180
tcaatttatt gggataagaa aacagtcaga ataataactt tacaaaactg gttagataag240gttagtggta atattttttt agaataggaa acattactac ctacggaaaa aaattcatac300gaagttaatt agttcatcaa agattcaaat aacaagcaca gttataaaag aaacaagcat360tgtatcattt catcgtcaca ttgacataga tttcaagcat acagtagtag tcatcatttg420atatttgatg tttcacactc atcatatgca gtttctgaga tcgtatacat actattggtg480cattataatt gcaaataa 498<210>18<211>1434<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重链(抗-橡胶蛋白1C2)编码区<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(57)<223>小鼠信号肽编码序列<220>
<221>misc_feature<222>(58)..(387)<223>重链抗-橡胶蛋白1C2可变区<220>
<221>misc_feature<222>(445)..(990)<223>IgG1重链恒定区<400>18atggaatgga gttggatatt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactctcag60atcaccttga aggagtctgg tcctacgctg gtgaaaccca cacagaccct cacgctgacc120tgtaacctct ctgggttctc gctcagcacc agcggagtgg gtgtgggctg gatccgtcag180cccccaggaa aggccctgga gtggctcgca ctcatttatt gggatgatga taagcgctac240agtccatctc tgaggaacag actcaccatc accaaggaca catccaaaaa ccaggtggtc300cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acaggcacat atttctgtgc acgcagtgtc360aattatgatg acgtttcggg gacttatcac agccacaact ggttcgaccc ctggggccag420ggaaccctgg tcaccgtctc ctcatccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc480tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc540
cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc600ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc660agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag720gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca780gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc840ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac900cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag960ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac1020caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc1080cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc1140ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa1200ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac1260tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc1320accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag1380
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ccccgggtaa atga 1434<210>19<211>558<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>信号序列和TNFR<220>
<221>misc_signal<222>(1)..(69)<223>信号序列<220>
<221>misc_feature<222>(70)..(489)<223>TNFR序列<400>19atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg60cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc120cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg ctcgccgggc180
caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac240agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt300agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc360aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg420cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg480tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg540ccccaccaga tctgtgag 558<210>20<211>576<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>拟南芥属VSP1(植物储存蛋白-1)和部分rbcS-4终止子<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(226)
<223>拟南芥属VSP1<220>
<221>misc_feature<222>(227)..(576)<223>部分rbcS-4终止子<400>20ttaagcatct atcttcatgg cattgtcccc ttgtatccat ttcatatcta tgtcgtttcg60tttatctttg tagccgtttt ggcaccactg cttaaataaa atgccaatcc tatcataact120caataagtac aacgacttcg tactaaattt tgtttttcgt taaagggatc attaatcaag180tttccatgaa atgatgaaca tgtaatttct atattgtttc ttcttcgtgg ttactacttt240cagatggcta ttaggttttc aatttattgg gataagaaaa cagtcagaat aataacttta300caaaactggt tagataaggt tagtggtaat atttttttag aataggaaac attactacct360acggaaaaaa attcatacga agttaattag ttcatcaaag attcaaataa caagcacagt420tataaaagaa acaagcattg tatcatttca tcgtcacatt gacatagatt tcaagcatac480agtagtagtc atcatttgat atttgatgtt tcacactcat catatgcagt ttctgagatc540gtatacatac tattggtgca ttataattgc aaataa 576
<210>21<211>1149<212>DNA<213>芜青(Brassica rapa)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1149)<223>RbcS-1<400>21ctggtaattc tgttttaata acactgtcat gaaaactgaa ttcataggtt tctccaggcc60gtagatagtg gaagcctaga tcgtcgtcgt tagatataca attaatcttc aagatattgt120ttcgaccaag agagttctta aagtgcacgg agtttttttc attccacttt gcgttactca180aacctatgca caatccaata gtgagaagaa aacacgagag acgattcatt gtgttgatta240tttgtaatgg ccttcttcta tagttctttt aaatttagaa gtaatccgta gataaccaag300agggaagatg tgtaatatat atatatatag tggcgttaca cggataagca ctcatttttt360ctctattttt aaacatcttt gttttgacta atattaagaa aacgttgatc gcttttacta420tttttcgtgt ccttatcccg tgttgctgtt ttgcatctat ttaaagagta gatgctatag480
tttttttacg gcttagacta gatgcttttg gtaatttgtt tcagtgttca gctttgaccc540cctttttttg gtgtaaatgt taaaattcag ccttcagctt tgacctttgt gatattatat600gaatgactgt gtttatgtaa aatttattga tttataaaac tcttaagaaa aactatatta660ataaaaaata gaattgttac tcttcttcgt ttgagtatga acataatcat caatagtgct720ctcatcactc ataagttata actaatgacg acattacatg tctgattcaa gtaatttaat780tttcttgtag tacaggtcca cgaagattta aatgtaggtc atgcgtctca tttcttttct840gccaaaagga aggagccaag agaatcggct caagtggaca ctagtaacca tacacattca900ctcattacct tccaagaaaa gataagataa gaaaattttc tgccacgtgg ccttatcata960gtggtctgta tcgataaggg tgtcaacacc tttccttaat cctgtggcag gtaacgacgt1020tatcatcaga catgaatccc gcactctttg atctaagggc tttatgcctc atgccgncct1080cactatatat agatgaccaa aggaatagac aaacaagtaa gtaagagaaa agagaaaaaa1140gaagtagta1149<210>22<211>877
<212>DNA<213>芜青(Brgssica rapa)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(877)<223>RbcS-3<400>22ctggtgattc tattttaata gattaaatat tattctttag aagacgaagc atgagatcga60tgacaacgca atgctcattt catctggttt ttctgtcctt gcctcaattg gttactgtta120cagatgttaa taaatgagta attaccaata ggatacccta agtttttcca aactttcaaa180cccaaaactt actctatttg acttaagagc atttctaaga gcaatgttac ttttagagca240tttctaagag caatgttact tttaaagttt agtgaacttt aaatttgagg tttaagagca300tgtccaatgg ttagaagaca gacttacagt ttaactaccg tgttcagtta ccaatcgggc360ccactatata atattgtttc ccttcttcgt ttatcgacgt tagcattaac agtgtactcc420ttgctcacaa ctaagtagct cataacttgt aatagttata atactaaatg tgatcttatt480aattaactga atcaaactaa gccaatagtt aggagttcca ctaacattaa agagtaggcc540
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<221>misc_feature<222>(1)..(904)<223>RbcS-5<400>23gtcgacaaaa ctcttctttt atgtcgcagg atggtccgaa tgagacaata acaccttcca60tccttctgat gaggtcacat attcaatcat gtcagttaaa gtcacatatc catgcgatgc120
gaatgcagct tgcttcgtct caatgtatta aatacgaatc agactgtatt gttcctactt180gatgacagag tcaacatact tttcccaaag catgggcgtg acgtcgtcac gtagatcgca240ttattgtctt ttatcatata atgaaccggg ctacctttat ctttgggttt ttgaatttgt300tgggctcttt atagaatcgg atcgggcatt gatgagagtg tgaagtccac ctccaacaaa360aactcttgaa ctataactaa tgatgtcctt gtattattag tgataacttt tctaagtaat420gtattgtgga aaattacatg tttgattcaa atcattttct tattaataat taaatattga480ttgagaacta actaaccgaa tcgatgtaca tgccaaactg aatcttacac aattgaacat540aagttcaaac cattaaaagt aggtcaggtt ctgattcttt tttcaattgg aaggagtcaa600aagcatgact caagtggaca ccagtaacca tacacattca ctcattccct cacaagaaac660gataagataa tggaattttc tgccacgtgg ccttatcata gtggtctgta ttgataaggg720tgtcaacacc tttccttaat cctgtggcag gcaacgacgt tatcatgaat cttggaccca780tttattacta gggctttttg tctcttgccg ttctcactat ataaagatga ccaaagcaat840agacaagcaa gtaaaagaaa ggagaaaaag aagaagaaga agaagagaag aactagtaca900cgta 904
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<223>KDEL信号<400>24aaagacgagc tg 12<210>25<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-2-3’UTR-反向<400>25tataacatgc ctcagaaaca aaaag 25<210>26<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-3-3’UTR-反向<400>26cgatatagaa tgtctgagaa acagaaaa28<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-4-3’UTR-反向<400>27cgatatagaa agtctcgtaa cagaaat 27<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-5-3’UTR-反向<400>28ctcagaaaca aaaattcaaa agca24<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-2-3’UTR-正向<400>29ggtgcttaat tcgcgttgta a 21<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-3-3’UTR-正向<400>30tgcttaattt gctatgacat tcacat 26
<210>31<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-4-3’UTR-正向<400>31cggtgcttaa ttcgctttca tat 23<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RbcS-5-3’UTR-正向<400>32ggcgcttaat tttgttgtct aaa 2权利要求
1.一种核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族，其特征为它们为可得自光生长芜青(Brassica rapa)籽苗、能够指导正发育子叶中基因表达的启动子，并包含核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3。
2.一种包含至少一种核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子的表达盒，该启动子选自核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ IDNO3并操作性连接到编码蛋白质或基因产物的异源的或同源核酸序列上。
3.权利要求2的表达盒，其特征为该核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子为SEQ ID NO1。
4.权利要求2的表达盒，其特征为该核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子为SEQ ID NO2。
5.权利要求2的表达盒，其特征为该核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子为SEQ ID NO3。
6.权利要求2的表达盒，其特征为该核酸序列编码人血清白蛋白。
7.权利要求2的表达盒，其特征为该核酸序列为合成的。
8.权利要求2的表达盒，其特征为该核酸序列编码部分医学活性蛋白质。
9.权利要求2的表达盒，其特征为该报告基因编码抗体。
10.一种转化的植物，其特征为该植物或它的后代包含至少一种权利要求2的表达盒。
11.权利要求10的转化的植物，其特征为该植物是芸苔属(Brassica)或亚麻荠(Camelina sativA)。
12.权利要求10的转化的植物，其特征为该植物是亚麻荠种子。
13.权利要求10的转化植物的种子，其特征为该种子包含至少一种权利要求2的表达盒。
14.权利要求13的种子，其特征为该种子是芸苔属或亚麻荠种子；权利要求13的种子，其特征为该种子是亚麻荠种子。
15.权利要求13的转化的萌芽种子的籽苗，其特征为该转基因籽苗包含至少一种权利要求2的表达盒。
16.权利要求16的转基因籽苗，其特征为该籽苗是芸苔属或亚麻荠籽苗。
17.权利要求16的转基因籽苗，其特征为该籽苗是亚麻荠籽苗。
18.一种生产权利要求1的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子家族的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子的方法，其特征为该方法包括评价光生长籽苗中的表达的步骤，鉴别最高表达基因的步骤并从能够指导基因表达到正发育子叶的所述基因启动子中选择的步骤。
全文摘要
本发明涉及一种得自光生长芸苔属籽苗并能指导子叶中表达的新型时空活性的核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶启动子(SEQ ID NOs1、2或3)家族，并涉及特定植物器官或植物发育特定阶段内转基因表达。该启动子有利于设计DNA构建体或盒，其包含至少一种与编码所需基因产物的基因功能性融合的所述启动子序列。收集转化的同源和异源植物种子和转化植物的后代种子，并特别在封闭条件下用于基因产物的有效生产。
文档编号A01H5/00GK1816628SQ200480019143
公开日2006年8月9日 申请日期2004年7月5日 优先权日2003年7月3日
发明者A·阿尼西莫夫, S·凯亚莱宁, K·科伊武, K·琼图宁, A·卡纳瓦 申请人:尤尼克罗普有限公司