通过卵内饲喂肠道调节剂增强卵生物种的发育的制作方法

专利名称：通过卵内饲喂肠道调节剂增强卵生物种的发育的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过卵内施用营养物和/或肠道调节剂而增强卵生物种例如禽、爬行动物和鱼的发育和生长的方法。
缩略语表HMB - β-羟基-β-丁酸甲酯IO- 卵内饲喂LAP - 亮氨酸氨肽酶mm- 毫米mOsm - 毫渗量(milliosmoles)P - P-值R2- 可预测性SD- 标准差
背景技术：
当胚胎卵黄被外源食物替代时，孵化后的禽的营养来源发生改变。孵化的禽必须从基于卵黄营养的食物(主要是脂肪)过渡到固体饲喂食物(主要是碳水化合物和蛋白)。孵化的胃肠道未发育完全的禽实际上仍有卵黄囊附着于其上。孵化后，胃肠道经过快速的形态学、生化和细胞发育以吸收所摄入的营养。由于肠是提供用于生长的前体的器官，其发育对于动物的生长、体重增加、利用食物营养和抵抗肠道疾病病原体方面的最终能力具有重要的作用。
所有卵生物种在孵化过程中其消化食物成分的能力均未发育完全；相应地使得所孵化的禽的生长和肠道疾病抗性受到了很大的抑制。这一消化能力在孵化后的发展通过将肠组织暴露于食物成分而受到促进，但是通常受到影响孵化的各种环境因素的损害。期望能在孵化前增强所述动物的消化能力，因为只有很少的环境因素能在孵育过程中损害肠道发育。此外，由于在许多情形中观察到了更短的孵化期和虚弱的孵化禽(例如当通过年轻母鸡产蛋时)，仍然需要刺激孵化后的禽的肠道发育和生长的新的途径。
已经过卵内施用被导入到具有胚胎的家禽卵中的物质的例子包括活培养物疫苗、抗生素、维生素和竞争性排除培养基。主要参见被授予Hebrank的美国专利US 6,244,214。治疗物质的特定例子被描述于授予Sharma等的美国专利US 4,458,630，和授予Fredericksen等的美国专利US 5,028,421。也参见授予Sharma等的的美国专利US 4,458,630，授予Hebrank的美国专利US 4,681,063，和授予Sheeks等的美国专利US5,158,038。但是，卵内导入治疗物质以增强动物的肠道发育和全面生长迄今为止还未被描述过。
发明概述鉴于前述，本发明的主题的第一方面是一种通过将营养组合物卵内饲喂给卵生动物例如禽以促进该动物的生长的方法。以促进所述动物的生长的有效量施用该营养组合物。在一个实施方式中，该动物的生长在孵化后被增强。在其它实施方式中，该动物的生长在孵化前被增强，而在其它实施方式中该动物的生长在孵化前和孵化后都被增强。所述营养组合物主要包括至少一种选自以下一组的养分碳水化合物、蛋白、肽和氨基酸。任选地，所述营养组合物可以包括矿物质、维生素和其它营养药。在某些实施方式中，所述营养组合物被卵内施用至羊膜液中。
本发明的主题的第二方面是一种通过将肠道调节剂卵内饲喂给卵生动物例如禽以促进该动物的生长的方法。以促进所述动物的肠道发育和/或生长的有效量施用该肠道调节剂。在一个实施方式中，该动物的肠道发育/或生长在孵化后被增强。在其它实施方式中，该动物的肠道发育和/或生长在孵化前被增强，而在其它实施方式中该动物的肠道发育和/或生长在孵化前和孵化后都被增强。在某些实施方式中，所述肠道调节剂被卵内施用到羊膜液中。在一个特定的实施方式中，所述肠道调节剂是β-羟基-β-丁酸甲酯(HMB)，或其可食用的盐。
本发明的主题的第三方面是一种促进禽的生长的方法，该方法包括同时对所述禽卵内施用(i)一种营养组合物，和(ii)一种肠道调节剂。以促进所述禽的肠道发育和/或生长的有效量同时施用所述营养组合物和肠道调节剂。在一个实施方式中，所述营养组合物和肠道调节剂相互协作地促进禽的生长。在一个实施方式中，该动物的肠道发育和/或生长在孵化后被增强。在其它实施方式中，该动物的肠道发育和/或生长在孵化前被增强，而在其它实施方式中该动物的肠道发育和/或生长在孵化前和孵化后都被增强。所述营养组合物主要包括至少一种选自以下一组的养分碳水化合物、蛋白、肽和氨基酸。任选地，所述营养组合物可以包括矿物质、维生素和其它营养药。在一个实施方式中，所述营养组合物和肠道调节剂通过饲喂而施用。
本发明的另一方面是一种养分和一种肠道调节剂(分开或组合在一起)在制备如本申请所述的用于卵生动物的卵内饲喂的组合物中的用途。
相应地，本发明的一个目的是提供一种促进卵生动物例如禽在孵化前和/或孵化后的肠道发育和/或生长的方法，所述卵生动物包括食用动物和非食用动物例如濒临灭绝的物种。
前面已经描述了本发明的一个目的，且本发明对其进行了完整或部分描述，当参照本申请说明书和下述附图时，本发明的其它目的将变得显而易见。


图1是表示卵内饲喂碳水化合物(A)、碳水化合物和HMB(B)、仅HMB(D)和未注射的对照组(C)在孵育的第20天(孵化前一天)对雏鸡空肠绒毛表面积(mm2)的影响的柱状图。柱状图每一柱表示的是10个受检鸡的平均值±SD。
图2是表示卵内饲喂碳水化合物(A)、碳水化合物和HMB(B)、仅HMB(D)和未注射的对照组(C)在孵育的第20天(孵化前一天)对胚肠中的空肠截面的组织观测的组织学效应的照片。组D和B(HMB处理组)显示出比组C和A更发达的绒毛结构。
图3是表示卵内饲喂碳水化合物(A)、碳水化合物和HMB(B)、仅HMB(D)和未注射的对照组(C)在孵化后的第4天对雏鸡空肠绒毛表面积(mm2)的影响的柱状图。柱状图的每一柱表示的是10个受检鸡的平均值±SD。
图4是表示卵内饲喂碳水化合物(A)、碳水化合物和HMB(B)、仅HMB(D)和未注射的对照组(C)在孵化后的第4天对胚肠中的空肠截面的组织观测的组织学效应的照片。组D和B(HMB处理组)显示出比组C和A更发达的绒毛结构。
图5是表示卵内饲喂碳水化合物(A)、碳水化合物和HMB(B)、仅HMB(D)和未注射的对照组(C)在孵育的第18、19、20天、孵化时和4日龄时对雏鸡每克肝组织的糖原含量的影响的柱状图。柱状图每一柱表示的是10个受检鸡的平均值±SD。
图6是表示卵内注射的HMB的量(0.1ml盐溶液中的HMB的微克数)在孵育的第24天对商品火鸡幼雏的孵化率(孵化百分比)的影响的柱状图。
图7是表示卵内注射的HMB的量(0.1ml盐溶液中的HMB的微克数)在孵育的第24天对商品火鸡幼雏的肝糖原浓度的影响的柱状图。
图8是表示卵内注射的HMB的量(0.1ml盐溶液中的HMB的微克数)在孵育的第24天对商品火鸡幼雏的血浆葡萄糖浓度的影响的柱状图。
图9是表示卵内饲喂溶液的毫渗量(mOsm)对仔鸡的孵化能力的影响的图。
优选实施方式的详述本申请所提及的所有专利和文献在本申请中通过引用以其整体被清楚地并入本发明。
可以通过本发明的方法处理的动物概括地说是非-哺乳动物卵生物种例如禽，或冷血动物例如爬行动物、两栖动物和鱼。在某些实施方式中，本申请所描述的方法被用于处理禽。禽的任何物种都可以通过本申请所描述的方法进行处理，包括但不限于被用做食物的禽例如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡和鸵鸟。在其它实施方式中，本申请所描述的方法也可以与饲养濒临灭绝的物种例如美洲鹤一起使用以帮助努力保护那些物种。
本文所用术语“卵内饲喂”或“IO”是指将化合物施用到胚胎羊膜中，所述化合物随后通过口服的方式被胚胎所吸收并因此与消化道的组织相接触。术语“卵内饲喂”被用以描述本申请的方法，因为孵化出的动物在孵化前通过口服摄入羊膜液。因此，将营养物或肠道调节剂施用到胚胎羊膜中是在孵化前给胚胎主要饲喂外源食物。
如本申请中的方法中所使用的那样，卵内饲喂包括将营养物的溶液或悬浮液施用到胚胎羊膜中，任选地一起或分开施用其它调节肠道发育的化合物，以改善孵化出的动物在从胚胎营养在过渡到适应消化食物期间的营养状况。在这一关键时期的最佳营养状况对于消化、骨骼、肌肉和免疫系统发育非常关键，并有助于内稳态激素状态正常化和维持平衡代谢。
本申请的方法的一个方面是在胚胎发育的最后1/4期间将营养物和肠道调节剂卵内输送至胚胎羊膜中。这一方法是有利的，因为羊膜被胚胎口服摄入。因此，卵内施用的饲喂溶液/悬浮液被胚胎所吸收并被呈递给肠组织例如肠上皮细胞和肠粘膜的其它细胞。
在某些实施方式中，本申请所描述的卵内饲喂技术用于增强晚期胚胎和孵化出的动物的肠道发育，并增加孵化出的动物在孵化前和孵化时以及孵化一段时间后(例如2周或3周)的体重(优选增加存活率和疾病抗性)。
本申请所用术语“同时施用”是指两种单独的化合物或组合物间的施用时间非常接近(例如，同时或相继)。同时施用可以任选地通过将这两种化合物或组合物在共同的载体中进行施用(例如，通过将一种肠道调节剂添加到食物组合物中，或将一种营养组合物与一种肠道调节剂组合在一种合适的载体中)。
本申请所用术语“相互协作地”的意思是两种单独的活性剂(例如，一种营养组合物和一种肠道调节剂)的组合效应大于这两种试剂单独施用时将预期到的加和效应。
本申请所用术语“生长”主要是指以下效应中的至少一种相对于没有接受营养组合物和/或肠道调节剂的卵内施用的动物，孵化后或孵化前的体重增加增强或提高，孵化时的孵化出的动物更大，孵化后的食物利用效率提高，达到市场(消费)规模(即预定规模)的天数减少等等。
本申请所用术语“营养物”是指其所饲喂的动物生长所必需的必需营养化合物。营养物包括(a)蛋白质和蛋白质片段(例如肽和氨基酸例如赖氨酸)；(b)碳水化合物(例如糖包括单糖、淀粉、糊精、右旋糖、寡糖和多糖)；(c)脂质；和其它在本领域中被公认为营养物的化合物。
本申请所用术语“营养组合物”是指包含至少一种营养物的食物组合物。在一些实施方式中，营养组合物包含(a)至少一种蛋白质或蛋白质片段，和/或(b)至少一种碳水化合物。营养组合物可以任选地包括矿物质、维生素和本领域中已知的短肽。
该营养组合物的总热量组合物将随着被处理的特定物种而变化，但典型地将在从约1/10、1、5或10卡路里至约20、40、100或200卡路里或更大的范围内变化。对于鸡和火鸡，营养组合物的总热量组合物通常在约0.5或1至约20或40卡路里的范围内变化。因为鸡卵的平均热量含量为约70卡路里，卵内饲喂溶液可以额外地补充鸡卵的总卡路里的0.5％或1％至约10％。
该营养组合物可以任何形式进行施用，包括液体形式、固体形式及其组合形式。合适的形式的例子包括但不限于溶液、乳剂、悬浮液、混合物等等。在一个实施方式中，该营养组合物包括至少一种蛋白质、肽或氨基酸，且可以可选地或额外地包括至少一种碳水化合物(例如单糖或多糖)。在一个普通的实施方式中，该营养组合物包含至少一种碳水化合物。在一个特定的实施方式中，该组合物中的单糖和/或多糖、和/或蛋白、和/或氨基酸贡献了至少约1/10的总卡路里。
本申请所用术语“肠道调节剂”是指一种刺激消化系统的细胞的发育和/或代谢的化合物，这样的细胞包括但不限于肠上皮细胞、杯状细胞、肠淋巴细胞等。合适的肠道调节剂的例子包括但不限于β-羟基-β-丁酸甲酯(HMB)及其可食用的盐、有机锌复合物(例如Zn-氨基酸复合物、Zn-蛋白盐、和Zn与碳水化合物或蛋白或有机酸的螯合物)、凝集素(例如伴刀豆凝集素A、商陆有丝分裂原、面筋抗原、大豆凝集素和来自微生物来源的凝集素)、谷氨酰胺或谷氨酸、精氨酸、肉毒碱、肌酸、维生素A、D或E、甜菜碱、胆碱、卵磷脂、S-腺苷甲硫氨酸、酪氨酸及其代谢衍生物(例如多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素)、色氨酸及其代谢衍生物(例如五羟色胺、N乙酰5甲氧基色胺)、葡糖胺、脂肪酸衍生物(例如ω-3脂肪酸、共轭亚油酸和前列腺素)和抗氧化剂(例如生物类黄酮、抗坏血酸、芸香苷、丁化羟基甲苯(BHT)、乙氧基喹啉、维生素、pyrroliquinoline、苯醌及其衍生物以及类胡萝卜素)。
本申请所用术语β-羟基-β-丁酸甲酯(HMB)包括其可食用的盐是已知的，并被记载于授予Nissen的美国专利US 5,028,440中。可食用的HMB盐包括但不限于Ca-HMB。
肠道调节剂可以任何适当的量施用于卵。对于鸡和火鸡卵而言，适当的量可以是从0.01、0.05或0.1微克/卵至约1、2、3或5微克/卵的范围。肠道调节剂可以以液体或固体溶液的形式而施用。在这一实施方式中，施用给动物的肠道调节剂的量可以表达成所施用的溶液的百分比，该百分比可以是从约0.01％、0.02％、0.05％或0.1％的肠道调节剂至约1.0％、2.0％、5.0％或10.0％的肠道调节剂的范围。
在某些实施方式中，可以将肠道调节剂和营养组合物同时施用于动物。在这样的一个实施方式中，肠道调节剂可以作为与营养组合物制剂分离的配制品进行施用。在另一实施方式中，施用给动物的肠道调节剂可以包含所述营养组合物配制品的一部分。在另一实施方式中，肠道调节剂和营养组合物可以在施用前被一起组合在载体中。
在一个实施方式中，所述施用给动物的组合物或配制品的渗透压不高于约800毫渗量(mOsm)，在特定的实施方式中所述组合物或配制品的渗透压从约50、100、200或300毫渗量至约600或700毫渗量的范围。
如上述，本发明可以在任何类型的卵上实施，包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡和鸵鸟卵。鸡和火鸡卵(包括肉用型鸡卵)被用于本发明的一个实施方式中。被本发明的方法处理的卵是受精卵，在某些实施方式中所述受精卵处于孵育的最后1/4期间。可以在孵育的约第15-19天对鸡卵进行处理，在某些实施方式中是在孵育的约第17或18天对其进行处理。可以在孵育的约第20-26天对火鸡卵进行处理，在某些实施方式中是在孵育的约第22、23或24天对其进行处理。
营养组合物和/或肠道调节剂的注射或施用位点可以是在气室中，或是在羊膜所圈定的区域内包括羊膜液、卵黄囊或胚胎自身。将所述营养组合物和/或肠道调节剂卵内饲喂于该禽，可以将所述营养组合物施用到羊膜液中，然后所述禽可以口服摄入该营养组合物。或者，可以将所述营养组合物和/或肠道调节剂施用到气室中，其中可以在内部管道上被口服摄入所述组合物(或通过横跨气室膜进行扩散)。在另一个实施方式中，所述营养组合物和/或肠道调节剂可以通过直接注入卵黄囊内进行施用。因此，在一个实施方式中，所述营养组合物被沉积在羊膜液中；在另一个实施方式中，所述肠道调节剂被沉积在气室中。所述营养组合物和/或肠道调节剂的施用区域可以是相同的或不同的。例如，可以将所述营养组合物施用到羊膜液中，可以将肠道调节剂施用到气囊中，反之亦然。在一个实施方式中，将肠道调节剂和营养组合物一起施用到同一区域例如羊膜液中。
施用的具体机制不是实施本发明的方法的关键，但是期望该施用方法不过度损伤所述胚胎的组织和器官，这样所述处理将不会显著地降低孵化能力和/或孵化率。配有约22号或23号规格的针头的注射器适用于该目的，不过其它大小的针头和其它的输送方法同样是有用的。对于注入羊膜液中的情形，所述针头被插入到所述卵中。在插入所述针头前，可任选地打出一导向孔或将其穿过外壳以防止针头损伤或变钝。如果需要，可以在注射后用密封材料例如蜡或类似物质将所述卵密封以防止此后进入不希望有的细菌。
用于禽类胚胎的高速、自动化注射系统特别适用于本发明。典型的高速、自动化注射系统包括但不限于那些在授予Miller的US 4,040,388和US 4,469,047，以及授予Miller和Sheeks的US 4,593,646中所记载的系统。有用于本发明的方法的其它系统被记载于授予Hebrank的两篇专利US 4,903,635和US 4,681,063中。有用的注射系统可以从Embrex Inc.，Research Triangle Park，North Carolina，USA.商购获得。
施用所述营养组合物和/或肠道调节剂后，将卵孵育至孵化。然后给活着的动物饲喂一种合适的饲料组合物并如上述进行生长，典型地生长至少1-2周的一段时期，这取决于特定的物种和该物种的最终用途。所述营养组合物和/或肠道调节剂的施用所导致的孵化后生长的增强也可以在所产生的整个动物群体中观测到。所述营养组合物和/或肠道调节剂的施用所导致的孵化前生长的增强也可以在所产生的整个动物群体中观测到。
如上述，本发明的技术的一个方面涉及用于本申请的动物卵内饲喂的组合物和这种组合物的用途。这种组合物可以通过将上述的一种或多种营养物以上述的量进行组合，和/或通过将如本申请所述的肠道调节剂组合在一种合适的用于施用的载体中来而制备。在一个实施方式中，所述载体适于注射施用。在一个特定的实施方式中，所述组合物是一种适于是注射到卵黄囊内的乳剂。适合的载体包括但不限于水和盐溶液。所述组合物将通常具有上述的渗透压。在本发明的一个实施方式中，所述组合物是无菌的。所述组合物可以如上述被制备成单位剂量的形式或用于以合适的注射工具进行注射的一次注射量的形式。
以下的非限制性实施例被包括在内以举例说明本发明的优选的具体实施方式
。以下实施例的某些方面是按照本申请的发明人所建立或预期能很好地实施本发明的技术和程序进行描述。这些实施例通过使用本申请发明人的标准实验室程序进行例证。根据本发明所做公开和本领域的普通技术水平，本领域技术人员将认识到以下实施例仅用于例证，在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以对其应用众多的变形、修饰和改变。
实施例1-4的实验方法和材料用肠道调节剂HMB卵内饲喂肉鸡正在孵化的肉仔鸡卵来自39-40周龄的商品Ross种群，它们是根据标准孵化程序和条件进行孵育的。在孵育的第18天，将含有活的胚胎的卵进行称重，并将其分为4个处理组，每组100枚卵。平均卵重为55克，然后根据相似的重量频率分布将这些卵分为不同的处理组。然后用23号规格的针头将4组卵内饲喂处理溶液中的其中一组(每枚卵1ml)注射到每组100枚卵的羊膜中。4种卵内饲喂处理包括A)于0.5％NaCl盐溶液中的20％糊精+3％麦芽糖；B)于0.5％NaCl盐溶液中的20％糊精+3％麦芽糖+0.1％Ca-HMB；C)未注射的对照组；和D)于0.5％NaCl盐溶液中的0.1％Ca-HMB。自Metabolic Technologies，Inc.，Ames，Iowa，USA获得Ca-HMB。注射后，将所有卵放置于孵化篮中使得每一处理平均分布到孵化器的每个区域。
在孵育的第19和第20天、孵化时和孵化后的第4天对每一处理组取样10枚卵以测定肝糖原浓度和空肠绒毛表面积。于孵化时和10日龄时测定每一处理组的10只禽的相对的胸肉大小。在孵化时和在10日龄时进行称重(每处理组约70只禽)。
实施例1肠道调节剂对肉鸡体重的影响上述卵内处理对体重的影响的结果示于表1。
表1卵内饲喂碳水化合物(A)、碳水化合物和HMB(B)、仅HMB(D)和未注射的对照组(C)在孵化时和孵化后第10天后对肉鸡体重的影响。1

1每个平均值表示每一处理组约70只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
所有3种卵内饲喂处理显著地(P＜0.05)将孵化时的体重相对于对照组处理增加了3％。在10日龄，所有卵内饲喂处理仍然具有较重的体重，但是只有含HMB和碳水化合物的卵内饲喂处理(处理B)相对于对照组体重显著(P＜0.05)增加了4.8％。这些结果表明，直至孵化后10天，肠道调节剂HMB加强和帮助维持碳水化合物卵内饲喂溶液的效应。
实施例2肠道调节剂对肉鸡胸肉重的影响除了对体重的积极作用以外，卵内饲喂还显著提高了相对于体重的胸肌重量(表2)。在孵化时，相对于对照处理组，单独卵内饲喂HMB增加的相对胸肉大小(体重的百分比)为15.1％。尽管相对于对照组卵内饲喂碳水化合物溶液在孵化时仅增加了3.6％的胸肉大小，将HMB添加到碳水化合物卵内溶液中将该效应增大至7.3％。到第10日龄，与对照组处理相比，所有的卵内饲喂处理都显著增加了相对胸肉大小。10日龄时，各卵内饲喂处理间没有显著的差异。
肉鸡的经济价值在很大程度上与其胸肉产量相关。胸肉产量潜力在胚胎发育的最后一阶段和孵化后的头几天期间被建立起来。孵化后头10天期间所观测到的胸肉产量上的任何增加可以维持至上市日龄。这些结果表明卵内饲喂增强了早期肌肉发育，尤其是如果卵内饲喂溶液含有HMB时。
表2卵内(IO)饲喂碳水化合物(A)、碳水化合物和HMB(B)、仅HMB(D)和未注射的对照组(C)在孵化时和孵化后第10天后对肉鸡的相对胸肉重的影响。1

1每个平均值表示每一处理组约70只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
实施例3肠道调节剂对肠吸收表面积的影响卵内饲喂处理对体重和早期肌肉发育的许多正效应与肠道发育和吸收营养的能力的增强有关。吸收营养的能力与吸收表面积成正比。在卵内饲喂后两天(孵育的第20天)，卵内饲喂处理显著地增加了肠(空肠)绒毛的表面积(图1)。碳水化合物溶液的卵内饲喂(处理A)相对于对照组的绒毛表面积增加了50％，而单独卵内饲喂HMB导致相对于对照组的绒毛表面积增加了超过140％。此外，HMB显著地增强了卵内饲喂碳水化合物溶液的正效应。在孵育的第20天进行的组织学观测也显示出了显著的卵内处理的处理效应(图2)。在对照组处理中(组C)，观测到绒毛处于发育的两个不同的阶段一半绒毛出现了绒毛芽，而另一半是更大的发育的绒毛结构。此外，所述绒毛下的黏膜结构的发育和有序性均明显不如在卵内饲喂处理组所观测的那样。
在接受了碳水化合物卵内饲喂溶液(处理A)的20-日龄胚胎的平均绒毛大小大于对照组，但两个发育期的绒毛阶段仍很明显。相反，接受了HMB的胚胎(处理B和D)明显地具有更大的绒毛结构，并且既便存在如在处理C和A的胚胎中观测到的小绒毛芽，也是极少的。绒毛表面积测量和组织学观测清楚地表明了卵内饲喂增强了肠道发育并增加了吸收的表面积，尤其是当包含了HMB时。这些观测结果表明当将HMB卵内施用到胚胎羊膜中时，其增强或促进了肠道发育。
在孵化的第4天，接受了卵内饲喂处理的仔鸡继续呈现出显著更大的空肠绒毛的表面积(图3)。单独卵内饲喂了HMB的仔鸡(处理D)相对于对照组仔鸡其空肠绒毛的表面积大40％，这表明卵内饲喂HMB的益处持续到了孵化后的最初的几天。尽管在孵化后第4天，碳水化合物卵内饲喂溶液(处理A)相对于对照组增加了约30％绒毛表面积，将HMB添加到碳水化合物卵内溶液中(处理B)未导致任何可观测到的有益效果。
孵化后4天所进行的组织学观测也揭示相对于碳水化合物处理对照而言，HMB卵内饲喂的禽具有增加的绒毛长度和均匀度(图4)。在图4中，组D和B(HMB处理)显示出较组C和组A更为发达的绒毛结构。
实施例4肠道调节剂对肉鸡肝糖原水平的影响肝糖原含量是幼仔鸡的能量状态的指示剂。糖原是激发孵化过程和维持所述仔鸡直至建立起正常采食之前所需的最初能力供给。高肝糖原含量，尤其是正好在孵化前和刚孵化后的高肝糖原含量，是激发早期发育所必需的良好能量水平的指示剂。
图5表明了卵内饲喂处理对肝糖原含量的影响根据胚胎或仔鸡的年龄而不同。如期望的那样，在孵育的第18天没有处理效应，因为这是处于在施用卵内处理之前。在孵育的第19天(卵内饲喂24小时后)，单独卵内饲喂了碳水化合物溶液的胚胎(处理1)相对于经过其他处理饲喂的胚胎的肝糖原含量显著更高。到孵育的第20天，单独卵内饲喂了HMB(处理D)的胚胎显著增加了肝糖原含量，该含量持续至孵化时和孵化后4天。在孵化时，所有的卵内饲喂处理都具有增加的肝糖原，最高达到相对于对照组处理的6倍。
实施例5卵内肠道调节剂和蛋白质对于从年轻母鸡孵化出的肉鸡的影响实施例1-4举例说明了卵内饲喂HMB对于小鸡的早期生长和发育有着积极的影响，无论卵内饲喂溶液是否包含碳水化合物。在这一实施例中，将HMB作为肠道调节剂添加到所有含有蛋白质和/或碳水化合物的卵内饲喂溶液中，具体如下孵化的肉仔鸡卵是来自30周龄商品Ross种群，它们是按照标准的孵化程序和条件孵育的。在孵育的第十八天，对含有活的胚胎的卵进行称重并把它们分为四个处理组，每组100枚卵。平均每枚卵重48克，然后根据相似的重量频率分布将这些卵分为不同处理组。每个处理组中的100枚卵都是用23号的标准针头将四种卵内饲喂溶液中的一种注射到羊膜中(每枚卵1毫升)。四种卵内处理包括P)于0.5％NaCl盐溶液中的0.1％Ca-HMB+24％卵白蛋白；PS)于0.5％NaCl盐溶液中的0.1％Ca-HMB+8％卵白蛋白+12％糊精+6％麦芽糖；C)未注射的对照组；和S)于0.5％NaCl盐溶液中的0.1％Ca-HMB+12％糊精+6％麦芽糖。所有的卵注射完后，把它们放在孵化篮中使得每个处理平均地位于孵化器的每个区域。在孵化时、10日龄和28日龄时称重(每个处理组约70枚)。
含有碳水化合物+HMB的卵内饲喂溶液(处理S)显著地增加孵化体重超过对照组3％，并且这种效应一直持续到28日龄(表3)。在同时卵内注射HMB以及蛋白质和碳水化合物的组合(处理PS)的仔鸡中也观测到类似的或略好的体重情况。但同时卵内注射蛋白质和HMB在孵化时及随后并没有显著地增加体重，就如实施例1中描述的那样。
表3.卵内饲喂蛋白质+HMB卵内饲喂溶液(P)，蛋白质+碳水化合物+HMB(PS)，和碳水化合物+HMB(S)相对于未注射的对照组(C)以及该对照组本身对孵化时、孵化后第10天、孵化后第28天的肉鸡体重的影响。1

1每个平均值表示每一处理组约70只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
本实施例和实施例1的结果之间的主要区别是产这些孵化卵的种群的年龄。在本实施例中，所使用的卵比实施例1的要小，并相对于在实施例1的实验中所使用的卵而言来自更年轻的母鸡。尽管本发明不被某种特定的理论所束缚，来自年轻种鸡的胚胎比更老的种鸡的胚胎的卵内资源更少，且相对于更老的种鸡的胚胎它们对蛋白质和碳水化合物的应答更明显。在本实施例中所提供的体重数据证明了HMB有助于包括或不包括蛋白质的碳水化合物卵内饲喂的积极效果维持直到28日龄。
用于实施例6-9的实验方法和材料给火鸡卵内饲喂肠道调节剂孵化的火鸡卵是来自35周龄商品杂交种群，它们是按照标准孵化所的程序和条件孵化的。在孵育的第23天，对含有活胚胎的卵称重，并把它们分成四个处理组，每个处理100枚卵。平均卵重75克。然后根据相似的重量频率分布，将这些卵分为不同处理组。每个处理组中的100枚卵都是用22号的标准针头将四种卵内饲喂溶液中的一种注射到羊膜中(每枚卵注射2毫升)。五种卵内处理包括A)于0.4％NaCl盐溶液中的18％卵白蛋白；B)于0.4％NaCl盐溶液中的18％卵白蛋白+0.1％Ca-HMB；C)未注射的对照组；D)于0.4％NaCl盐溶液中的0.1％Ca-HMB，和S)于0.4％NaCl盐溶液中的20％糊精+3％麦芽糖。在注射完所有的卵后，然后把它们放在孵化篮中使得每个处理平均地位于孵化器的每个区域。在孵化时、3日龄和7日龄称重(每个处理组约70只禽)。在孵化后的第一天和第七天抽取每个处理组的10枚卵，测量它们相对的胸肌重，肝脏和胸肌中的糖原总量，以及每克肠的亮氨酸氨肽酶(LPA)和麦芽糖酶的活性。
实施例6肠道调节剂对火鸡体重的影响表4中显示不同的卵内饲喂溶液处理对体重和早期生长的影响。表4.卵内饲喂蛋白(A)，蛋白+HMB(B)，HMB(D)，和碳水化合物(S)相对于未注射的对照组(C)以及该对照组本身对火鸡孵化后1，3和7日龄的体重的影响1。

1每个平均值表示每一处理组约70只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b，c同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
与对照组处理相比，所有的卵内饲喂溶液都显著地提高了孵化时的体重(P＜0.05)。接受碳水化合物或蛋白质的卵内饲喂溶液的幼禽都可以观测到孵化时的最大体重。仅接受HMB卵内饲喂溶液对孵化时的体重产生积极应答，但是降低了卵内饲喂蛋白质的正效应，很可能因为能量是促进早期生长的限制因素。尽管蛋白质和碳水化合物两者对孵化时的体重的影响最大，但是他们的效应没有持续至3日龄和7日龄。相反，那些单独注射HMB或者和蛋白质一起注射的幼禽，它们不仅保留了相对于对照组在体重方面的优势，而且这一优势随着所述禽的生长而增加。因为HMB在早期发育时期用于增强肠道发育，所以幼禽能够在孵化后的第一周更有效的利用食物营养以激发更迅速的生长。
实施例7肠道调节剂对火鸡胸肉重量的影响卵内饲喂对早期生长的影响与孵化时和7日龄的胸肉大小的增加有非常大地的关系。在孵化时仅卵内饲喂蛋白质溶液的幼禽比对照组幼禽的肌肉重22％，但是这一优势没有持续到7日龄(表5)。同样，在孵化时观测到卵内饲喂碳水化合物溶液的幼禽比对照组幼禽胸肉大10％，但没有持续到7日龄。在孵化时，卵内饲喂HMB的幼禽的胸肉重比对照组显著的高(14％)，但当HMB与蛋白质联合进行卵内饲喂溶液没有观测到这一HMB效应。HMB与蛋白质对孵化的这种明显的负相互作用可能与促进蛋白质同化作用的热能有限这一因素有关。然而，以HMB单独卵内饲喂或者和蛋白质一起进行卵内饲喂的幼禽，在第7日龄分别使胸肉重提高8.6％和6.5％。这些数据表明HBM是刺激和维持关键组织的早期生长的重要因素。
表5.卵内饲喂蛋白质(A)，蛋白质+HMB(B)，HMB(D)，和碳水化合物(S)相对于未注射的对照组(C)以及该对照组本身对孵化后第1和7日龄的胸肉重量的影响，胸肉重量被表示为其占火鸡体重的百分比1。

1每个平均值表示每一处理组约10只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
实施例8肠道调节剂对火鸡糖原水平的影响肝脏和肌肉中的糖原含量是孵化的禽的代谢上可利用的能量状态的状态指示剂。因为总糖原储量的增加，孵化的禽承受压力阶段的能力也提高，禽类更有可能通过重重苦难存活下来。在孵化时，蛋白质的卵内饲喂使得的肝脏中糖原总量显著的增加，这表明蛋白质的卵内饲喂能真正地促进糖原异生(表6)。相反，碳水化合物的卵内饲喂可以抑制糖原异生，即使卵内饲喂额外的卡路里能被转化为糖原。HMB的卵内饲喂也能显著地提高孵化时的肝糖原总量，但是这一积极效应当HMB和蛋白质联合卵内饲喂时就消失了，这是因为能量太有限以至于不能完全利用蛋白质和/或HMB。但是，在7日龄之前，HMB和蛋白质的联合卵内饲喂使得肝糖原总量最高，可能这是因为从食物来源储存了足够的卡路里。同样，单独的蛋白质或碳水化合物的卵内饲喂在7日龄时产生了较好的能量状况，如由肝糖原总量所指示的那样。
表6.卵内饲喂蛋白质(A)，蛋白质+HMB(B)，HMB(D)，和碳水化合物(S)相对于未注射的对照组(C)以及该对照组本身对孵化后1日龄和7日龄的火鸡的肝糖原总量的影响1。

1每个平均值表示每一处理组约10只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
卵内饲养对火鸡幼禽的肌糖原的影响示于表7中。肌糖原是孵化过程中和孵化后的最初几天的首次碳水化合物储备之一。实际上，肌糖原和肌蛋白储量可以被用于构造肝糖原储量以对在初生动物中经常发生的应激事件的有所准备。因此，降低的肌糖原常常与提高的肝糖原相关。尽管单独卵内饲喂蛋白质增加了总肝糖原，其带来的损失是孵化时的肌糖原显著降低。HMB能提高蛋白质卵内饲喂的幼禽的肌糖原水平，不过其仍显著低于对照组。相反，单独卵内饲喂HMB导致肌糖原含量相对于对照组的增加＞25％。因此，HMB提高了肝脏和胸肉两者中的糖原总量，且这一正向效应在肌肉中一直持续到第7日龄。碳水化合物的卵内饲喂也增加了孵化时的肌糖原，且该效应持续到直至7日龄。
表7.卵内饲喂蛋白质(A)、蛋白质+HMB(B)、HMB(D)，和碳水化合物(S)与未注射的对照组相比及该对照组(C)在孵化后第1天和第7天对火鸡的胸肉的糖原含量的影响。1

1每个平均值表示每一处理组约10只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b，c，d同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
实施例9肠道调节剂对火鸡麦芽糖酶和LAP活性的影响麦芽糖酶和亮氨酸氨肽酶(LAP)是肠刷状缘酶，它们涉及到在简单的单糖和氨基酸和二肽被转运横跨肠细胞膜之前碳水化合物和蛋白质的最终消化。表8和表9显示了证明不同的卵内饲喂溶液对麦芽糖酶和LAP活性的影响的数据。
HMB被发现对于这些消化酶没有显著的影响，这表明HMB的效应与肠组织的生长和发育的调节而非蛋白质或碳水化合物的消化严格相关。相对于对照组，蛋白质的卵内饲喂明显地降低了麦芽糖酶活性(碳水化合物消化的一种指示剂)，但是卵内饲喂碳水化合物在孵化时和第7日龄增加了麦芽糖酶的活性(表8)。
相反，孵化中的LAP活性通过蛋白质的卵内饲喂而被显著地降低，但当HMB包括在基于蛋白质的卵内饲喂溶液中时，这一效应发生了逆转。到7日龄，LAP活性通过蛋白质的卵内饲喂得到显著增加，通过卵内饲喂碳水化合物该LAP活性甚至增加得更多。蛋白质和碳水化合物酶活性显然是受到卵内饲喂物质的最大影响，而不是肠道生长调节剂例如HMB。
表8.卵内饲喂蛋白质(A)、蛋白质+HMB(B)、HMB(D)，和碳水化合物(S)与未注射的对照组相比及该对照组(C)在孵化后第1天和第7天对火鸡的肠刷毛寄生型麦芽糖酶活性的影响。1

1每个平均值表示每一处理组约10只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
表9.卵内饲喂蛋白质(A)、蛋白质+HMB(B)、HMB(D)，和碳水化合物(S)与未注射的对照组相比及该对照组(C)在孵化后第1天和第7天对火鸡的肠刷毛寄生型亮氨酸氨肽酶(LAP)活性的影响。1

1每个平均值表示每一处理组约10只仔鸡的平均值。
2括号内表示相对于对照组增加的百分比。
a，b同一列中具有不同的字母上标的平均值具有显著的差异(P＜0.05)。
实施例10肠道调节剂的剂量在火鸡中的效应300只商品火鸡卵在一冷却器中于55°F贮藏3周，然后将其放置于一孵卵器中。孵育24天后，通过透光检测鉴定为受精的卵被随机分为5组，每组50枚卵。用含有0、0.1、1.0、10.0和100.0微克的Ca-HMB的0.1ml盐(0.89％NaCl)溶液以0.25英寸的深度注射到每一组的50枚卵的气室中。
注射后，将所述卵放置在孵化篮中使得各处理平均分布到该孵卵器的每个位置。在孵育的第28天，从孵卵器中汇总孵化的幼禽，记录每一处理组所孵化的幼禽。然后将所孵化的幼禽屠宰，并根据已知技术(参见Donaldson and Christensen，Comp.Biochem.Physiol.98A，347-350(1991))对血液葡萄糖进行测定。摘除肝脏并通过已知技术(参见Dreilinget al.，Meat Sci.20，167-177(1987))对各肝脏的糖原含量进行测定。
图6图解了注射到24日龄的火鸡胚胎的卵中的HMB的量的效应。对照处理(0微克HMB)的孵化率很低，这是在置于孵卵器中之前存放了3周的产蛋后期的火鸡卵的特征。但是，当将0.1和1.0微克的HMB注射到处于孵育第24天的卵中时，孵化率从72.3％提高至81.6％。当所注射的HMB水平提高到1.0微克以上时，孵化率降低。当卵内注射的HMB的水平提高时，存在着显著的二次剂量应答(P＜0.05)。
卵内注射的HMB剂量对火鸡幼禽中的肝糖原含量的影响图解于图表7。与对照组相比较，所有HMB剂量水平使肝糖原含量增加了约40％。当卵内注射的HMB的水平提高时，存在着显著的二次剂量应答(P＜0.5)。孵化率与孵化前火鸡和仔鸡的胚胎的肝糖原含量呈正相关。
图8图解了仅0.1微克的HMB剂量导致了显著增加的血浆葡萄糖浓度。与对照组相比，其它HMB剂量水平对于血浆葡萄糖没有显著的影响。这些结果表明0.1微克的HMB剂量水平可能不是影响幼禽的血浆葡萄糖水平的最低功能性剂量。
总而言之，将0.1-1.0微克的HMB卵内注射到24日龄的火鸡胚胎中显著增加了孵化率，这显然是归因于肝糖原储量的增加。
实施例11卵内饲喂溶液的毫渗量对于孵化能力的重要性将各种毫渗量程度的溶液卵内注射到受精的肉仔鸡孵化卵的羊膜中。记录受精卵的孵化百分比。结果示于图9中。
图9图示了卵内饲喂溶液的毫渗量对于仔鸡孵化能力的重要性。当用具有低于800mOsm的溶液进行注射时观测到了满意的仔鸡的孵化能力，在约400-600mOsm处观测到最佳孵化能力。当卵内饲喂溶液超过800mOsm时，观测到了不满意的孵化率。卵内饲喂溶液的同渗容摩对孵化能力的影响通过一数学模型是高度可预测的(R2＝0.97)。
将能理解本发明的各细节可以在不偏离本发明的范围内进行改变。此外，上述的描述仅用于举例说明而非对本发明的限制，本发明由所附权利要求书所限定。
权利要求
1.一种促进禽的生长的方法，该方法包括以有效促进该禽生长的量将一种肠道调节剂卵内施用于该禽。
2.权利要求1的方法，其中在孵化前促进所述禽的生长。
3.权利要求1的方法，其中在孵化后促进所述禽的生长。
4.权利要求1的方法，其中在孵化前和孵化后促进所述禽的生长。
5.权利要求1的方法，其中所述肠道调节剂的施用进一步在孵化前促进所述禽的肠道发育。
6.权利要求1的方法，其中所述禽选自以下一组鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡和鸵鸟。
7.权利要求1的方法，其中所述肠道调节剂选自以下一组β-羟基-β-丁酸甲酯(HMB)及其可食用的盐、有机锌复合物、凝集素、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、肉毒碱、肌酸、维生素A、维生素D、维生素E、甜菜碱、胆碱、卵磷脂、S-腺苷甲硫氨酸、酪氨酸及其代谢衍生物、色氨酸及其代谢衍生物、葡糖胺、脂肪酸衍生物和抗氧化剂。
8.权利要求7的方法，其中所述肠道调节剂是HMB或Ca-HMB。
9.权利要求7的方法，其中肠道调节剂是一种有机锌复合物。
10.权利要求7的方法，其中所述肠道调节剂是一种凝集素。
11.权利要求1的方法，其中的施用步骤在卵内孵育的最后1/4期间进行。
12.权利要求1的方法，该方法进一步包括将所述禽孵育至孵化的步骤。
13.权利要求1的方法，其中所述肠道调节剂以介于约0.05微克/禽和1.0微克/禽之间的量卵内施用到所述禽中。
14.权利要求1的方法，其中所述肠道调节剂以约0.1微克/禽的量卵内施用到所述禽中。
15.权利要求1的方法，其中所述肠道调节剂以包含该肠道调节剂和一种可食用的载体的组合物的形式而施用。
16.权利要求15的方法，其中所述组合物是包含约0.05％到1.0％之间的肠道调节剂的一种溶液。
17.权利要求16的方法，其中所述溶液包含约0.1％的肠道调节剂。
18.权利要求15的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种碳水化合物。
19.权利要求15的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种蛋白质。
20.权利要求15的方法，其中所述组合物的渗透压不高于800毫渗量。
21.权利要求1的方法，其中所述施用通过注射到所述禽的羊膜液中进行。
22.权利要求1的方法，其中所述施用通过注射到所述禽的卵黄囊中进行。
23.权利要求1的方法，其中所述肠道调节剂与一种营养组合物同时施用。
24.权利要求23的方法，其中所述肠道调节剂和营养组合物在施用前被共同组合在一载体中。
25.权利要求23的方法，其中所述营养组合物包含至少一种碳水化合物和至少一种蛋白质。
全文摘要
本发明涉及通过卵内施用肠道调节剂例如HMB而增强卵生物种例如禽的发育和生长。该肠道调节剂被施用到羊膜内，然后被受试者口服摄入。该肠道调节剂增强了所述受试者在孵化前的肠道发育，并在孵化前或孵化后增强了该动物的生长。
文档编号A01K45/00GK1816354SQ200480018721
公开日2006年8月9日 申请日期2004年6月29日 优先权日2003年6月30日
发明者泽哈瓦·尤尼, 彼得·菲尔基特 申请人:北卡罗来纳州大学, 耶路撒冷希伯来大学依苏姆研究发展公司