Nkx6.1在胃癌、肝癌发病机制中的作用
【技术领域】
[0001] 本文发明涉及基因表达在癌症发病机制中的作用，特别是涉及胃癌与肝癌。
【背景技术】
[0002] 胃癌与肝癌均是在全世界范围内高发的恶性肿瘤之一，预后较差，大多数患者在 确诊时已经失去了手术根治的机会，目前恶性肿瘤治疗常采用手术、化疗、放疗、生物反应 调节剂治疗相结合的综合治疗，但总体疗效仍不令人满意。因此，人们在不断寻找新的治疗 方法。随着新理论的确立和新技术的不断涌现，为恶性肿瘤新疗法的出现打下基础。同源 盒蛋白（hemeoprotein)NKX6. 1在肿瘤中表达受影响，星形细胞瘤、急性淋巴细胞性白血病 和宫颈癌与NKX6. 1基因启动子CpG岛甲基化关系密切，但是NKX6. 1在胃癌与肝癌中的研 究，以及抑制恶性肿瘤凋亡的机制目前还未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明发现了 NKX6. 1在胃癌与肝癌中均表达增高，具有促进增殖和抑制凋亡的 作用，并且发明了两对siRNA，以及一种干扰NKX6. 1表达的重组慢病毒，均可化学合成，具 有沉默NKX6. 1表达效率高，对胃癌、肝癌有潜在治疗作用。
【具体实施方式】
[0004] 沉默NKX6. 1表达的siRNA对胃癌、肝癌细胞的促增殖及抑制凋亡研究 [0005] 1细胞培养、转染及感染
[0006] 1. 1细胞培养
[0007] 细胞培养箱设置为37°C，5% C02，饱和湿度条件下，人胃癌HGC27及MKN45细胞， 人肝癌31(-!1印-1及311(：-7721分别在含10%胎牛血清的1^]\〇-1640及01^]\1培养液中传代 养。
[0008] 1.2细胞转染
[0009] 1. 2. 1转染前一天，将处于对数生长期的1. 5X 106个HGC27、MKN45、SK-H印-1及 SMMC-7721细胞接种在6孔板上，1. 5ml含10% FBS的RPMI-1640及DMEM培养基培养，24h 细胞密度达到30-50%。
[0010] 1. 2. 2 200pmolNKX6. lsi-Ι用无血清Opti-MEM细胞培养基稀释成终体积185ul， 轻轻混匀。
[0011] 1. 2. 3在24ul的无血清Opti-MEM细胞培养基中加入脂质体OligofectamineTM 6ul，轻轻混匀室温下放置5min。
[0012] 1. 2. 4将稀释好的NKX6. lsi-1和OligofectamineTM试剂混合，轻轻混匀室温放 置20min，以便形成复合物。
[0013] 1. 2. 5将215ul的复合物加入800ul无血清Opti-MEM细胞培养基的6孔板中，总 体积为l〇15ul，siRNA的终浓度为100pmol/ml，37°C，5% C02的培养箱内继续培养4-6h。
[0014] L 2· 6 4-6h后吸净6孔板内旧培养液，加入2ml含10% FBS的RPMI-1640或DMEM 新鲜培养基，37°C，5% C02的培养箱，继续培养，分别于24h、48h、72h提RNA或蛋白。
[0015] 1. 2. 7 NKX6. lsi-2和阴性对照组转染NC操作同上，终浓度为100pmol/ml ;空白对 照组Mock组加 lml无血清Opti-MEM细胞培养基（含6ul OligofectamineTM)，4_6h后换 成2mll0% FBS的RPMI-1640或DMEM新鲜培养基。
[0016] 1.3细胞感染
[0017] 1. 3. 1转染前一天在10cm皿中铺入293FT细胞，铺板的细胞密度在第二天转染 时达到90 %以上；转染前每个10cm板换上5ml的无抗生素的完全培养基，细胞密度控制在 85%以上，换液时候轻柔贴壁加入；
[0018] 1. 3. 2 配质粒混合物：pRSV-REV :2. lug ;pCMV-VSVG :3. lug ;pMDLg/pRRE :4. 2ug ; 目的基因质粒：约4ug ;将上述四质粒加入1. 5ml0PTI-MEM中，轻柔混匀置用；
[0019] 1. 3. 3在另外一个试管中加入Lipo200025-50ul加入1. 5ml0PTI-MEM中，轻柔混 匀，切忌剧烈吹打；
[0020] 1. 3. 4室温静置5分钟；
[0021] 1. 3. 5将质粒mix加入lip液中轻柔混匀，室温静置20分钟；
[0022] 1. 3. 6将混合的质粒mix和lip逐渐轻轻加入到培养板293FT中，置入37°C培养 箱培养；
[0023] 1. 3. 7转染后10-12小时换入新鲜培养基，48-72小时收取病毒液。
[0024] 1. 3. 8待细胞长到合适密度（细胞密度大约在30-40 %，加入病毒后72h长满为最 合适）加入适当体积（lO-lOOul)的病毒液和终浓度为8ug/ml的1，5_二甲基-1，5-二氮 i 亚甲基聚甲溴化物（Polybrene)作为病毒感染辅助介质。约12-16h后更换新鲜培养 基。
[0025] 1. 3. 9加入病毒液后约48h左右，收集细胞，提取蛋白，Western blot检测目的蛋 白的表达情况以确定细胞稳定株构建成功。
[0026] 2.细胞的RNA抽提：采用Trizol试剂一步法提取胃癌细胞及肝癌RNA。
[0027] 3. RT-PCR 检测 NKX6. 1 基因表达
[0028] 实验步骤
[0029] 3. 1逆转录反应
[0030] 3. 1. 1取薄壁离心管（RNase free)加入如下反应体系，70°C变性5min，立即4°C 冷却。
[0031]
[0032] 3. 1. 2按反应体系下面顺序依次加入各试剂，37°C反应5min
[0033]
[0034] 3· 1· 3在PUK1又上进仃班转求反奴，4TU揾胃㈨min，Y(TU lbmin終止反应，4°C冷 却。逆转录的cDNA于-20°C贮存备用。
[0035] 3.2PCR扩增反应
[0036] 3. 2. 1根据Genbank人类的NKX6. 1的cDNA序列，应用引物设计软件Primers设 计引物，并由Invitrogen公司合成。由于Oligo DNA呈很轻的膜状附在管壁上，在使用前 先瞬时离心，再轻轻打开管盖，用去离子水溶解为10pm〇l/ul后，贮存-20°C备用。各引物序 列如下：
[0037] 表2 :PCR各引物序列
[0038]
_an Li sense ο ~~ i/u iiri/HjiiAjRAji ~?_
[0039] 3. 2. 2取出已扩增的cDNA在冰上溶解，因为内参GAPDH和目的条带NKX6. 1的长 度相近，所以要分别进行PCR反应。
[0040] 3. 2. 3 PCR反应体系如下：
[0041]
[0042]
[0043] 3. 2. 4 PCR 扩增程序
[0044] 94°C 5min 热启动，94°C 30sec，57°C 35sec，72°C 45sec，扩增 35 个循环。72?延伸 7min，后-20°C存储。
[0045] 3. 2. 5 DNA 电泳
[0046] 取10ulPCR扩增产物加入含EB的1.5%琼脂糖凝胶中，以100V/Cm电压电泳约 30min，在紫外线照射下可见相应长度的人NKX6. 1扩增条带，用凝胶电泳成像分析系统扫 描分析电泳图像。
[0047] 4.细胞样品的蛋白提取
[0048] 将细胞培养基弃去后，用PBS液清洗三次后，每1-5X 105个细胞重悬于50ul裂解 液中，吹打均匀，冰浴下用细胞刮，刮后将细胞液移至EP管中，冰上静置30min，于4°C离心， 20000gX 30min，收集上清，经Bradford法测定蛋白含量，贮存-80°C备用。
[0049] 5.蛋白质含量测定（Bradford法）
[0050] 5. 1蛋白质标准曲线的制备
[0051] 分别取浓度为lug/ul的小牛血清蛋白（BSA)0,5ul，10ul，15ul，20ul和25ul置试 管中，分别加水l〇〇ul，95ul，90ul，85ul，80ul，75ul，再于每只试管分别加入Bradford工作 液lml，混匀后放置2min，以含BSA 0 ug/ul的溶液为空白对照，lh内测定各管在595nm处 吸收值，做标准曲线。
[0052] 5. 2样本蛋白质含量测定
[0053] 取lul蛋白样本溶液，加99ul ddH20和1ml Bradfordl工作液混匀，放置2min，以 含BSA 0 ug/ul的溶液为空白对照，测定595nm处吸收值。将吸收值带入步骤6.1所得到 的标准曲线，计算样本蛋白质含量。
[0054] 5.3蛋白样品的变性
[0055] 按1 : 1比例混合样品和5 X SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸5min，室温冷却5min。
[0056] 6.免疫印迹（Western blot)检测NKX6. 1的表达
[0057] 6. 1 SDS-PAGE 电泳
[0058] 6. 1. 1分离胶/浓缩胶的灌制
[0059] 按照表1配制丙烯酰胺分离胶溶液，将所配溶液灌入玻璃板后，覆盖水压平液面， 室温聚合，弃去覆盖液。
[0060] 表3 12%聚丙烯酰胺分离胶配方
[0061]
[0062] 按照表4配制丙烯酰胺浓缩胶液，将所配溶液立即加在聚合好的分离胶上，插入 梳子，室温聚合。
[0063] 表4 5%聚丙烯酰胺浓缩胶配方
[0064]
[0065]
[0066] 6· 1· 2 SDS-PAG 蛋白质电泳
[0067] 蛋白质样品上样：调整样品蛋白质浓度，使每个泳道上样的蛋白质为20ug。以蛋 白Marker作为分子量对照。电泳在Bio-Rad电泳槽中进行，样品在浓缩胶中运行电压为 60v，到达分离胶界面时，电压调升至80v，继续电泳直至溴酚兰到分离胶底部。
[0068] 6. 2电转移
[0069] 6. 2. 1切除弃去浓缩胶。在分离胶右下切角作标记，在转移缓冲液中平衡15min。 剪取与分离胶大小相同并做好标记的PVDF膜和两块3mm滤纸。PVDF膜先在甲醇中浸透约 15sec，然后转入ddH20中平衡5min，取出后浸入转移缓冲液5-10min。滤纸亦在转移缓冲 液中浸5-10min。自下而上依次叠放滤纸、膜、凝胶、另外一张滤纸，叠放时每一步都要注意 赶除气泡。
[0070] 6.2.2放置在Bio-