一种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋 白基因 VTP的dsRNA及其应用。
【背景技术】：
[0002] 狄斯瓦螨Varroa destructor(Anderson&Trueman，2000)是危害世界养蜂业的重 要外寄生虫，给世界养蜂业及农业带来巨大损失(Martin et al.，2004)。狄斯瓦螨可危害 蜜蜂封盖幼虫、蛹和成蜂，同时携带并传播蜜蜂病毒，与梅氏热厉螨（Tropilaelaps mercedesae)共感染(Luo et al.，2011)，从而造成蜂群生产力严重下降，乃至全群毁灭。狄 斯瓦螨以蜜蜂的血淋巴为食，成年雌螨在蜂蛹的表皮上打孔喂养它的子代，其唾液蛋白能 够抑制血细胞凝集，阻止蜜蜂的伤口愈合并减少相应的宿主反应（Richards et al.， 2011)〇
[0003] 本实验室从狄斯瓦螨唾液中分离纯化到一个对蜜蜂具有毒性的狄斯瓦螨唾液毒 性蛋白VTP，及其编码基因-狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所 不。
【发明内容】
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[0004] 本发明的第一个目的是提供一种对狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因具有非常好的沉 默效果的dsRNA。
[0005] 本发明的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的dsRNA，其特征在于，由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
[0006] 本发明的第二个目的是提供上述dsRNA在沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP中 的应用。
[0007] 一种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的制剂，其特征在于，含有上述dsRNA作 为有效成份。
[0008] 本发明的第三个目的是提供上述dsRNA在狄斯瓦螨感染蜜蜂情况下提高蜜蜂存活 率中的应用。
[0009] -种防控蜜蜂受狄斯瓦螨感染下提高蜜蜂存活率的制剂，其特征在于，含有上述 dsRNA作为有效成份。
[0010]本发明通过实验发现，本发明的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的dsRNA能够 沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP，与对照相比浸泡在沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的dsRNA中的狄斯瓦螨，其体内狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的mRNA含量显著降低，并 持续到蜜蜂预蛹羽化，沉默了狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP后的狄斯瓦螨毒性显著降低， 与对照相比，其侵染后意蜂的预蛹存活率明显提高，而中华蜜蜂预蛹的死亡率也显著降低。 因此可以将本发明的dsRNA沉默狄斯瓦螨的毒性蛋白基因，从而达到降低狄斯瓦螨对蜜蜂 的危害。
【附图说明】：
[0011] 图1是沉默效果测定图，其中Vd-CK代表狄斯瓦螨没有经过任何处理;Vd-0.9% NaCl代表狄斯瓦螨浸泡过质量分数0.9 %NaCl溶液;Vd-dsGFP代表狄斯瓦螨浸泡过dsRNA-GFP; Vd-dsVTP表示蜜蜂被浸泡过dsRNA-VTP溶液的狄斯瓦螨侵染。
[0012] 图2是沉默后狄斯瓦螨对蜜蜂的毒性检测图，图A是对意大利蜜蜂预蛹的测定，图B 是对中华蜜蜂预蛹的毒性测定，图中dsVTP表示狄斯瓦螨浸泡过dsRNA-VTP ;dsGFP表示狄斯 瓦螨浸泡过dsRNA-GFP; 0.9 % NaCl表示狄斯瓦螨浸泡过质量分数0.9 % NaCl溶液;Vd表示狄 斯瓦螨没有经过任何处理;No Vd:蜜蜂预蛹中没有加入瓦螨侵染的空白对照。
【具体实施方式】：
[0013] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0014] 实施例1:
[0015] 1.狄斯瓦螨和蜜蜂的收集:狄斯瓦螨成年雌螨收集于意蜂工蜂房内，取出后放在 内置9cm滤纸的无菌培养皿中，备用。蜜蜂预蛹则置于垫有无菌滤纸的48孔培养板，每孔放1 只预蛹，备用。
[0016] 2.狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的克隆
[0017] 取狄斯瓦螨约60头，米用TriZolReagent(Invitrogen公司，其货号为：15596026) 提取总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取lyg的总RNA 做起始逆转录反应，采用的逆转录试剂盒为SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit (Clontech，货号:634923)，逆转录反应的步骤参考该试剂盒的使用说明，获得逆转录产物。
[0018] 以逆转录产物为模板，设计VTP基因的特异性引物：
[0019] VTPF1(5'ATGTTCAAACTTCTCGTTATCG 3')
[0020] VTPR1(5'TTAGGAGGCGAGCGCCTGCTGGA 3')
[0021] 采用高保真Taq酶进行PCR，PCR反应体系为:逆转录产物lyL，lOxBuffer 5yL，dNTP (each 2 · 5mM)4yL，VTPF1 (ΙΟμΜ) lyL，VTPR1 (ΙΟμΜ) lyL，Taq酶（5U/yL) lyL，ddH2037yL。在冰 上加样后混匀。PCR反应条件为：94°C5min; 94°C30sec，44 · 5°C30sec，72°C45 sec，30个循 环；TStSmiruPCR扩增获得405bp的片段。采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，连接于 pEASY?-Tl Simple载体(北京全氏金生物技术有限公司，其货号为:CT111-01)上，具体步骤 参照该载体说明书。再将该连接载体测序，经分析表明，该序列含有一个开放阅读框，为405 个碱基，其序列如SEQ ID NO. 1所示，命名为狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP，由此获得插入 有狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的pEASY?-T 1 Simpl e载体，命名为pEASY-T-VTP。
[0022] 3.dsRNA 合成
[0023] (1)引物：T7-dsVTP~F: TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGTTCAAACTTCTCGTTATCG
[0024] T7-dsVTP~R:TAATACGACTCACTATAGGGAGATTAGGAGGCGAGCGCCTGCTGGA
[0025] 其中下划线标注的区域为T7启动子序列；
[0026] (2)阴性对照引物：
[0027] T7-GFP-F：TAATACGACTCACTATAGGGCGATCAAGAAGGACCATGTGGTC；
[0028] T7-GFP-R：TAATACGACTCACTATAGGGCGATTCCATGGCCAACACTTGTCC
[0029] 其中下划线标注的区域为T7启动子序列；
[0030] (3)模板准备:分别以pEASY-T-VTP(或者上述步骤2中的逆转录产物）和PEASY-T-GFP (GFP基因插入到pEASY?-T 1 Simp 1 e载体中而获得的）为模板，用上述引物分别扩增，获 得相应的PCR产物，割胶纯化后，浓度达0.5-1. Oyg/yL。
[0031] (4)DsRNA合成与纯化按试剂盒说明书(MEGAscript灯扒411330，六1111^〇11)，分别获 得沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的dsRNA(dsVTP)和沉默GFP基因的dsRNA(dsGFP)。其 中沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的dsRNA经测序，结果表明，其为由SEQ ID NO. 1所示 的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。。
[0032] 4.导入dsRNA
[0033] 参考文献Campbell et al. ,2010,以浸泡法将dsRNA(dsVTP或dsGFP)导入至成年 雌螨，具体步骤如下：
[0034] (1 )DsRNA用质量分数0 · 9 %NaCl配制成2 · 5yg/yL，500yL的离心管中装10yL，放成 年雌螨10只；
[0035] (2)16°C过夜（约15h)，取出后放在无菌滤纸上，待其恢复活力。复活的瓦螨用于后 续实验处理。
[0036] (3)处理:狄斯瓦螨成年雌螨浸泡于
[0037] A.dsVTP；
[0038] B.dsGFP；
[0039] C.0.9%NaCl；
[0040] D.不浸泡；
[0041 ] (4)每处理3个重复，每重复20头雌螨。
[0042] 5.沉默效果测定：
[0043] (1)基因沉默后的活螨中VTP的沉默效果测定：上述各处理的螨，取出后置于意蜂 工蜂预蛹身上，每只幼虫身上放2只螨，然后用封口膜封住，封口膜上扎10个孔，置于人工培 养箱(34°C，RH75%)培养直至预蛹化蛹至成虫。在此期间分别间隔0d、3d、7d及13d后，取8只 活螨提取总RNA，利用qRT-PCR检查基因沉默效果。实验重复两次。具体步骤如下：利用 Trizol提取瓦螨的总RNA，然后用DNasel处理消化基因组DNA，然后反转录获得cDNA，以此 cDNA为模板检测相应处理中的狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的m RNA相对含量。qPCR引 物：VdVTP-qF(AACGCATTCAAGACTACATCACCAA)and V dVTP-qR (CTTTGACAACGTTCTCCTTCTGCT)，内参基因为狄斯瓦螨的actin基因，其引物为:VdActinF: CATCACCATTGGTAACGAG和VdActinR: CGATCCAG ACGGAA TACTT。扩增条件：95°C，5min; 95°C， 15s，58°C，30s，72°C，30s，扩增 40 个循环。
[0044] 结果如图1所示，从图1可以看出，与对照相比浸泡在dsRNA-dsVTP中的狄斯瓦螨其 体内目的基因 mRNA含量显著降低，在0d时瓦螨体内狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的mRNA 相对含量仅为对照的〇. 9%，3d后为1.3%，而7d后为20.8%，并持续到蜜蜂预蛹羽化，即13d 后为32.4%。
[0045] (2)基因沉默后的活螨的毒性测定:上述各处理的活螨，取出后置于意蜂或者中蜂 工蜂预蛹身上，每只幼虫身上放2只螨，然后用封口膜封住，封口膜上扎10个孔，置于人工培 养箱(34°C，RH75%)培养直至预蛹化蛹至成虫。每处理3个重复，每重复6头预蛹。分别计算 意蜂的成活率和残翅率，中蜂的死亡率和成活率。
[0046]结果如图2所示，从图2可以看出，狄斯瓦螨体内狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP沉 默后感染意蜂的预蛹，其毒性降低，意蜂的存活率明显提高(72.2%)，但残翅率于对照相比 没有显著差异，而中华蜜蜂预蛹的死亡率也显著降低(41.1 % )。
【主权项】
1. 一种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA，其特征在于，由SEQIDN0.1所示 的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。2. 权利要求1所述的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA在沉默狄斯瓦螨唾液 毒性蛋白基因VTP中的应用。3. -种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的制剂，其特征在于，含有权利要求1所述 的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA作为有效成份。4. 权利要求1所述的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA在狄斯瓦螨感染蜜蜂 情况下提高蜜蜂存活率中的应用。5. -种防控蜜蜂受狄斯瓦螨感染下提高蜜蜂存活率的制剂，其特征在于，含有权利要 求1所述的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA作为有效成份。
【专利摘要】本发明公开了一种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA及其应用。所述的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA，其由SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。可以将本发明的dsRNA沉默狄斯瓦螨的毒性蛋白基因，从而达到降低狄斯瓦螨对蜜蜂的危害。
【IPC分类】C12N15/113, A01P7/02, A01N57/16
【公开号】CN105483131
【申请号】CN201610046163
【发明人】张祎, 韩日畴
【申请人】广东省昆虫研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月22日