亲和丙型病毒性肝炎核心抗原的核酸适体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种亲和丙型病毒性肝炎核心抗原的核酸适体及 其应用，具体涉及一种亲和丙型病毒性肝炎核心抗原的核酸适体及其在辅助鉴定丙肝患者 中的应用。
【背景技术】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV)引起的一种传染性疾病，可以通过血液 或血制品感染。目前全世界有近2亿人感染HCV，我国约有4000万至5000万人感染HCV， 仅次于乙型肝炎携带者数量。由于丙肝是RNA病毒引起的，目前世界范围内尚未开发出有 效的HCV疫苗。丙肝只有早发现、早治疗，才能减轻病毒对肝细胞的破坏。因此，探索、开发 新型的HCV早期检测方法具有非常重要的意义。
[0003] 判断是否感染丙肝的唯一办法是做丙肝血清检测。目前丙型病毒性肝炎的血清学 诊断方法包括检测抗HCV抗体和HCV RNA。抗HCV抗体一般出现在感染HCV12周后，并且有 相当一部分病人体内无抗HCV抗体，不利于对HCV的早期诊断。HCV RNA多出现于病毒感染 1周后，但临床检测易出现假阳性和假阴性结果。因此这些诊断方法或多或少的存在窗口 期检测效果不理想、检测技术操作复杂、仪器昂贵、大批量筛查能力不足等局限性，离早期 诊断与临床血液或血制品筛查的要求还有相当差距。已知HCV基因组编码约3100个氨基 酸残基组成的多聚蛋白，该蛋白在机体与病毒蛋白酶作用下可分解为核心抗原（core)、E1 结构蛋白、E2结构蛋白及p7非结构蛋白、NS2非结构蛋白、NS3非结构蛋白、NS4A非结构蛋 白、NS4B非结构蛋白、NS5A非结构蛋白、NS5B非结构蛋白。HCV core蛋白出现于HCV感染 1周后，可作为HCV早期诊断及临床筛查指标，有望实现窗口期检测。
[0004] 在国际上美国0RTH0公司于2000年推出了第四代HCV-ELISA试剂盒就是基于 HCVcore蛋白的检测。在国内，2005年湖南康润生物工程有限公司也生产了类似的检测HCV 病毒试剂盒。尽管这些试剂盒能够检测HCV抗原，但是因为这些试剂盒均采用双抗体夹心 酶联法（ELISA)进行检测，所以需要进行大量单克隆抗体的制备。然而单克隆抗体的制备 过程复杂，价格昂贵，保存条件苛刻。这使得检测HCV病毒的成本较高，检测灵敏度也受到 严重的影响。
[0005] 核酸适体（Aptamer,又称适配体，适配子）是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革El标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)从人工合成的 DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适 体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别 功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多 优良的特性，如分子量小、能批量生产、不易失活、无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿 透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生 物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种亲和丙型病毒性肝炎核心抗原的核酸适体及其应用。
[0007] 本发明提供的核酸适体，具体是如下（a)或（b):
[0008] (a)序列表的序列2所示的单链DNA ;
[0009] (b)含有（a)所述核酸适体的单链DNA。
[0010] 所述（b)中的核酸适体具体可为序列表的序列1所示的单链DNA。
[0011] 所述核酸适体与丙型肝炎病毒核心抗原具有较好的亲和能力。
[0012] 将所述核酸适体进行修饰或改造，得到的所述核酸适体的衍生物也属于本发明的 保护范围。
[0013] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：
[0014] a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具 有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0015] b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同 功能的核酸适体的衍生物。
[0016] c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有 相同功能的核酸适体的衍生物。
[0017] d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的 衍生物。
[0018] e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体 具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0019] 固定有所述核酸适体的酶标板（如96孔板）也属于本发明的保护范围。
[0020] 可采用酶联放大法检测待测样本中的丙型肝炎病毒核心抗原，从而实现临床中丙 型肝炎病毒的检测。
[0021] 所述核酸适体可用于制备检测或辅助检测丙型肝炎病毒核心抗原的试剂盒；所述 丙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列具体如序列表的序列3所示。
[0022] 所述核酸适体还可用于制备鉴定或辅助鉴定丙肝患者的试剂盒。
[0023] 本发明还保护一种检测或辅助检测丙型肝炎病毒核心抗原的试剂盒。
[0024] 所述检测或辅助检测丙型肝炎病毒核心抗原的试剂盒，具体可包括所述核酸适 体；所述丙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列具体如序列表的序列3所示。
[0025] 所述试剂盒还可包括包被有抗所述丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体的酶标 板（如96孔板）。所述包被有抗所述丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体的酶标板具体可 为湖南康润制药有限公司生产的具有肝炎病毒核心抗原单克隆抗体的96孔板。通过包被 有丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体的酶标板和核酸适体可以检测待测样本中的丙型肝 炎病毒核心抗原。使用所述试剂盒时，采用的待测样本具体可为血清。
[0026] 本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定丙肝患者的试剂盒。
[0027] 所述鉴定或辅助鉴定丙肝患者的试剂盒，具体可包括所述核酸适体。
[0028] 所述试剂盒还可包括包被有抗所述丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体的酶标 板（如96孔板）。所述包被有抗所述丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体的酶标板具体可 为湖南康润制药有限公司生产的具有肝炎病毒核心抗原单克隆抗体的96孔板。使用所述 试剂盒时，采用的待测样本具体可为血清。
[0029] 在鉴定或辅助鉴定丙肝患者的试剂盒中，还可含有记载有如下内容的说明书：
[0030] (1)进行如下实验组和对照组：
[0031] 实验组：将待测者的离体血清加入到所述固定有所述核酸适体的酶标板中，37°C 孵育1-2小时，洗涤后加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体，37°C孵育0. 5-1 小时，洗涤后加入显色液A+B,显色10分钟；显色后检测450nm下的光吸收值，记为0D450实 验组s
[0032] 对照组：以临床确诊未患丙肝的健康人的离体血清替代所述实验组中的所述待测 者的离体血清，其余与所述实验组相同，测得的450nm下的光吸收值，记为(?450对照组± 〇， 〇为对照组多组平均值的标准偏差；定义〇D450l|S肖值=±3 〇。
[0033] (2)根据步骤（1)的测定结果，按照如下确定所述待测者是否为丙肝患者：若所述 0D450_|纟与00450^^^；的比值大于1,则所述待测者为丙肝患者或候选为丙肝患者；反之， 则所述待测者不为丙肝患者或候选不为丙肝患者。
[0034] 丙肝目前尚没有疫苗预防，因此早期检测就显得相当重要。发展在"窗口期"内查 出丙型肝炎病毒是目前国际研究和临床的热点问题。利用本发明的核酸适体，可以在丙型 肝炎病毒感染1周后，通过检测丙型肝炎病毒核心抗原而不是抗体实现对丙型肝炎病毒的 检测。本发明的核酸适体将有利发展丙肝检测的新方法。
[0035] 本发明还保护固定有所述核酸适体的酶标板在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒 可以检测或辅助检测丙型肝炎病毒核心抗原和/或鉴定或辅助鉴定丙肝患者；所述丙型肝 炎病毒核心抗原的核苷酸序列具体如序列表的序列3所示。
[0036] 所述核酸适体与丙肝核心抗原具有较好的亲和能力，可以通过固定有核酸适体的 96孔板，采用酶联放大方法检测溶液中的丙肝核心抗原，从而实现临床中丙肝病毒的检测。 所述核酸适体与丙肝核心抗原具有较好的亲和能力，可以通过固定有单克隆