桃est-ssr分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子标记领域，具体涉及桃品种6个EST-SSR分子标记技术及其应用。
【背景技术】
[0002] 桃[Prunus persica(L. )Batsch]是世界重要水果之一，起源于中国，世界各地均 有种植，是我国主要水果之一，中国桃产量居世界第一。
[0003] 桃分布广，品种多，但亲缘关系近的桃品种之间的鉴定却比较困难，特别是同一个 亲本组合的不同后代品种之间很难鉴别。
[0004] 近年来，应用简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR)对品种进行鉴别在多 种植物上有着广泛应用，该标记具有重复性好、数量多、成本低、检测便利等特点。有一部分 SSR存在于表达序列标签(Express sequence tag，EST)中，与基因组SSR相比，EST-SSR具有 开发耗时短，花费低，效率高等优点。
[0005] 目前，EST-SSR标记已相继应用于葡萄，梨，草莓，苹果，甘蔗等物种，虽然近年来关 于桃EST-SSR标记也有报道，如桃EST-SSR标记开发及其在蔷薇科其他果树中通用性的研究 (谭彬等，2013);隋毅等(2006)用8个EST-SSR标记对扁桃和其它李属物种SSR的进化模式和 突变机制进行研究；但对于近缘品种或同一杂交组合不同后代材料的鉴别而言EST-SSR数 量仍嫌不足。因此，开发更多的EST-SSR标记以应用于桃品种或育种材料鉴别以及种质资源 遗传多样性研究具有必要性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供桃EST-SSR分子标记，涉及6个新的 桃EST-SSR标记。所述桃EST-SSR标记分别是六组引物对，其序列如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 12所示。
[0007] 本发明提供的6个桃分子标记，其特征如表1所示。
[0008] 表 1 桃EST-SSR标记特征（SEQ ID N0:1-12)
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[0010]
[0011]本发明的6个桃EST-SSR标记通过以下方法获得：
[0012] (1)利用GenBank公布的桃EST序列和MI SA软件找到2146个重复基元，选取其中三 至六碱基重复且重复次数大于5的和复合碱基重复共37个SSR序列设计了引物，引物设计的 原则为:？〇?产物长度100-35(^?;6(：含量40%-70%，最适为50%;退火温度50-65°(3 ;引物长 度18-25bp;避免出现引物二聚体。在设计好的正向引物的5 '端统一加18个bp的尾巴(Ml3-丁6丁六44406六066〇^1')，另合成加了？41和!^两种不同荧光基团标识的組3尾巴引物，引物 委托上海生工生物工程有限公司合成；
[0013] (2)用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 法提取桃品种基因组DNA;
[0014] (3)采用SSR分子标记方法进行桃分子标记的筛选：以'白丽'品种的基因组DNA为 模板进行PCR扩增:在20μ1反应体系中分别加入lOXEx Taq Buffer(含Mg2+)，1.6yl的2.5mM dNTPJunits/yl Ex Taq DNA polymerase Ο.?μL，正向引物4pmol，反向引物5pmol，M13通 用焚光引物lpmol，lOng/μΙ DNA模板ΙμL，ddH2〇补充体系至20μ1。使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增，具体步骤为:94°C预变性5min，，然后94°C(30s)/60°C(30s)/72 °C(30s)循环 20 次，之后 94°C(30s)/55°C(30s)/72°C(30s)循环 12 次，最后 72°C 延伸 15min。 产物检测：在含有〇.5%ygAU EB的3%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结 果；
[0015] (4)将初步筛选的有扩增产物的引物在另外10个桃品种上进行扩增，于ABI遗传分 析仪上进行分析，并使用PowerMarker V3 · 25，Tree32和GenALE X 6 · 501读取数据并分析结 果。
[0016] 本发明的另一个目的是还提供所述的桃EST-SSR标记在桃种质资源遗传多样性分 析以及品种鉴别中的应用。
[0017] 为开发更多的EST-SSR标记，本发明利用已发布的GenBank的EST序列和MISA软件 开发新的标记，找到了 500多个SSR位点，合成了 37对引物，经11个近缘关系的桃品种筛选， 得到14个未被报道的具有多态性的标记，本发明使用其中多态性最高的6个标记。本发明的 有益效果是：（1)本发明的6个分子标记在11个桃品种中有多态性，在11个桃品种中进行遗 传多样性分析与桃植物分类常识相吻合（图1)，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所 提供的6个引物对应用于更多桃材料上，进行种质资源和遗传多样性分析。（2)本发明的6个 分子标记均来自桃EST序列，可应用于桃的品种鉴定、亲本鉴别、遗传多样性分析以及分子 辅助选育等工作。
【附图说明】
[0018] 图1为基于6个EST-SSR标记构建的11个桃品种遗传相似系数的UPGMA聚类图。
【具体实施方式】
[0019] 本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。
[0020] 实施例1:改良CTAB法提取基因组DNA
[0021 ] (1)配制CTAB缓冲液（十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)的配方为：2%CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH值8.0.TE缓冲液（10mM Tris,lmM EDTA,pH8.0)〇
[0022] (2)采桃幼嫩叶片，桃品种信息如图1所示。
[0023] (3)将桃叶片放入液氮中充分研磨至粉末状，称取0.7g左右转入盛有4ml CTAB溶 液与80μ1β-巯基乙醇(65°C预热）的10ml离心管中，65°C水浴lh;加入4ml氯仿/异戊醇（24: 1，v/v)，混匀，12000rpm离心10min，取上清液并再次加入4ml氯仿/异戊醇（24:1，v/v)，混 匀，12000rpm离心10min。吸取上清液，加入2ml 5M NaCl，4ml异丙醇（-20°C预冷），混匀，放 入-20°C2h<a2000rpm离心15min，弃上清，沉淀用75%乙醇漂洗2次，晾干。加入100μ1含10μ g/ml RNase Α的ΤΕ缓冲液溶解沉淀，37°C水浴lh以降解RNA。用分光光度计法检测DNA浓度， 用电泳法检测质量，保存于_20°C。
[0024] 实施例2:设计EST-SSR引物
[0025] 本发明利用GenBank公布的桃EST序列开发EST-SSR引物。引物设计软件为 NCBIPrimer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/index.cgi? LINK_L0C = Blast HomeAd)。引物设计的具体条件为:PCR产物长度100-350bp;GC含量40%-70%，最适为50%;退火温度50-65°(3;引物长度18-25匕？;避免出现引物二聚体。引物合成中 在正向引物的5'端加上18bp的M13-tail(序列为TGTAAAACGACGGCCAGT)。共开发了37对EST-SSR引物，序列如表2所示。
[0026] 表2桃EST-SSR标记特征
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[0029]实施例3:有多态性引物筛选
[0030]用实施例1中抽提的桃叶片DNA为模板，用实施例2中设计的37对引物进行扩增。
[0031] 1、PCR反应体系：10XEx Taq Buffer(含Mg2+)，1.6yl的2.5mM dNTP，5units/yl Ex Taq DNA polymerase Ο.?μL，正向引物4pmol，反向引物5pmol，M13通用焚光引物lpmol， lOng/μΙ DNA模板 1μ1，(ΜΗ20补充体系至20μ1。
[0032] 2、利用Eppendorf Mastercycler(Eppendorf Scientific，Inc · )PCR仪扩增。反应 程序为：94°C预变性5min，，然后94°<3(308)/60°(3(308)/72°(3(308)循环20次，之后94°〇 (3〇8)/55°(3(3〇8)/72°(3(3〇8)循环12次，最后72°(3延伸1511^11。
[0033] 3、电泳检测：取5ylPCR产物加入ΙμL 6Xloading 13虹€6广在浓度为1%的琼脂糖 凝胶上检测，并拍照记录。
[0034] 4、STR片段长度分析：将上述电泳检测中条带长度在合理范围内的PCR产物进行 STR片段长度分析，得到不同桃品种的SSR位点的具体长度，收集6个引物多态性信息。并用 POWERMARKER软件和MEGA软件构建UPGMA聚类图。
【主权项】
1. 一种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO: 1 和SEQIDNO:2所示。2. -种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO: 3 和SEQIDNO:4所示。3. -种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:5 和SEQIDNO:6所示。4. 种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:7和 SEQIDNO:8所示。5. -种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:9 和SEQIDNO: 10所示。6. -种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO: 11和SEQIDNO: 12所示。7.权利要求1-6任一所述的桃EST-SSR标记在桃种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、 亲本鉴别和分子辅助育种中的应用。
【专利摘要】本发明提供桃EST-SSR分子标记，其序列如SEQ？ID？NO:1至SEQ？ID？NO:12所示。本发明以18个亲缘关系较近的桃品种基因组DNA模板为研究对象，根据NCBI中公开的桃EST序列，采用MISA引物设计软件，查找并设计新的EST-SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、克隆验证、STR基因分型筛选出6个具有多态性的EST-SSR分子标记，本发明提供的桃EST-SSR分子标记能有效地对11个桃品种进行区分，可用于桃的品种鉴定、亲本鉴别、遗传多样性分析以及分子辅助选育等领域。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105483126
【申请号】CN201610005684
【发明人】徐昌杰, 丁毛毛, 王可, 吴大军, 陈妙金, 王文婷, 陈昆松
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月4日