与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法
【专利摘要】本发明涉及一种与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法，本发明首次公开了如何在常规育种全程中进行分子标记辅助选择技术的具体实施方法，该方法在利用分子育种元件创制分子标记辅助育种选择群体的前提下，育种全过程均通过分子标记对基因型进行选择，克服了常规育种靠表型选择基因型的缺点。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法，属 于分子标记应用【技术领域】。 与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方 法 【背景技术】
[0002] 作物新品种选育是随着人类文明史发展而一直进行的科学创新。从距今约1万年 前开始的随机采集活动到传统农业的大规模生产，世世代代的祖先为我们留下了丰富多彩 的各类农家品种，这些农家品种是各国种质库中的占有很高比例的育种材料，也是我们进 行新品种创造的珍贵资源。
[0003] 1886年前后孟德尔开始的豌豆杂交是现代育种的标志性事件，自此至今的130多 年里，育种家通过作物种质或近缘种间有性杂交，培育了数目众多的作物新品种，为满足快 速增长的人口提供了粮食安全，对经济迅速发展、社会进步做出了巨大贡献。但常规育种主 要采用表型选择方法，在很大程度上依赖于经验和机遇，由此导致的选择盲目性和不可预 见性是作物育种效率低，单产徘徊不前的主要原因。
[0004] 据统计，大多数常规育种单位选育出品种的组合与杂交组合的比率只有千分之 一，形成品种的株系与各代选择株系的比例只有百万分之一，大大浪费了人力物力。近十几 年迅速发展起来的生物技术和生物信息技术促进了分子标记的快速发展和应用。而分子标 记育种，利用目标基因可追踪的特点可直接对基因型进行选择，在组合配置、F1选留及其后 代种植规模上，都会根据目标基因/QTL的有无或聚合情况预先设计和具体实施。因此，分 子标记辅助育种，可大大提高育种效率，加快育种进程，一般可节省50 %左右的人力物力， 缩短1-2年的育种年限。但是，由于小麦基因组特别巨大（1.8X101(lbp)，重复序列多及大 多数重要性状为多基因控制的数量性状，仅用某性状的1-2分子标记在杂交选育中随机辅 助选择的效果并不理想，因此，小麦的分子标记辅助选择方案在技术上还需完善提高，其高 效化和规模化的问题急待解决，分子标记辅助育种必须与常规育种全过程有机结合，才能 真正实现和发挥分子标记辅助育种的作用，培育出突破性小麦新品种。
[0005] 但目前还没有一种与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记 辅助选择方法。
[0007] 本发明技术方案如下：
[0008] 与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法，步骤如下：
[〇〇〇9] (1)在血缘、地理和性状差异的基础上，根据育种目标性状确定遗传背景清晰的亲 本材料作为育种元件，然后按照两亲本目标基因/QTL有无和互补选择父本和母本，并配制 杂交组合F1 ;再根据育种目标和有效基因/QTL在杂交后代中的贡献率预测确定1-2个目 标性状的2个以上QTL的分子标记，作为后代跟踪标记；
[〇〇1〇] (2)根据杂交组合F1生长后期性状，淘汰性状差的组合，保留性状好的杂交组合 F1收获籽粒后，经培育发芽后，提取DNA进行目标基因/QTL的检测，根据目标基因/QTL有 无或聚合情况，确定性状好的杂交组合F1的淘汰或选留及种植规模；将含有目标基因 /QTL 且表型有显著杂种优势的组合列为重点选育组合F2,进行大规模培育，将含有目标基因/ QTL但表型杂种优势不突出，或不含有目标基因/QTL但表型杂种优势突出的组合列为一般 组合F2,进行小规模培育，淘汰没有目标性状基因/QTL且表型无明显杂种优势的组合；
[0011] (3)于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F2的生长健壮植株，提取DNA进行目标 性状基因/QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性 状进行田间选优淘劣；对一般组合F2则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性 状基因/QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因 型和表现型的综合结果，按步骤（2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F3和一般组合 F3,并确定下代种植群体的大小；
[0012] 于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F3的生长健壮植株，提取DNA进行目标性状 基因/QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性状进 行田间选优淘劣；对一般组合F3则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性状基 因/QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因型和 表现型的综合结果，按步骤（2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F4和一般组合F4,并 确定下代种植群体的大小；
[0013] 于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F4的生长健壮植株，提取DNA进行目标性状 基因/QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性状进 行田间选优淘劣；对一般组合F4则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性状基 因/QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因型和 表现型的综合结果，按步骤（2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F5和一般组合F5,并 确定下代种植群体的大小；
[0014] (4)种植重点选育组合F5和一般组合F5，F5代田间整齐度达标的株系，用分子标 记跟踪目标基因/QTL的同时，选择株型优良、产量高、抗逆强的品系，即得。
[0015] 步骤（1)中血缘、地理和性状差异的标准为本领域育种常规标准，如：血缘差异即 作为两个亲本材料的系谱中没有共同亲本或来源相同的姊妹系等；地理差异即两个亲本来 源于不同国别、不同生态区域、不同省份等；性状差异即两个亲本在育种目标如抗病性上的 差异即一个抗病、另一个不抗病或产量性状的差异即一个高产、一个低产等。具体可参见： 沙征贵，余建华.几个小麦品种主要性状表现和系谱分析.《福建农业科技》，1982年05期。
[0016] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，按照两亲本目标基因/QTL有无和互补选择 父本和母本为：根据育种目标，确定含有目标基因/QTL且目标性状表现极端的个体作为育 种元件，即亲本；其中，两亲本目标基因/QTL有无是指通过检测，一个亲本中含有该育种目 标的目标基因/QTL，而另一个亲本中不含有该育种目标的目标基因 /QTL ;而两亲本目标基 因/QTL的互补是指当育种目标涉及到2个及以上性状时，通过检测，一个亲本中含有一个 及以上目标性状的目标基因/QTL，而另一个亲本中含有剩余目标性状的目标基因 /QTL ;表 明这两个亲本的目标基因/QTL是互补的。
[0017] 根据本发明进一步优选的，上述确定含有目标基因/QTL的步骤为利用QTL IciMapping version3. 2 软件(http: //www. isbreeding. net)进行石角定。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，育种目标和有效基因/QTL在杂交后代中的 贡献率预测彡10%。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，培育数量为杂交组合F1每一株系50?100 粒籽粒。
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤（2)或（3)中，大规模培育为种植1000?2000株； 小规模培育为种植100?200株。
[0021] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，所述含有目标基因/QTL是指通过检测含有 QTL分子标记的数目至少为2个。
[0022] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，目标基因/QTL聚合是指控制同一个性状的 不同位点的聚合或控制不同目标性状的基因/QTL位点的聚合。
[0023] 所述步骤⑵中根据杂交组合F1生长后期性状，筛选性状优劣的标准采用本领域 常规的评价标准，如可采用《作物育种学总论》（王世杰著，中国农业科学技术出版社，出版 号：9787511600103,出版日期2009年8月）中记载的内容。
[0024] 所述目标基因/QTL的检测可采用本领域常规技术，即利用目标基因/QTL的分子 标记进行分子检测。
[0025] 所述步骤（4)中田间整齐度达标的标准采用本领域常规技术，如采用《作物育种 学总论》（王世杰著，中国农业科学技术出版社，出版号：9787511600103,出版日期2009年 8月）中记载的内容。
[0026] 所述步骤（4)中株型优良、产量高、抗逆强的标准采用本领域常规技术，如采用 《作物育种学总论》（王世杰著，中国农业科学技术出版社，出版号=9787511600103,出版日 期2009年8月）中记载的内容。
[0027] 有益效果
[0028] 1、本发明首次公开了如何在常规育种全程中进行分子标记辅助选择技术的具体 实施方法，该方法在利用分子育种元件创制分子标记辅助育种选择群体的前提下，育种全 过程均通过分子标记对基因型进行选择，克服了常规育种靠表型选择基因型的缺点。
[0029] 2、本发明首次采用育种元件创制分子标记选择群体，育种元件明确了目标基因/ QTL在亲本中的要求，并对所要筛选的育种全过程实施分子标记辅助选择和多基因位点标 记，按本所述方法可解决在常规育种中如何使用分子标记和如何取得有效结果的问题，可 实现分子标记辅助技术和常规育种的真正结合，提高了选择准确率和选出多基因/QTL聚 合的目标品种。
[0030] 3.本发明技术方案能够缩短育种周期，降低育种成本和提高育种效率，一个中等 规模的小麦育种团队，每年配制杂交组合的数目可减少50%，保留F1组合的比例可减少 30 %，F2种植面积减少50 %，F3-F4代的应选株系可减少60 %，从组合配制到参试国家试验 的年限缩短2年，育成品种的效率可提高50%。 【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1 :TaGW2-6A基因的分子标记Hap-6A-Pl/P2在山农20和山农01-35中的扩增 结果；
[0032] 图2 :标记Hap-6A_P1/P2在F2分离世代部分株系的扩增结果；
[0033] 图中：M、marker，1_16、F2 株系；
[0034] 图3 :标记QGW6A-232在01-35及部分F2分离世代部分株系的扩增产物PAGE电 泳结果；
[0035] 图中：M、marker ;1、01-35, 2-20、F2 株系；
[0036] 图4 :6个抗白粉病和6个抗条锈病基因分子标记的扩增结果；
[0037] 图中：各泳道自左向右依次为DL2000分子量标记、山农20、PH82-2-2和954072 ;
[0038] A-F、抗白粉病基因 Pml2 (A)、Pml6 (B)、Pm24 (C)、Pm30 (D)、Pm35 (E)和 Pm36 (F)的 分子标记带型；G-L、抗条锈病基因 Yr5 (G)、Yr9 (H)、Yrl5 (I)、Yr24 (J)、Yr26 (K)和 YrTpl (L) 的分子标记带型。 【具体实施方式】
[0039] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0040] 实验材料
[0041] 山农01-35、小麦山农20、PH82-2-2、954072山东农业大学农学院农业部谷物品质 检测中心品质育种研究室有售；
[0042] PCR仪型号为德国Eppendorf5531梯度PCR仪；
[0043] 实施例1
[0044] 利用2个大粒基因标记TaGW2-6A和QGW6A-232进行粒重的多位点分子标记辅助 选择，包括以下步骤：
[0045] 分子育种元件的选择和F1组合配制
[0046] 分子育种元件的选择：2008年2-4月利用粒重基因 TaGW2_6A的分子标记 (Hap-6A-Pl/P2)和QGW6A-232分别对250份"973"项目组创制的材料进行鉴定，其中分子 标记标记Hap-6A-Pl的上游引物,核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，分子标记Hap-6A-Pl的 下游引物，核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示；分子标记他?-6442的上游引物，核苷酸序列 如SEQ ID N0. 3所示，分子标记Hap-6A-P2的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示； 分子标记QGW6A-232的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，分子标记QGW6A-232的 下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 6所示。通过琼脂糖电泳分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析筛选出同时含有2个小麦粒重的优异等位基因（Hap-6A-G和QGW6A-232)的育种元件 山农01-35作为高粒重分子育种元件（见图1和图3);山农01-35常年千粒重在60克左 右；2008年10月将育种元件山农01-35及其它亲本材料种植于山东农业大学泰安实验农 场。
[0047] 杂交组合F1配制和分子标记辅助选择群体构建：2008年5月以大粒育种元件山 农01-35为父本，以多穗、多粒的山农20、山农22、良星66和良星99等4个小麦品种作母 本（不含Hap-6A-G和QGW6A-232两个高粒重基因扩增片断）进行常规杂交，获得4个杂交 组合F1，这些组合及其后代即为分子标记辅助选择群体。
[0048] 确定杂交组合F1的选留和杂交组合F2种植规模
[0049] 2008年10月将4个杂交组合F1种植于大田，每个杂交组合种植2行，每行100 粒。2010年夏收根据大田农艺性状和产量杂种优势表现结果，淘汰农艺性状优势较差的组 合2个即组合01-35 X山农22和组合01-35 X良星66,保留其余2个组合；从收获各杂交 组合F2籽粒中各取50粒于7-9月份室内发芽，提取小麦的基因组DNA，用于TaGW2-6A的 分子标记（Hap-6A-Pl/P2)和QGW6A-232聚合情况的分子检测。
[0050] 分子检测步骤如下：
[0051] a、每株系取1-2片小麦叶片，置于2mL离心管中，放入盛有液氮的容器内，冷冻后 充分研磨，加入900 μ L 65°C预热的DNA提取工作液，65°C水浴lh，水浴过程中小心轻摇数 次，充分混匀；室温冷却5min后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为25:24:1)充 分混勻30min，10000g离心20min ;取上清夜加入等体积的异丙醇，轻轻混勻，可见絮状DNA 析出，10000g离心30min ;弃去上清液，用70 %的乙醇洗涤沉淀2次，将DNA沉淀晾干，用 100 μ L 1 X TE溶液溶解，制得待测小麦的DNA ;
[0052] b、TaGW2_6A的分子标记以待测小麦的DNA为模板，分别用分子标记Hap_6A_Pl和 Hap-6A-P2的检测引物进行PCR扩增，分子标记Hap-6A-Pl的上游引物，核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，分子标记Hap-6A-Pl的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示；分子标记 Hap-6A-P2的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，分子标记Hap-6A-P2的下游引物， 核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示；
[0053] 引物Hap-6A_P1/P2的反应体系和循环程序如下：
[0054] 首先用引物Hap-6A_P 1扩增，PCR体系为20 μ L :
[0055] lOXbuffer(含 Mg2+)2yL、dNTP 1.6yL(10mmol Γ1)、每条引物 0.4yL、模板 DNA 50ng、lU Taq 聚合酶、13.4yL ddH20。
[0056] PCR 扩增程序为 95°C预变性 5min ;95°C变性 50s，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin， 35个循环；72°C延伸10min。
[0057] 第一轮PCR扩增完成后，用引物Hap-6A_P2进行第二轮扩增，PCR体系为20 μ L :
[0058] 10父1311打61'(含]\%2+)2 4 1^(1阶131.6 4 1^(10臟〇1171)、每条引物0.4 4 1^川丁&9聚 合酶、13. 4μ L ddH20。
[0059] 第一轮的PCR产物稀释100倍作为第二轮PCR反应的模板，反应程序：
[0060] 95°C预变性 5min ;95°C变性 50s，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，35 个循环；72°C 延伸10min。
[0061] 扩增完毕后用限制性内切酶TaqI (按产品说明操作）酶切第二轮PCR扩增产物， 反应体系为20 μ L:
[0062] 含 TaqI 酶 1 μ L，lOXTaql buffer2y L，0. 1 % BSA 2 μ L, PCR 产物 10 μ L， ddH205 μ L。
[0063] 反应温度为65°C，酶切5min后加入loading buffer，PCR产物和酶切片段分别用 1. 5wt%和2wt%的琼脂糖电泳分离。
[0064] 根据获得的结果，如果得到大小为218bp的PCR扩增产物条带，则所述待测小麦为 高粒重小麦。
[0065] c、QGW6A-232以待测小麦的DNA为模板，用分子标记QGW6A-232的检测引物进 行PCR扩增，分子标记QGW6A-232的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示，分子标记 QGW6A-232的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0066] 该分子标记检测引物的反应体系和PCR扩增条件如下：
[0067] PCR扩增体系为20 μ L，如表1所示：
[0068] 表 1
[0069]
【权利要求】
1. 与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法，其特征在于，步骤如 下： (1) 在血缘、地理和性状差异的基础上，根据育种目标性状确定遗传背景清晰的亲本材 料作为育种元件，然后按照两亲本目标基因/QTL有无和互补选择父本和母本，并配制杂交 组合F1 ;再根据育种目标和有效基因/ QTL在杂交后代中的贡献率预测确定1-2个目标性 状的2个以上QTL的分子标记，作为后代跟踪标记； (2) 根据杂交组合F1生长后期性状，淘汰性状差的组合，保留性状好的杂交组合F1收 获籽粒后，经培育发芽后，提取DNA进行目标基因/QTL的检测，根据目标基因/QTL有无或 聚合情况，确定性状好的杂交组合F1的淘汰或选留及种植规模；将含有目标基因/QTL且表 型有显著杂种优势的组合列为重点选育组合F2,进行大规模培育，将含有目标基因/QTL但 表型杂种优势不突出，或不含有目标基因/QTL但表型杂种优势突出的组合列为一般组合 F2,进行小规模培育，淘汰没有目标性状基因/QTL且表型无明显杂种优势的组合； (3) 于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F2的生长健壮植株，提取DNA进行目标性状 基因/QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性状进 行田间选优淘劣；对一般组合F2则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性状基 因/QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因型和 表现型的综合结果，按步骤（2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F3和一般组合F3,并 确定下代种植群体的大小； 于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F3的生长健壮植株，提取DNA进行目标性状基因 /QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性状进行田 间选优淘劣；对一般组合F3则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性状基因/ QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因型和表现 型的综合结果，按步骤（2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F4和一般组合F4,并确定 下代种植群体的大小； 于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F4的生长健壮植株，提取DNA进行目标性状基因 /QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性状进行田 间选优淘劣；对一般组合F4则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性状基因/ QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因型和表现 型的综合结果，按步骤（2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F5和一般组合F5,并确定 下代种植群体的大小； (4) 种植重点选育组合F5和一般组合F5，F5代田间整齐度达标的株系，用分子标记跟 踪目标基因/QTL的同时，选择株型优良、产量高、抗逆强的品系，即得。
2. 如权利要求1所述的多位点分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤（1)中， 按照两亲本目标基因/QTL有无和互补选择父本和母本为：根据育种目标，确定含有目标基 因/QTL且目标性状表现极端的个体作为育种元件，即亲本；其中，两亲本目标基因/QTL有 无是指通过检测，一个亲本中含有该育种目标的目标基因/QTL，而另一个亲本中不含有该 育种目标的目标基因 /QTL ;而两亲本目标基因/QTL的互补是指当育种目标涉及到2个及 以上性状时，通过检测，一个亲本中含有一个及以上目标性状的目标基因/QTL，而另一个亲 本中含有剩余目标性状的目标基因/QTL。
3. 如权利要求2所述的多位点分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述确定含有目 标基因/QTL的步骤为利用QTL IciMapping version 3. 2软件进行确定。
4. 如权利要求1所述的多位点分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤（1)中， 育种目标和有效基因/ QTL在杂交后代中的贡献率预测> 10%。
5. 如权利要求1所述的多位点分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤（2)中， 培育数量为杂交组合F1每一株系50?100粒籽粒。
6. 如权利要求1所述的多位点分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤（2)或 (3)中，大规模培育为种植1000?2000株；小规模培育为种植100?200株。
7. 如权利要求1所述的多位点分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤（2)中， 所述含有目标基因/QTL是指通过检测含有QTL分子标记的数目至少为2个。
8. 如权利要求1所述的多位点分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤（2)中， 目标基因/QTL聚合是指控制同一个性状的不同位点的聚合或控制不同目标性状的基因/ QTL位点的聚合。
【文档编号】C12Q1/68GK104109713SQ201410289103
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】田纪春, 邓志英 申请人:山东农业大学