一种固定线虫单条虫dna粗提液及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学检测鉴定技术领域，具体涉及一种固定线虫单条虫DNA粗 提液及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 核酸的分离与纯化是分子生物学研究中重要的技术，现有的DNA提取与纯化方法 一般只适用于新鲜材料，虽然对于一些较为特殊材料的DNA提取已提出一些专一方法，但是 对于福尔马林长期保存生物标本基因组DNA的提取至今未能彻底解决。作为生物标本的保 存液，福尔马林的优点在于渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快，具有能快速杀死生物 细胞以固定生物大分子的功能。因此在过去的若干年中，世界各国生物学家采集了大量生 物标本并保存于福尔马林中，这些标本在研究物种起源、系统进化、特定物种基因资源保护 以及生物多样性等方面具有很高的学术研究价值。如不能正常提取基因组总DNA，就会给从 分子水平上比较研究这类生物带来障碍(徐来祥等，2002)。对于线虫研究来说，由于采集的 样品多混合不同营养类型的线虫（如自由生活和植物寄生线虫），而且包含的种类也非常 多，所以，要先将样品固定，再做形态鉴定将不同类群分开，才能做进一步的研究。
[0003] 对固定线虫PCR扩增的研究报道不是很多。Thomas等（1997)曾对5%甲醛固定48h 的自由生活线虫（Caenorhabditis elegans、Zeldia punctata、Aduncospiculum halicti) 的D2-D3扩展区进行了成功扩增，目的片段约<400bp;沈锡权等（2005)对丙酮、乙醇、乙醇+ 50mmol/L EDTA(pH8.0)和5 %海水福尔马林等4种固定剂中对海洋线虫18S核糖体RNA基因 进行了研究，发现用蛋白酶K法提取DNA可以扩增到约1.7kb的目的片段。对固定植物寄生线 虫的研究报道更是很少，Rubtsova等(2005)对使用TAF(三乙醇胺:福尔马林:蒸馏水= 2:7: 91)固定24h的植物寄生线虫长针线虫(Longidorus spp.)，以及该固定液固定后，脱水制成 永久玻片保存最长达11年的长针线虫分别进行D2-D3扩展区PCR扩增，均成功扩增到约 200bp的目的片段。0〇1'1^8等(2002)在对用4%福尔马林固定的人寄生线虫（31：1'〇1^71丨(168 spp.)进行DNA提取时发现，对于新4%福尔马林固定和酒精脱水保存在甘油中的标本使用 蛋白酶K裂解，可以从核糖体DNA小亚基（约1700bp长）中获得约1000bp的片段;但对福尔马 林固定保存10年后又酒精脱水保存在甘油玻片中的线虫来说，同样步骤则很难获得，需要 使用更强的裂解方法，才能使线虫表皮破裂，但也可以获得目的片段。相似穿孔线虫 (Radopholus similis(Cobb)Thorne，1949)是一种迁移性植物内寄生线虫，已报道的寄主 植物超过250种(01&1111〇11，1977)，严重危害多种经济植物和观赏植物（（^^6丨 &1，1990; Richardson et al，1993;Uchida et al，2003;Sundararaju et al，1979)，是诸多国家的 重要检疫危险性植物有害生物（Cotton J et al;0EPP/EPP0,2008)，也是中国禁止进境植 物检疫性有害生物（中华人民共和国农业部，2007)。目前，随着经济及农业生产和农产品贸 易迅速发展，植物种苗等种植材料在国家和地区间调运的数量不断增加，从而促使了相似 穿孔线虫在世界广泛的传播。由于相似穿孔线虫对作物为害所造成的损失非常大，所以需 要建立起一系列的检测方法，来检测该线虫在我国的侵染情况。相似穿孔线虫寄生植物根 系，在植物组织和土壤中均能生存完成生活史。由于土壤中线虫种类较多，但植物线虫数量 分布不均匀，所以每种种类分离到的可能较少，这对于缺乏形态学分类鉴定专门知识技能 的相关人员来说，难以根据形态学特征进行快速准确的属种鉴定，一般都采取先杀死固定 保存，然后再逐步进行相关研究的程序。所以发明一种可以检测固定植物线虫的PCR检测方 法对于植物线虫种类鉴定具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种固定线虫单条 虫DNA粗提液的制备方法。
[0005] 本发明的再一目的在于提供上述制备方法制备得到的固定线虫单条虫DNA粗提 液。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述固定线虫单条虫DNA粗提液的应用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] 一种固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法，包含如下步骤：
[0009] (1)线虫样品的洗涤:将固定线虫置于水中初步清洗，然后将线虫转至1XTE缓冲 液或1 XPBS缓冲液中，浸泡洗涤12h~24h;
[0010] (2)固定线虫样品的裂解:将步骤（1)洗涤后的单条固定线虫置于6yL~10yL裂解 液中，并将线虫刺破，得到固定线虫和裂解液的混合物;然后将混合物迅速冻结；
[0011] (3 )DNA粗提液的制备:将步骤(2)中冻结后的固定线虫和裂解液的混合物在95°C ~99°C的条件下处理5min~lOmin;然后加入蛋白酶K除蛋白，得到固定线虫单条虫DNA粗提 液；
[0012] 步骤（1)中所述的固定线虫的固定液为包含福尔马林、甘油和水的FG固定液，其 中，福尔马林、甘油和水的体积比为10:1:89;
[0013]步骤（1)中所述的1 X TE缓冲液包含如下质量百分比计的组分:Tris碱1.211 %， Na2EDTA 0.3722 %，水补足100 %;所述的IX TE缓冲液的pH值为8.0;
[0014]步骤（1)中所述的1 X PBS缓冲液包含如下组分:终浓度为137mM的NaCl、终浓度为 2.7mM的KC1、终浓度为10mM的Na2HP〇4和终浓度为2mM的KH2P〇4;
[0015]步骤（1)中所述的固定线虫采用1 X PBS缓冲液浸泡洗涤时，优选用1 X PBS缓冲液 浸泡洗涤2h后，重新更换新鲜PBS缓冲液再次浸泡洗涤12h~24h;
[0016]步骤(1)中所述的冻结的温度优选为不超过-80°C;
[0017]步骤(2)中所述的裂解液包含如下组分:终浓度为10mM的Tris、终浓度为2.5mM的 MgCl2和终浓度为50mM的KC1以及体积百分比为0.45%的TWEEN 20和质量百分比为0.05% 的gelatin;所述的裂解液的pH值为8.2;
[0018] 步骤(2)中所述的蛋白酶K的工作浓度优选为400~500yg/mL;
[0019] 步骤(2)中所述的除蛋白的条件优选为65°C处理60min，然后95°C处理lOmin;
[0020] 一种固定线虫单条虫DNA粗提液通过上述方法制备得到；
[0021] 所述的固定线虫单条虫DNA粗提液在线虫检测鉴定领域中的应用；
[0022] 所述的固定线虫单条虫DNA粗提液在线虫检测鉴定领域中的应用，优选包含如下 步骤：
[0023] (1)以上述固定线虫单条虫DNA粗提液为模板，设计线虫特异性引物，进行PCR扩 增；
[0024] (2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物进行分析，确定线虫的种类；
[0025]所述的PCR扩增的体系优选为25yL反应体系，具体如下所示： 上述固定线虫单条虫DNA粗提液 2μ^, 2XPCR buffer 12.5 pL；
[0026] 2 mM dNTP 5 ^L； 聚合酶 0.5 gL; 上游引物 0.8 pL;
[0027] 下游引物 0.8 pL; 水 补足25 μ_[;
[0028] 所述的的PCR扩增的条件优选为：94°C预变性3min; 94°C30sec，55°C30sec，68°C lmin，共35个循环;68°C延伸lOmin;
[0029] 所述的聚合酶优选为高保真高扩增率酶KOD FX;
[0030] 所述的线虫优选为相似穿孔线虫；
[0031] 所述的上游引物和下游引物优选为：
[0032] 上游引物：5' -CTACAAATGTGACGCGAA-3' ；
[0033] 下游引物：5' -CAATCTGCACAATGAACATAC-3' ；
[0034]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0035] 目前对于固定线虫PCR的报道并不多，而已有的报道多是对福尔马林新固定的线 虫，且多数扩增片段较短，一般小于400bp，而对于固定植物