专利名称：一种将抗根结线虫的rna干扰基因导入黄瓜的方法
技术领域：
本发明涉及黄瓜转基因技术，特别是一种获得表达干扰线虫MiMpkl基因的RNA干扰片段的黄瓜转基因方法。
背景技术：
近些年随着保护地栽培大面积推广，加之重茬严重，根结线虫对黄瓜生产的危害日趋严峻。而现有资源中缺乏抗南方根结线虫的种质资源，目前利用传统育种手段尚无法解决此问题，因此需通过转基因技术引入新的抗原，拓宽栽培黄瓜的遗传基础。在专利号为ZL200810118726.X，名称为“一种RNA干扰载体及其应用”的专利中公开了以南方根结线虫的MiMpkl基因为靶标构建的MiMpkl RNA干扰载体，并将该载体转入蕃茄中，使蕃茄获得了较好的对线虫的抗性,体外饲喂实验也证明该RNA干扰载体能够有效干预线虫体内的一个信号转导酶MARK蛋白的合成，阻碍线虫的生长和发育，从而达到防治线虫的目的。可以预知，将载有该基因的RNA干扰载体转入黄瓜中获得抗线虫的转基因黄瓜品系，将是一种缓解目前黄瓜受线虫危害的有效方法，但是为顺利实现此目的，须借助高效的转基因体系。虽然在蕃茄，大豆等作物上，都有转基因转化率高的报道，同时未有报道将干扰载体转化于黄瓜中，通过沉默线虫自身基因达到防治线虫的目的。黄瓜的遗传转化研究始于1986年，但在黄瓜抗线虫的遗传转化方面的研究仍然很少，于玉梅(2008)从被根结线虫侵染的黄瓜根系cDNA中扩增出根结线虫的保守基因16D10，构建植物表达载体，通过花粉管通道法将16D10转入黄瓜，得到的抗性苗经PCR检测，I株扩增出特异条带。朱妍妍(2008)采用相同的方法扩增得到基因16D10，构建了抗根结线虫的RNAi植物表达载体，通过根癌农杆菌介导法和花粉管通道法转化黄瓜，但最终未得到转基因植株。魏爱民等(2006)用农杆菌介导法将抗虫基因eqkam导入黄瓜，仅对抗虫基因转化黄瓜的影响因素进行了研究说明，未说明是否获得再生植株，后其又采用花粉管通道法将抗虫基因eqkam转化黄瓜，经卡那霉素抗性筛选，获得了再生植株，但转化率仅为0. 14%。在植物遗传转化研究中，常通过使用乙酰丁香酮(AS)来辅助农杆菌转化，因为AS是一种酚类物质，可诱导农杆菌内Ti或Ri质粒DNA上的Vir区基因的活化和表达，促进农杆菌T-DNA向宿主细胞核转移，从而提高转化效率。AS尤其对单子叶植物的遗传转化非常必要，而双子叶植物由于在外植体受伤后会自行合成酚类物质，因此不必外加酚类物质就可以使Vir区基因活化，但实验证明加入适量AS依然可以提高转化率。AS被广泛应用于目前的植物转基因技术中，在黄瓜的遗传转化中利用AS辅助转化的报道也较多，将IOOmg/LAS添加到共培养培养基中，再生频率高达83. 3 %，但对转化效率的影响并不大，有待进一步改进。因此随着对双子叶植物转基因研究的深入和技术的改进，迫切需要开发辅助转化效果更明显、对外植体伤害更小的试剂。以往的研究曾发现抗氧化剂对促进植物外植体分化、缓解褐化有较好的作用，近些年硫辛酸(lipoic acid，下文简写为LA)作为一种超强型抗氧化剂被运用到植物组织培养研究中，并获得了较好的试验效果。而目前LA也被应用到大豆和番茄的遗传转化研究中，结果显示转化效率分别从0. 6%和29. 8%显著增加到
3.7%和87%，并可显著降低大豆和番茄的假阳性率；小麦的转化率从2. 8%提高到5. 7% ;在棉花上，可以使草甘膦抗性芽率由41. 4%增长到61. 2%。而目前在黄瓜的遗传转化中利用AS辅助转化的报道较多，将100mg/L AS添加到共培养培养基中，再生频率高达83. 3%。
发明内容
本发明根据上述领域的需求和空白，提供一种改进的黄瓜遗传转化体系，使黄瓜的遗传转化率显著提高，高效地获得了能够表达干扰线虫MiMpkl基因的转基因黄瓜，该遗传转化体系能减少在遗传转化筛选过程中所耗费的时间和人力成本，提高遗传转化的工作效率。同时，通过黄瓜表达MiMpkl基因，可有效的沉默根结线虫的MiMpkl基因，影响其正常发育，减少对黄瓜的危害。本发明的方案如下 一种将抗根结线虫的RNA干扰基因导入黄瓜的方法，包括以下步骤(I)预培养黄瓜外植体子叶或子叶节；(2)准备用于浸染的含有外源基因载体的农杆菌液；(3)将所述外植体置于所述农杆菌悬液中浸染15 20mins ；(4)浸染后的外植体接种于共培养培养基中，25°C黑暗条件下培养2 3d ; (5)共培养后的外植体置于初步选择培养基中初步筛选2 3周，筛选抗生素为潮霉素；(6)初步筛选出的外植体转入到再次选择培养基中再次筛选I周，筛选抗生素为
潮霉素；(7)再次筛选出的保持绿色的外植体接种到添加0. 5mg/L GA的BPM培养基中伸长
培养；(8)生根培养获得再生植株；其特征在于所述含有外源基因载体为pCAGC1341_dsMiMpkl，⑵中的农杆菌悬液中和共培养培养基中含有硫辛酸50 100mg/L，乙酰丁香酮50mg/L。所述外植体为子叶，所共培养培养基为MS+2. Omg/L BA+1. 0mg/L ABA+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。所述外植体为子叶节，所共培养培养基为MS+0. 5mg/L BA+2. 0mg/L AgN03+50 lOOmg/L LA+50mg/l AS pH = 5. 4。所述外植体为子叶，(5)和(6)中用于筛选的潮霉素的浓度分别为10mg/L，25mg/L0所述外植体为子叶节，(5)和(6)中用于筛选的潮霉素的浓度分别为7mg/L，15mg/L0所述外植体为子叶，所述初步选择培养基为MS+2. Omg/L BA+1. Omg/L ABA+10mg/L Hyg+400mg/L cef,pH= 5. 4,再次选择培养基为MS+25mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4。
所述外植体为子叶节，所述初步选择培养基为MS+0. 5mg/L BA+2. Omg/LAgN03+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4,再次选择培养基为MS+15mg/L Hyg+400mg/lcef pH = 5. 4。所述(I)中，所述预培养指外植体为子叶，经消毒灭菌的黄瓜种子在MS培养基中生长I 2天后，切除胚根，子叶部分十字对切成4块，获得子叶外植体；或所述外植体为子叶节，经消毒灭菌的黄瓜种子在MS培养基中，种子萌发后转入光下培养4 5天，当子叶呈直立状态时切取，去除1/2子叶仅留2mm的下胚轴，并在预培养基PM上培养2天得到子叶节外植体。本发明为了获得抗线虫转基因黄瓜，以专利号为ZL200810118726.X，名称为“一种RNA干扰载体及其应用”中公开的RNA干扰载体pCAGC1341-dsMiMpkl为外源基因载体转化黄瓜，希望获得抗线虫的转基因黄瓜品种。鉴于目前报道的黄瓜遗传转化方法不够高效难以获得转基因再生植株的现状，发明人对于现有的黄瓜转基因方法进行了改进。在外源基因载体转化到外植体的阶段，本发明在浸染菌液与共培养培养基中都加硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS),显著提高了获得转化效率,转化效率(％ ) = PCR或southern blot检测为的阳性植株数/再生植株总数X 100%。本发明的实验数据表明，在适当浓度的如50 100mg/L LA搭配适当浓度的如50mg/L AS的情况下，二者共同作用于农杆菌转化时，抗性芽率相比对照或者单独使用LA或AS时都有显著提高，且Southern-blot检验下的转化效率也有所增长，证明LA与AS协同作用更有利于黄瓜的遗传转化，其中LA可缓解自由基对细胞的伤害、减缓组织的氧化过程，而AS促进Vir区基因的活化，两者共同作用下使转化率得以提高。但是，本发明的实验数据同时也表明，LA与AS之间的合作协调作用仅限于非常小的浓度范围内，超过某些阈值，可能二者之间的作用存在相互拮抗，因为在一些情况下，如表3和表4所示，搭配使用的结果出人意料地比单独使用AS或LA都低。本发明还提供了含有AS和LA的共培养培养基的配方，以使本发明的遗传转化体系得到整体上的优化和改进。本发明还研究了在对转化体初步筛选及再次筛选中，采用潮霉素进行筛选的方案，现有技术中一般都采用从一而终的高浓度潮霉素筛选抗性转化体。本发明的研究发现，采用梯度筛选即先低浓度后高浓度的潮霉素对初步转化体进行选择，与对照相比，能够显著降低假阳性率，提高获得阳性再生植株的比例。本研究中发现，不同的外植体对于潮霉素的耐受力不相同，因此，不同的外植体采用不同的梯度设置，如以子叶为外植体时，潮霉素筛选梯度为10mg/L, 25mg/L。如以子叶节为外植体时,潮霉素筛选梯度为7mg/L, 15mg/L。
图I黄瓜子叶节的遗传转化过程I :预培养；2 :选择培养；3 :抗性植株；4 :对照。图2不同选择压对子叶节遗传转化的影响每组柱形图从左到右依次为对照、15mg/L Hyg筛选、梯度Hyg筛选。图3黄瓜抗性植株的PCR检测图4黄瓜抗性植株的southern blot检测图5黄瓜MiMPKl转化植株的根结线虫田间接种试验I对照；2黄瓜转化植株图6黄瓜转基因植株田间接种根结线虫鉴定结果纵坐标表示平均根结数(根结数/株)、
图7不同LA/AS处理对黄瓜子叶节再生频率的影响左纵坐标表示再生频率(％ )，右纵坐标表示再生芽数/外植体(个)图8PCR验证黄瓜子叶节再生植株转化效率
具体实施例方式以下通过实验具体描述本发明的技术方案，但以下实验不应被解释为对本发明的限制。试验材料本试验所用的试验材料是新泰密刺黄瓜，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜育种课题组提供。根癌农杆菌菌株为EHA105。质粒载体为pCAGC1341_dsMiMpkl，含有潮霉素抗性基因和线虫基因MiMPKl，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所植物病理实验室惠赠。以上生物材料，本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。其它试剂MS基本培养基(M5519)、硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS)购自Sigma (上海)生物技术公司，6-BA、ABA、IAA、AgN03、头孢霉素(Cef)、卡纳霉素(Km)、利福平(Rif)、潮霉素(Hyg)、NaCl、酵母粉、蛋白胨均购自北京拜尔迪生物技术公司。所配制的MS固体(液体)培养基和LB固体(液体)培养基高压灭菌后常温保存备用；试验所需试剂配制为母液后用一次性过滤器(0. 22um)过滤除菌，-20°C保存备用，培养基配方如表I所不。表I本发明最终确定的黄瓜遗传转化用优化培养基
权利要求
1.一种将抗根结线虫的RNA干扰基因导入黄瓜的方法，包括以下步骤 (1)预培养黄瓜外植体子叶或子叶节； (2)准备用于浸染的含有外源基因载体的农杆菌液； (3)将所述外植体置于所述农杆菌悬液中浸染15 20mins； (4)浸染后的外植体接种于共培养培养基中，25°C黑暗条件下培养2 3d ; (5)共培养后的外植体置于初步选择培养基中初步筛选2 3周，筛选抗生素为潮霉素； (6)初步筛选出的外植体转入到再次选择培养基中再次筛选I周，筛选抗生素为潮霉素； (7)再次筛选出的保持绿色的外植体接种到添加0.5mg/L GA的BPM培养基中伸长培养; (8)生根培养获得再生植株； 其特征在于所述含有外源基因载体为pCAGC1341-dsMiMpkl，(2)中的农杆菌悬液中和共培养培养基中含有硫辛酸50 100mg/L，乙酰丁香酮50mg/L。
2.根据权利要求I所述的方法，所述外植体为子叶，所共培养培养基为MS+2.Omg/LBA+1. Omg/L ABA+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。
3.根据权利要求I所述的方法，所述外植体为子叶节，所共培养培养基为MS+0.5mg/LBA+2. Omg/L AgN03+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。
4.根据权利要求I所述的方法，所述外植体为子叶，(5)和(6)中用于筛选的潮霉素的浓度分别为10mg/L, 25mg/L。
5.根据权利要求I所述的方法，所述外植体为子叶节，(5)和(6)中用于筛选的潮霉素的浓度分别为7mg/L, 15mg/L。
6.根据权利要求4所述的方法，所述初步选择培养基为MS+2.Omg/L BA+1. Omg/LABA+1 Omg/L Hyg+400mg/L cef, pH = 5. 4,再次选择培养基为MS+25mg/L Hyg+400mg/L cefpH = 5. 4。
7.根据权利要求5所述的方法，所述初步选择培养基为MS+0.5mg/L BA+2. Omg/LAgN03+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4,再次选择培养基为MS+15mg/L Hyg+400mg/Lcef pH = 5. 4。
8.根据权利要求I 7任一所述的方法，(I)中所述预培养指外植体为子叶，经消毒灭菌的黄瓜种子在MS培养基中生长I 2天后，切除胚根，子叶部分十字对切成4块，获得子叶外植体；或所述外植体为子叶节，经消毒灭菌的黄瓜种子在MS培养基中，种子萌发后转入光下培养4 5天，当子叶呈直立状态时切取，去除1/2子叶仅留2mm的下胚轴，并在预培养基PM上培养2天得到子叶节外植体。
全文摘要
本发明“一种将抗根结线虫的RNA干扰基因导入黄瓜的方法”，涉及黄瓜转基因技术。其特征在于在转化过程中，利用含有外源基因载体pCAGC1341-dsMiMpkl，在农杆菌悬液中和共培养培养基中均添加硫辛酸100mg/L和乙酰丁香酮50mg/L以提高农杆菌转化效率，此外本发明还采用了潮霉素梯度筛选的方法以及相应的培养基方案，进一步提高了获得黄瓜阳性转化体的效率。
文档编号C12N15/82GK102634539SQ20121001685
公开日2012年8月15日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者张圣平, 王烨, 苗晗, 谢丙炎, 陈国华, 顾兴芳 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所