专利名称：一种利用NaCl溶液分离线虫的方法
技术领域：
本发明涉及线虫分离方法。
背景技术：
线虫也叫圆虫，为地球上数量最大的动物类群，是所有蠕虫的通称。其可寄生于动、植物，或自由生活于土壤、淡水和海水环境，因其分布广泛、生境多样，而在生物学、地理学和环境科学领域被广泛研究。对自然界中的线虫分离是线虫研究的最基本环节，也是至关重要环节。获取足量线虫是进行研究与应用的根本保障。目前，土壤线虫的分离方法主要采用蔗糖离心浮选法、贝尔曼漏斗法和浅盘法。贝尔曼漏斗法和浅盘法只可用于活虫的分离，分离效率低于蔗糖离心浮选法。蔗糖离心浮选法是将含线虫的植物或土样用水搅匀后离心，将沉淀用蔗糖溶液搅匀，再离心、 沉淀，过筛冲洗；该法可对含死亡线虫的样品进行分离，不受采样时间和操作室温度高低的限制，是线虫分离最为常用的方法。但蔗糖离心浮选法，用时较长，工作量大，线虫易受损伤而且耗费电能。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的蔗糖离心浮选法分离线虫中出现的用时较长，工作量大，线虫易受损伤而且耗费电能的问题，本发明提供了一种利用NaCl溶液分离线虫的方法。本发明中的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法是通过以下步骤实现的一、称取线虫载体样品，然后加入浓度为4 6mol/L的NaCl溶液中搅拌5 30min，得到混合液，其中，NaCl溶液与线虫载体样品的质量比为5 20 : I ;二、将步骤一得到的混合液静置沉淀20 60min，得到上清液和沉淀物；三、将步骤二得到的沉淀物代替步骤一中的线虫载体样品，按步骤一和步骤二的方法重复操作2 6次，然后弃去沉淀物，与步骤二获得的上清液一起共得到3 7份上清液；四、将80目和500目的分样筛摞在一起，500目的分样筛放在80目分样筛的下面，得到筛组，然后将步骤三得到的3 7份上清液合并，注入筛组中筛分，然后将截留在500目的分样筛中的沉淀物用水反向冲洗出来，获得完整线虫，完成NaCl 溶液对线虫的分离。本发明步骤四中将合并的上清液注入筛组时只要避免上清液溅出即可。本发明的有益效果是本发明直接采用了高浓度NaCl溶液(4 6mol/L)浮选线虫，避免了蔗糖离心浮选法中两次离心分离和两次沉淀过程以及耗时的沉淀过程，将分离时间由12多个小时缩短为I. 5 2小时；解决了蔗糖离心浮选法中两次离心时产生的线虫损伤问题；节省了线虫载体样品离心分离时所耗电能；将体积与含水量不同的样品进行相同比例的盐液处理，减少了干扰因素，降低线虫样品采集的系统误差，保证分离效率的同时还提高了分离结果的精确度。本发明的浓NaCl溶液分离方法与传统蔗糖分离方法相比，工作量减少了 2/3，工作时间减少了 90%左右，降低了电能损耗且线虫无损伤。经过对测试结果的统计检验表明， 本方法与蔗糖离心浮选法的分离效果无明显差异。本发明在科研工作中进行了应用，线虫分离效果良好。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式中一种利用NaCl溶液分离线虫方法是通过以下步骤实现的一、称取线虫载体样品，然后加入浓度为4 6mol/L的NaCl溶液中搅拌5 30min，得到混合液，其中，NaCl溶液与线虫载体样品的质量比为5 20 I ;二、将步骤一得到的混合液静置沉淀20 60min，得上清液和沉淀物；三、将步骤二得到的沉淀物代替步骤一中的线虫载体样品，按步骤一和步骤二的方法重复操作2 6次，然后弃去沉淀物，与步骤二获得的上清液一起共得到3 7份上清液；四、将80目和500目的分样筛摞在一起， 500目的分样筛放在80目分样筛的下面，得到筛组，然后将步骤三得到的3 7份上清液合并，注入筛组中筛分，然后将截留在500目的分样筛中的沉淀物用水反向冲洗出来，获得完整线虫，完成NaCl溶液对线虫的分离。本实施方式中为了保证NaCl的工作浓度，步骤一中的线虫载体样品含水率大 (^ 80% )的时候(如水样)，NaCl溶液与线虫载体样品的质量比高一些就可以，为10 20 I ;当线虫载体样品为植物或土壤样品时，其中含水率小于80%时，NaCl溶液与植物或土壤样品的质量比低一些就可以，为5 10 I。本发明直接采用了高浓度NaCl溶液(4 6mol/L)浮选线虫，避免了蔗糖离心浮选法中两次离心分离和两次沉淀过程以及耗时的沉淀过程，将分离时间由12多个小时缩短为I. 5 2小时；解决了蔗糖离心浮选法中两次离心时产生的线虫损伤问题；节省了线虫载体样品离心分离时所耗电能；将体积与含水量不同的样品进行相同比例的盐液处理， 减少了干扰因素，降低线虫样品采集的系统误差，保证分离效率的同时还提高了分离结果的精确度。本发明的浓NaCl溶液分离方法与传统蔗糖分离方法相比，工作量减少了 2/3，工作时间减少了 90%左右，降低了电能损耗且线虫无损伤。经过对测试结果的统计检验表明， 本方法与蔗糖离心浮选法的分离效果无明显差异。本发明在科研工作中进行了应用，线虫分离效果良好。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中NaCl溶液的浓度为4. 5 5. 5mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中NaCl溶液的浓度为5mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中搅拌时间为8 25min。其它步骤及参数与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中搅拌时间为10 20min。其它步骤及参数与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中NaCl溶液与线虫载体样品的质量比为8 10 I。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤二中将步骤一得到的混合液静置沉淀30 50min。其它步骤及参数与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤二中将步骤一得到的混合液静置沉淀45min。其它步骤及参数与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤三中按步骤一和步骤二的方法重复操作3 5次，然后弃去沉淀物，得到4 6份上清液。其它步骤及参数与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤三中按步骤一和步骤二的方法重复操作4次，然后弃去沉淀物，得到5份上清液。其它步骤及参数与具体实施方式
一至八之一相同。为了验证本发明的有益效果，进行如下对比试验试验一一种利用NaCl溶液分离线虫方法是通过以下步骤实现的一、称取50g 土壤样品(采自吉林长岭羊草草甸土壤)，然后加入浓度为5mol/L的NaCl溶液中搅拌 20min，得到混合液，其中，NaCl溶液与土壤样品的质量比为10 I ;二、将步骤一得到的混合液静置沉淀50min，得上清液和沉淀物；三、将步骤二得到的沉淀物代替步骤一中的50g 土壤样品，按步骤一和步骤二的方法重复操作4次，然后弃去沉淀物，与步骤二获得的上清液一起共得到5份上清液；四、将80目和500目的分样筛摞在一起，500目的分样筛放在80 目分样筛的下面，得到筛组，然后将步骤三得到的3 7份上清液合并，注入筛组中筛分，然后将截留在500目的分样筛中的沉淀物用水反向冲洗出来，获得完整线虫，完成NaCl溶液对线虫的分离。上述实验总共用了 IOOmin就完成了对线虫的分离。同时采用传统的蔗糖分离方法，对50g 土壤样品(取自与上述实验同一地方的土壤，采自吉林长岭羊草草甸土壤)进行浮选，具体的蔗糖分离方法为将50g 土壤样品加入约500mL水充分搅匀获得水土混合液,静止5min后,分别依次通过60、400目分样筛进行筛分，收集水土混合液重复上述筛分过程3次后，用清水冲400目的分样筛中的物质至烧杯中，于20°C静止沉淀12h后，弃去上清液，加水搅拌沉淀物后置于离心机内以2000r · mirT1 离心5min,弃去上清液,加浓度为800g *L_1鹿糖溶液搅勻，再次以2000r mirT1离心5min, 将上清液倒入500目分样筛中用水冲洗，得到3113条线虫(其中受损伤的达634条)。共花费了 12. 5个小时。可见，试验一的浓NaCl溶液分离方法与传统蔗糖分离方法相比，分离效果无明显差异，工作量减少了 2/3，工作时间由12. 5个小时降低至lOOmin，减少了约90%的工作时间，降低了电能损耗且线虫无损伤。
权利要求
1.一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于利用NaCl溶液分离线虫的方法通过以下步骤实现的一、称取线虫载体样品，然后加入浓度为4 6mol/L的NaCl溶液中搅拌5 30min，得到混合液，其中，NaCl溶液与线虫载体样品的质量比为5 20 I ;二、将步骤一得到的混合液静置沉淀20 60min，得到上清液和沉淀物；三、将步骤二得到的沉淀物代替步骤一中的线虫载体样品，按步骤一和步骤二的方法重复操作2 6次，然后弃去沉淀物，与步骤二获得的上清液一起共得到3 7份上清液；四、将80目和500目的分样筛摞在一起，500目的分样筛放在80目分样筛的下面，得到筛组，然后将步骤三得到的3 7份上清液合并，注入筛组中筛分，然后将截留在500目的分样筛中的沉淀物用水反向冲洗出来，获得完整线虫，完成NaCl溶液对线虫的分离。
2.根据权利要求I所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤一中 NaCl溶液的浓度为4. 5 5. 5mol/L。
3.根据权利要求I所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤一中 NaCl溶液的浓度为5mol/L的。
4.根据权利要求I所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤一中搅拌时间为8 25min。
5.根据权利要求I所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤一中搅拌时间为10 20min。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤一中NaCl溶液与线虫载体样品的质量比为8 10 : I。
7.根据权利要求I至5中任一项所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤二中将步骤一得到的混合液静置沉淀30 50min。
8.根据权利要求I至5中任一项所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤二中将步骤一得到的混合液静置沉淀45min。
9.根据权利要求I至5中任一项所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤三中按步骤一和步骤二的方法重复操作3 5次，然后弃去沉淀物，与步骤二获得的上清液一起共得到4 6份上清液。
10.根据权利要求I至5中任一项所述的一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，其特征在于步骤三中按步骤一和步骤二的方法重复操作4次，然后弃去沉淀物，与步骤二获得的上清液一起共得到5份上清液。
全文摘要
一种利用NaCl溶液分离线虫的方法，它涉及分离线虫的方法，本发明要解决现有的蔗糖离心浮选法分离线虫中出现的用时较长，工作量大，线虫易受损伤而且消耗电能的问题。本发明通过如下步骤来实现一、将线虫载体样品加入到NaCl溶液中，搅拌后得到混合液；二、混合液静置后得到上清液和沉淀物；三、用沉淀物代替线虫载体样品重复上述操作，弃去沉淀物，得到上清液；四、将上述所有上清液合并后注入分样筛组中，再用水反向冲洗高目分样筛即可得到线虫。本发明可应用于生物学、地理学和环境科学等领域。
文档编号G01N1/34GK102607928SQ20121007435
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者吴东辉, 武海涛, 王云彪, 闫修民 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所