专利名称：一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法的制作方法
技术领域：
本发明具体涉及人禽流感病毒酶联免疫吸附(ELISA)检测方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术：
自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注。其后，该病一直在亚洲区零星爆发，但在2003年12月开始，禽流感在东亚多国-主要在越南、韩国、泰国-严重爆发，并造成越南多名病人丧生。直到2005年中，疫症不但未有平息的迹象，而且还不断扩散。现时远至东欧多个国家亦有案例。禽流感是由禽流感病毒引起的烈性人畜共患病。波及范围之广，危害程度之深引起了科学家的极大关注，各国投入大量的人力和财力对禽流感进行深入研究，但目前为止还不能完全控制和消除危害，因此对禽流感的检测预防显得非常关键。目前禽流感检测技术主要有分子生物学技术和血清学诊断技术，分子生物学检测方法需要专业理论知识和配套的昂贵实验仪器，不便于基层对禽流感病毒进行快速简便的检测。而ELISA方法具有灵敏度高、可标准化操作和结果易于分析等特点，能够帮助人们有效的检测和防控禽流感疫情，是世界卫生组织推荐的检测禽流感病毒的主要方法之一。
发明内容
针对现有情况存在的问题，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性好的用于快速检测禽流感病毒的双抗体夹心法。为实现上述目的，本发明一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，该方法具体为I)人工改造合成突变的人禽流感病毒HA基因；2)设计扩增表达人禽流感病毒HA基因引物；3)禽流感病毒HA基因的PCR扩增；4)将目的片段与载体pETlOO/D-TOPO连接，构建重组质粒；5)转化表达细胞； 6) IPTG诱导重组蛋白的表达；7)重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体并纯化；8)重组蛋白免疫兔制备兔血清并纯化；9)单克隆抗体用于ELISA包被，制备的多克隆抗体作为检测抗体，辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG作为二抗；10)建立双抗体夹心检测禽流感病毒抗原的方法。进一步，所述步骤I)中人工改造合成突变的人禽流感病毒HA基因序列为atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgcattggttacc acgcaaacaa ctcgacagtg caggttgaca caataatgga aaagaacgtt
actgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacacaatgggaagct ctgcgatctagatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtagctggatggct cctcggaaacccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtcttacatagtgga gaaggccagtccagccaatg acatctgtta cccaggggat ttcaacgactatgaagaact gaaacacctattgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatccccaaaagttc ttggcccaatcatgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccataccaggggaagtc ctcctttttcagaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatgcatacccaacaataaa gaagagctacaataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtgggggattcaccaccc taatgatgcggccgagcaga taaagctcta tcaaaaccca aacacctatatttccgttgg aacatcaacactaaaccagc gtttggtacc aaaaatagct actagatccaaagtaaacgg gcaaagtggaagaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatgctatcaattt cgagagtaatggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtcaagaaagggga ctcagcaattatgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagtgtcaaactcc aatgggggcgataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctatcaccatcgggga atgccccaaatatgtgaaat caaacagatt agtccttgca actggactcagaaatgcccc tcaaagagagagaagacgta aaaagaga。进一步，所述步骤2)中HA基因引物序列为HA-F :5' -cacatggagaaaatagtgcttcttc-31HA-R 5r -tctctttttacgtcttctctc-3!。进一步，所述步骤3)中PCR扩增条件为
权利要求
1.一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，该方法具体为 1)人工改造合成突变的人禽流感病毒HA基因； 2)设计扩增表达人禽流感病毒HA基因引物； 3)禽流感病毒HA基因的PCR扩增； 4)将目的片段与载体pETlOO/D-TOPO连接，构建重组质粒； 5)转化表达细胞； 6)IPTG诱导重组蛋白的表达； 7)重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体并纯化； 8)重组蛋白免疫兔制备兔血清并纯化； 9)单克隆抗体用于ELISA包被，制备的多克隆抗体作为检测抗体，辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG作为二抗； 10)建立双抗体夹心检测禽流感病毒抗原的方法。
2.如权利要求I所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤I)中人工改造合成突变的人禽流感病毒HA基因序列为atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgcattggttacc acgcaaacaa ctcgacagtg caggttgaca caataatgga aaagaacgttactgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatctagatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaacccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagtccagccaatg acatctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacacctattgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggcccaatcatgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc aggggaagtc ctcctttttcagaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatgcatacc caacaataaa gaagagctacaataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccaccc taatgatgcggccgagcaga taaagctcta tcaaaaccca aacacctata tttccgttgg aacatcaacactaaaccagc gtttggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtggaagaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ctatcaattt cgagagtaatggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaattatgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcgataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctatca ccatcgggga atgccccaaatatgtgaaat caaacagatt agtccttgca actggactca gaaatgcccc tcaaagagagagaagacgta aaaagaga。
3.如权利要求I所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤2)中HA基因引物序列为HA-F :5, -cacatggagaaaatagtgcttcttc-3! HA-R -tctctttttacgtcttctctc-3’。
4.如权利要求I所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增反应体系为
5.如权利要求I所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤4)中构建重组质粒具体步骤为 ①取一支无菌EP管，加入水2ul，胶条回收纯化产物2ul，Saltsolution lul，pET-lOO/D-TOPO载体lul后混匀，室温静置5分钟； ②无菌操作台上取3ul该体系到一瓶toplO细胞中，静止30分钟后，42°C热击40秒，立即放在冰上，2分钟后在无菌操作台上加入250ul的S0c培养基； ③半盖紧盖子，370C，225rpm,离心2小时，吸取200ul涂布于含有终浓度为50ug/ml氨苄抗生素的固体平板上； ④将该固体平板放入37°C培养箱内倒置培养16小时。
6.如权利要求I所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤5)和6)中具体步骤为将经过菌落PCR鉴定为阳性的单克隆接种于5ml终浓度为50ug/ml氨苄抗生素的LB固体培养基中，37°C，225rpm，培养12小时，吸取3ml接种于200ml的LB液体培养基中，继续培养2小时，用单光束紫外可见分光光度计测定0D600为0. 6时，加入终浓度为I. OmmoI/L的IPTG继续诱导表达6小时。
7.如权利要求I所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤7)和8)中具体步骤为去离子水清洗柱子，用五倍柱床体积的平衡缓冲液平衡柱子，待柱平衡后，将兔血清经0. 45uM滤膜滤过以平衡缓冲液10倍体积稀释后以ImL/min流速上柱,至少用五倍柱床体积的平衡缓冲液以lmL/min流速洗脱杂蛋白，先在每个收集管中加入100 μ L的中和缓冲液，使pH恢复至7. 4左右，以免失去活性。使用不同pH值洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，每管收集ImL ;分别取5 μ L每个收集管中的液体作SDS-PAGE分析，纯化好的抗体以PB工作液4°C透析，10000r/min离心30分钟，收集上清。
8.如权利要求7所述的用于快速检测禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述步骤7)中具体步骤为 ①将制备的鼠单抗用PH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为10ug/ml，IOOul/孔，置于4°C冰箱孵育16小时；每孔加入300ul的Wash buffer洗涤3次，每次2分钟，然后甩干；用含5%牛血清白蛋白的Wash buffer加满孔，37°C孵育封闭2小时，洗涤； ②将纯化的HA蛋白用样品稀释液稀释，按10倍梯度稀释为10_2， ο-3,ιοΛ ο-5, ο-6,10_7，IOOul/孔。每个稀释度重复一次；用HA3蛋白按10倍梯度稀释为10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7，IOOul/孔，作为阴性对照，重复3次;37°C孵育I小时，洗涤；另留3孔作为试剂空白对照； ③用0.OlM的PBS将纯化的兔多抗稀释为10ug/ml，每孔IOOul/孔；37°C，孵育I小时，洗涤；用PH7. 4的样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔稀释为0. 6ug/ml，每孔IOOul/孔；37°C孵育I小时，洗涤；每孔加入IOOul的TMB，室温避光，显色20分钟；每孔加入50ul的2M H2S04,自动酶联检测仪0D450读数。
全文摘要
本发明公开了一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法，用鼠单抗包被ELISA，用特异性兔多抗形成抗体抗原抗体复合物，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔形成检测抗体，通过采用双抗体ELISA法来进行检测人禽流感病毒。本发明用于快速检测禽流感病毒的双抗体夹心法，能够进行快速、有效的筛查诊断，有使用方便、检测准确的优点，适合在传染病防控领域推广应用，如用于入境人员筛查等。
文档编号G01N33/569GK102621320SQ20121007421
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者杨宇, 王静, 魏莲 申请人:中国检验检疫科学研究院