专利名称：一种检测禽流感病毒的荧光抗体的制备方法及固相免疫荧光检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测禽流感病毒的荧光抗体的制备方法及固相免疫荧光检测试 剂盒，属于免疫荧光检测领域。
背景技术：
禽流感是由禽流感病毒引起的一类严重危害家禽、家畜及野生动物的烈性传染 病，甚至还威胁人类的健康。快速、灵敏的检测方法对该病的及时确诊、疫情的有效防控 及预测预警至关重要。禽流感的检测方法主要有(1)病毒分离鉴定；(2)血清学检测，如 HA-HI、ELISA等；(3)分子生物学检测，如RT-PCR等。上述方法各有优缺点有的耗时长，如 病毒分离和血清学鉴定；有的需发病初期和康复期双份血清，如血清学检测法；有的灵敏 度高，但对实验条件和操作者技术水平要求较高，如荧光PCR ；有的简便易行，但灵敏度低， 如 HA-HI。免疫荧光检测法兼具抗原_抗体反应的特异性和荧光检测的灵敏性，灵敏度高达 l(T6mg/mL，具有特异、灵敏、快速、简便的特点。免疫荧光检测法广泛应用于传染病诊断，可 定性或定位检测。免疫荧光检测法的特异性和敏感性依赖于抗体的特异性、亲和力、滴度以及荧光 染料的特性。传统的荧光染料(如FITC等)具有毒性、易淬灭、受血清和其他生物样品本 底荧光干扰大等缺点。荧光检测常受血清和其他生物样品中本底荧光的影响。以血清为 例，400-600nm波段的本底荧光与常用的FITC的荧光发射光谱相重叠，干扰过大，影响检测 结果，这也是长期以来荧光免疫分析方法相对落后于ELISA、化学发光法等的重要原因。提 高免疫荧光检测法灵敏度和特异性的途径有(1)寻找优秀的荧光染料，如选用摩尔消光 系数大、荧光量子产率高、斯托克位移大、发射荧光波长位于红光区的染料；(2)结合使用 单克隆抗体、抗体夹心法、抗体包被技术、微粒富集荧光免疫分析法等免疫学技术；(3)采 用固相检测法，如以惰性材料微球、96孔板等为固相载体；(4)用蛋白A、亲和素生物素、酶 等代替抗体进行标记，通过检测信号的逐级放大来提高灵敏度。别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)是藻胆蛋白的一种，是存在于红藻和蓝藻 细胞中的一类水溶性的色素蛋白。APC的稳定态为(α β)3，分子量约为llOkDa，Amax = 620-650nm, Em = 660nm，摩尔消光系数为7X IO5CnT1M^荧光量子产率为68%。APC具有水 溶性大、无毒性、稳定性好、荧光量子产率高、斯托克位移大、荧光明亮、荧光不易淬灭等优 点，是优秀的荧光染料。APC是藻胆蛋白中发射荧光波长最大的一类，它能够发射出明亮的 红色荧光，极易于生物质本底的蓝色或绿色荧光区分，因此APC几乎不受生物质本底荧光 影响，荧光检测灵敏度明显提高。APC的检测灵敏度是cy5的7倍。APC是少有的长波长发 射的荧光染料，红光激发红光发射，促进了 633nm氦氖激光器的应用。国内外尚没有APC标 记荧光抗体应用于动物疫病检测的报道。APC是优秀的发射红色荧光的染料，但由于APC稳定性差，蛋白质交联时难以定量
4控制，造成荧光标记物的得率低、生产成本居高不下，交联剂浓度多高还会导致APC失活和 荧光丧失，因此限制了这一优秀染料在临床检测中的应用。发明人采用温和的异型双功能 化学交联剂SPDP及适宜的摩尔比进行APC、抗体的液相交联，研制的APC荧光标记物交联得 率大于90%，探针研制效率、质量显著提高，成本大幅降低，使其能够用于禽流感的快速免 疫荧光检测。固相免疫荧光检测法是免疫荧光检测法中较常用的一类，可用于检测可溶性抗原 或抗体。固相免疫荧光检测中常用的载体有尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、96孔板 等，但是常用的固相载体具备较低的本底荧光，会降低荧光检测的灵敏度。本发明采用的固 相载体为一种微球，由琼脂糖经溴化氰活化制备，冻干保存，微球直径为60-200um，无本底 荧光，购自Amersia公司。该微球载体在使用前需用ImM稀盐酸溶液溶胀30min，以同样浓 度的盐酸冲洗多次，最后用50mM pH 8PBS(含IOOmM NaCl)快速冲洗得到活化凝胶。活化 的微球应立即与抗体或抗原结合。
发明内容
本发明涉及一种检测禽流感病毒的荧光抗体的制备方法及固相免疫荧光检测试剂盒。本发明采用的螺旋藻别藻蓝蛋白(APC)是优秀的荧光染料，具有无毒性、水溶性 大、荧光明亮且不易淬灭等特点，检测灵敏度显著高于传统的荧光染料。APC在荧光染料中 独树一帜，在波长550-650nm的光激发下，APC能发射明亮的红色荧光，是少有的发射长波 长荧光染料，APC等红色荧光染料促使633nm氦氖激光器在荧光检测中大量应用。APC的组成和晶体结构特点决定了其稳定性低于其它藻胆蛋白，因此交联时控 制使用交联剂的浓度是关键。本发明选择SPDP与APC和抗抗体的摩尔比分别为20-50、 50-100 1，衍生后的APC与抗体以摩尔比1-3 1交联，制备的APC标记的荧光抗抗体交 联效率高、纯度高、荧光明亮、抗体活性好、稳定性好。本发明的解决方案如下别藻蓝蛋白(APC)的制备APC由钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)中阴离子 交换层析制备。藻体细胞加入5倍体积(v/w)的20mM磷酸缓冲液(pH6. 8-7. 0)，反复冻 融3次，离心，上清液中加入硫酸铵至终浓度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离心，沉淀溶 于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中，20mM的磷酸缓冲液(pH7)透析，透析液上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱层析，离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5.0，含50mM NaCl) 预平衡，洗脱液为20mM醋酸缓冲液(pH3. 6，含50mM NaCl)，洗脱速度为60mL/h，收集天蓝色 液体即为纯化的螺旋藻别藻蓝蛋白。纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓度为5-10mg/mL。禽流感病毒多克隆抗体制备禽流感病毒100倍稀释，尿囊腔接种9-11日龄SPF 鸡胚，每胚0. 2mL, 37-38°C孵育，收集接种24_120h的死胚的尿囊液，红细胞凝集试验检测 滴度> 1 256，无菌检验合格，以0. 3%甲醛37°C灭活24h，再按1 3比例加入灭菌10 号白油和吐温-80，用胶体磨乳化成油包水型油乳剂灭活疫苗。制备的禽流感病毒油乳剂灭 活苗免疫4周龄SPF鸡，颈部皮下注射1. OmL/只，首免10天后相同剂量加强免疫一次，二 免1周后采血，测定血清中禽流感病毒HI抗体，当HI效价> 1 256时采集血清，阴离子交换层析纯化，电泳鉴定无杂带，即为合格的禽流感病毒多克隆抗体，-20°C冷冻保存。APC标记荧光抗体的制备利用异型双功能交联剂SPDP分别在APC、抗体上衍生 吡啶二硫基团，然后用DTT还原抗体的衍生物引入游离-SH，将携带吡啶二硫基的APC与携 带巯基的抗体按一定摩尔比交联制备荧光抗体。交联步骤为将SPDP分别按20-50 1、 50-100 1的摩尔比与APC、抗体混勻，铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余 的SPDP。取DTT按50-100 1的摩尔比与抗体衍生物充分混勻，室温静置反应lh，超滤离 心除去多余的DTT。抗体-HS与APC衍生物以摩尔比1 1-3混勻，铝箔封好后于20_25°C 振荡反应20h。加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。APC标记的荧光抗体的纯化和交联效率分析液相色谱工作站上采用HPLC法 进行荧光抗体的交联效率分析和纯化，流动相为50mM PBS pH 7. 5，流速0. 5mL/min，检 测波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000sw(规格 7. 5mmX60cm)，荧光抗体最先被洗脱下来。收集洗脱峰，进行光谱学、抗体活性、电泳检测。 目标产物的洗脱峰面积占所有洗脱峰面积的比例即为交联效率。制备的荧光探针得率大于 90%。APC标记荧光抗体的光谱检测吸收光谱在紫外-可见光分光光度计上测定，扫描 波长区间250-700nm。吸收光谱检测可判定交联是否成功及交联反应是否导致APC变性。室 温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长580nm，荧光扫描范围为600-700nm。 在紫外区，APC标记荧光抗抗体的吸光度明显高于对照APC，吸收峰位置相同，这是因为APC 表面交联了抗体分子，而抗抗体在280nm有较强的光吸收；在450-700nm范围内，交联物的 吸收光谱与对照APC的吸收峰及吸光度相似，是由于抗体在此范围内无光吸收。APC标记光 抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于660nm，没有发生斯托 克位移的改变，仍具有APC的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低。APC标记荧光抗体的效价检测抗体效价采用微量血凝抑制试验方法(HI)测定。 用灭活的对应禽流感尿囊毒制备4单位检测抗原，反应在V型96孔板上进行。以红细胞凝 集抑制的最高稀释度为荧光抗体的效价。荧光标记抗体的HI效价应> 1 8。APC标记荧光抗抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分 离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%。218V恒压电泳。用0. 25% (w/v)考马斯亮蓝R-250 染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现APC标记荧光抗抗体既具有APC的α、β亚基 条带，又具有抗体的H、L链条带，电泳结果证实APC与抗抗体交联成功。APC标记荧光抗体的稳定性检测纯化的APC标记荧光抗体中加入0. 02%叠氮化 钠，4°C避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价，室温荧光发射光谱在荧光分光 光度计上测定，抗体效价采用血凝抑制试验方法测定，观察荧光亮度和抗体活性的变化。研 制的APC标记荧光抗体稳定性好，在0. 05mol/L的磷酸缓冲液中4°C保存60天，荧光抗体的 荧光强度保持不变，保存至90天荧光强度降低15%。4°C保存60天荧光抗体的抗体效价维 持在1 16，保存至90天抗体效价降至1 8。固相免疫荧光检测试剂盒的组装及应用固相免疫荧光检测试剂盒由溴化氰活化 的琼脂糖微球载体、APC标记的抗禽流感病毒荧光抗体、抗禽流感病毒多克隆抗体、洗涤液、 稀盐酸等组成。固相免疫荧光检测过程为取0. 3g溴化氰活化的琼脂糖凝胶冻干粉，置于 ImM盐酸中溶涨30min，以同样浓度的盐酸冲洗多次，用50mM pH 8PBS (含IOOmM NaCl)快速冲洗得到ImL活化凝胶，立即与2mL浓度为5mg/ml的抗禽流感病毒抗体混勻，20°C缓慢 振荡作用12h，加入2mL 0. IM的乙醇胺封闭，20°C缓慢振荡作用4h，离心去上清，用50mM PH 8PBS反复冲洗凝胶，离心获得偶联有抗体的琼脂糖凝胶，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成 10% (ν/ν)的悬浮液。取偶联有抗体的琼脂糖凝胶50uL，置于洁净的试管中，加待检病毒 液100uL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗10次。加入5ug/ml浓度的荧光抗体 100uL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗5次。吸取少量微球，滴于低荧光背景的玻 片上，盖片，甘油缓冲液封片，荧光显微镜下红光激发观察、判定结果。将荧光强度与背景染 色强度以+表示，分为++++(最强阳性)、+++(强阳性)、++(较强阳性)、+ (弱阳性)、_ (阴 性)五级。荧光强度达到++以上判定为阳性。敏感性、特异性、重复性检测以PBS将禽流感病毒连续稀释，用固相免疫荧光检 测试剂盒对各稀释度逐一进行荧光检测，以能检测出的病毒最高滴度作为该检测试剂盒的 灵敏度。分别以新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎 病毒、鸡痘病毒等取代禽流感病毒，用固相免疫荧光检测试剂盒进行荧光检测，在绿光激发 下均未检测到荧光，证明试剂盒的特异性好。试验设SPF鸡血清阴性对照和PBS空白对照， 均未检测到荧光。用固相免疫荧光检测试剂盒对同一个稀释度的禽流感病毒样品重复检测3次，结 果一致，表明检测试剂盒的重复性较好。与FITC标记荧光抗体检测禽流感病毒比较纯化的禽流感抗体用50mM pH 9的碳 酸缓冲液透析过夜，调整浓度为10mg/ml。用上述碳酸缓冲液配制0. lmg/ml的FITC。将抗 体置于10倍抗体体积的FITC溶液中4°C缓慢搅拌透析24h，然后迅速将标记抗体置于50mM PH 7. 2的磷酸缓冲液透析，经常更换缓冲液。以FITC标记的抗体探针代替APC标记的抗体 探针，用固相免疫荧光检测试剂盒对禽流感病毒检测。APC标记探针比FITC标记探针的检 测灵敏度高2-5倍。综上所述，APC标记的荧光抗体荧光明亮，4°C保存60天荧光、抗体活性无明显衰 减，与FITC标记的荧光抗体相比，荧光更明亮，灵敏度更高，受生物质本底荧光干扰小。试 剂盒采用微球载体表面积大，自身无本底荧光，能够提高免疫荧光检测的灵敏度，可用于禽 流感的快速检测。
附图1为APC标记抗禽流感病毒荧光抗体的HPLC纯化图。液相柱型号为TSK G3000sw,流动相为50mM pH7. 5的PBS，流速0. 5mL/min, APC标记抗禽流感病毒荧光抗体、 抗禽流感病毒抗体、APC的洗脱时间为分别为19. 57min、27. 32,31. 26min。附图2为APC标记荧光抗体(虚线)及对照APC (实线)的荧光光谱。APC标记荧 光抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于660nm，没有发生斯 托克位移改变，仍具有APC的特征荧光发射光谱。附图3为APC标记荧光抗体固相免疫荧光检测结果。APC标记荧光抗体阳性微球 发射明亮红色荧光，而阴性微球检测不到荧光。
具体实施例方式实施方式1 一种检测H9亚型禽流感病毒的荧光抗体的制备方法及其固相免疫荧 光检测试剂盒别藻蓝蛋白(APC)的制备钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)细胞加入5倍体积 (v/w) 20mM磷酸缓冲液(pH6. 8-7. 0)，反复冻融3次，4°C IOOOOrpm离心，上清液中加入硫酸 铵至终浓度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离心，沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中， 20mM的磷酸缓冲液(pH7)透析，透析液上DEAE SepharoseFast Flow阴离子交换色谱柱层 析，离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5.0，含50mM NaCl)预平衡，洗脱液为20mM醋酸缓冲 液(pH3.6，含50mM NaCl)，洗脱速度为60mL/h，收集天蓝色液体即为纯化的螺旋藻别藻蓝 蛋白，纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5 PBS充分透析除盐，调整 浓度为 5-10mg/mL。禽流感病毒多克隆抗体制备禽流感病毒(A/Chicken/Shandong/6/96，H9亚 型)100倍稀释，尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚，每胚0. 2mL，37-38 °C孵育，收集接种 24-120h的死胚的尿囊液，红细胞凝集试验检测滴度> 1 256，无菌检验合格，以0. 3%甲 醛37°C灭活24h，再按1 3比例加入灭菌10号白油和吐温-80，用胶体磨乳化成油包水型 油乳剂灭活疫苗。制备的禽流感病毒油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡，颈部皮下注射LOmL/ 只，首免10天后相同剂量加强免疫一次，二免1周后采血，测定血清中禽流感病毒HI抗体， 当HI效价> 1 256时采集血清，阴离子交换层析纯化，电泳鉴定无杂带，即为合格的禽流 感病毒多克隆抗体，-20°C冷冻保存。APC标记H9亚型禽流感病毒抗体探针的制备将SPDP按20 UlOO 1的摩尔 比分别与APC、H9亚型禽流感病毒抗体混勻，铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去 多余的SPDP。取DTT按50 1的摩尔比与H9亚型禽流感病毒抗体衍生物充分混勻，室温 静置反应lh，超滤离心除去多余的DTT。禽流感病毒抗体-HS与APC衍生物以摩尔比1 3 混勻，铝箔封好后于20-25°C振荡反应20h。用10mg/ml的NEM溶液20ul封闭多余巯基，室 温旋转反应60min。反应中的NEM不用除去。APC标记的荧光抗体的纯化液相色谱工作站上采用HPLC法进行荧光抗体的交联 效率分析和纯化，流动相为50mM PBS pH 7. 5，流速0. 5mL/min，检测波长190_800nm。采用分 子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000SW (规格7. 5mmX 60cm)，荧光标记抗体最 先被洗脱下来。APC标记荧光抗体、抗禽流感病毒抗体、APC的洗脱时间为分别为19. 57min、 27.32、31.26min。收集19. 57min洗脱峰(附图1)。目标产物的洗脱峰面积占所有洗脱峰 面积的比例即为交联效率，荧光探针交联得率为92%。APG标记荧光抗体的光谱检测吸收光谱在紫外_可见光分光光度计上测定，扫描 波长区间250-700nm。吸收光谱检测可判定交联是否成功及交联反应是否导致APC变性。室 温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长580nm，荧光扫描范围为600-700nm。 在紫外区，APC标记荧光抗抗体的吸光度明显高于对照APC，吸收峰位置相同，这是因为APC 表面交联了抗体分子，而抗体在280nm有较强的光吸收；在450-700nm范围内，交联物的吸 收光谱与对照APC的吸收峰及吸光度相似，是由于抗体在此范围内无光吸收。APC标记荧光 抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于660nm，没有发生斯托 克位移的改变，仍具有APC的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低(附图2)。
APC标记荧光抗体的效价检测抗体效价采用微量血凝抑制试验方法(HI)测定。 用灭活的对应禽流感尿囊毒制备4单位检测抗原，反应在V型96孔板上进行。以红细胞凝 集抑制的最高稀释度为荧光抗体的效价。荧光标记抗体的HI效价应> 1 8。APC标记荧光抗抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分 离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%，218V恒压电泳，用0. 25% (w/v)考马斯亮蓝R-250 染色，脱色后观察结果。APC标记荧光抗体SDS-PAGE电泳既具有APC的α、β亚基条带， 又具有抗体的H、L链条带，电泳结果证实APC与抗体交联成功。APC标记荧光抗体的稳定性检测纯化的APC标记荧光抗体中加入0. 02%叠氮 化钠，4°C避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价，室温荧光发射光谱在荧光分 光光度计上测定，抗体效价采用血凝抑制试验方法测定，观察荧光亮度和抗体活性的变化。 APC标记的荧光抗体稳定性较好，0. 05mol/L的磷酸缓冲液中4°C保存60天，荧光抗体的荧 光强度保持不变，保存至90天荧光强度降低10%。HI检测结果表明，4°C保存60天荧光抗 体的抗体效价维持在1 16，保存至90天抗体效价降至1 8。固相免疫荧光检测试剂盒的组装及应用固相免疫荧光检测试剂盒由溴化氰活化 的琼脂糖微球载体、洗涤液、APC标记的抗禽流感病毒荧光抗体、抗禽流感病毒多克隆抗体、 稀盐酸等组成。固相免疫荧光检测过程为取0. 3g溴化氰活化的琼脂糖凝胶冻干粉，置于 ImM盐酸中溶涨30min，以同样浓度的盐酸冲洗多次，用50mM pH 8PBS (含IOOmM NaCl)快 速冲洗得到ImL活化凝胶，立即与2mL浓度为5mg/ml的抗禽流感病毒抗体混勻，20°C缓慢 振荡作用12h，加入2mL 0. IM的乙醇胺封闭，20°C缓慢振荡作用4h，离心去上清，用50mM PH 8PBS反复冲洗凝胶，离心获得偶联有抗体的琼脂糖凝胶，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成 10% (ν/ν)的悬浮液。取偶联有抗体的琼脂糖凝胶50uL，置于洁净的试管中，加待检病毒 液100uL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗10次。加入5ug/ml浓度的荧光抗体 100uL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗5次。吸取少量微球，滴于低荧光背景的 玻片上，盖片，甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察，判定结果。将荧光强度与背景染色强度 以+表示，分为++++(最强阳性)、+++(强阳性)、++(较强阳性)、+(弱阳性)、_(阴性) 五级。荧光强度达到++以上判定为阳性。试验设SPF鸡血清阴性对照和PBS空白对照。制备H9亚型禽流感病毒尿囊毒，测定病毒的红细胞凝集价为1 320，EID5tl为 10_815，病毒的蛋白浓度为23. 13mg/mL。以PBS将尿囊毒连续稀释，利用建立的固相免疫 荧光法对每个稀释度逐一进行荧光检测，以能检测出的病毒最高滴度作为该检测试剂盒的 灵敏度。检测结果表明，APC标记的荧光探针进行检测，在红光激发下阳性微球呈明亮的 红色荧光，阴性结果无荧光(附图3)，试剂盒能检测出H9亚型禽流感病毒的最低浓度为 1. 85X10_5mg/ml。特异性、重复性检测分别以新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病 病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒等取代禽流感病毒，用上述固相免疫荧光检测试剂盒 进行荧光检测。结果表明试剂盒具有较好的特异性，除H9亚型禽流感病毒检测呈阳性外其 它病毒检测均无荧光。用固相免疫荧光检测试剂盒对同一个稀释度的禽流感病毒样品重复 检测3次，检测结果一致，表明试剂盒的重复性好。FITC标记抗体荧光探针检测禽流感病毒纯化的禽流感H9抗体用50mM pH 9的碳酸缓冲液透析过夜，调整浓度为10mg/ml。用上述碳酸缓冲液配制0. lmg/ml的FITC。将抗 体置于10倍抗体体积的FITC溶液中4°C缓慢搅拌透析24h，然后迅速将标记抗体置于50mM PH 7. 2的磷酸缓冲液透析，经常更换缓冲液。以FITC标记的抗体探针代替APC标记的抗体 探针，用固相免疫荧光检测试剂盒对H9尿囊毒检测。结果表明，FITC标记探针检测阳性微 球在蓝光激发下发射绿色荧光，能检测出H9亚型禽流感病毒的最低浓度为9. 26X 10-5mg/ ml，灵敏度比APC标记探针低5倍。表IAPC标记抗体荧光探针检测H9亚型病毒
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FlTC labeled antibody+++++++++++
++十+++++
+十++++实施方式2 检测H5亚型禽流感病毒的荧光抗体的制备方法及其固相免疫荧光检 测试剂盒别藻蓝蛋白(APC)的制备收集钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻体细胞，加 Λ 5倍体积(v/w)的20mM磷酸缓冲液(ρΗ6· 8-7. 0)，反复冻融3次，4°C IOOOOrpm离心，上 清液中加入硫酸铵至终浓度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离心，沉淀溶于20mM的磷酸缓 冲液(pH7)中，20mM的磷酸缓冲液(pH7)透析，透析液上DEAE Sepharose Fast Flow阴离 子交换色谱柱层析，离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5. 0，含50mMNaCl)预平衡，洗脱液为 20mM醋酸缓冲液(pH3. 6，含50mMNaCl)，洗脱速度为60mL/h，收集天蓝色液体即为纯化的螺 旋藻别藻蓝蛋白，纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析 除盐，调整浓度为5-10mg/mL。H5亚型禽流感病毒多克隆抗体制备禽流感病毒(A/Goose/Guangdong/1/96，H5 亚型)100倍稀释，尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚，每胚0. 2mL, 37-38 °C孵育，收集接种 24-120h的死胚的尿囊液，红细胞凝集试验检测滴度> 1 128，无菌检验合格，以0. 3%甲 醛37°C灭活24h，再按1 3比例加入灭菌10号白油和吐温-80，用胶体磨乳化成油包水型 油乳剂灭活疫苗。制备的禽流感病毒油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡，颈部皮下注射LOmL/ 只，间隔10天后相同剂量加强免疫一次，二免1周后采血，测定血清中禽流感病毒HI抗体， 当HI效价> 1 256时采集血清，阴离子交换层析纯化，电泳鉴定无杂带，即为合格的禽流 感病毒多克隆抗体，-20°C冷冻保存。APC标记H5亚型禽流感病毒荧光抗体的制备将SPDP按50 1的摩尔比分别 与APC、H5亚型禽流感病毒抗体混勻，铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的 SPDP。取DTT按100 1的摩尔比与H5亚型禽流感病毒抗体衍生物充分混勻，室温静置反 应lh，超滤离心除去多余的DTT。H5亚型禽流感病毒抗体-HS与APC衍生物以1 1摩尔 比混勻，铝箔封好后于20-25°C振荡反应20h。用10mg/ml的NEM溶液20ul封闭多余巯基， 室温旋转反应60min。反应中的NEM不用除去。APC标记的荧光抗体的高效纯化和交联效率分析液相色谱工作站上采用HPLC 法进行荧光抗体的交联效率分析和纯化，流动相为50mM PBS pH 7. 5，流速0. 5mL/min, 检测波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000sw (规格
10>7. 5mmX 60cm)，APC标记荧光抗体、抗禽流感病毒抗体、APC的洗脱时间为分别为19. 57min、 27.32、31.26min。收集19. 57min洗脱峰(附图1)。目标产物的洗脱峰面积占所有洗脱峰 面积的比例即为交联效率，荧光探针交联得率为90%。APC标记荧光抗体的光谱检测吸收光谱在紫外_可见光分光光度计上测定，扫描 波长区间250-700nm。吸收光谱检测可判定交联是否成功及交联反应是否导致APC变性。室 温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长580nm，荧光扫描范围为600-700nm。 在紫外区，APC标记荧光抗抗体的吸光度明显高于对照APC，吸收峰位置相同，这是因为APC 表面交联了抗体分子，而抗抗体在280nm有较强的光吸收；在450-700nm范围内，交联物的 吸收光谱与对照APC的吸收峰及吸光度相似，是由于抗体在此范围内无光吸收。APC标记光 抗体与对照APC在580nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于660nm，没有发生斯托 克位移的改变，仍具有APC的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低。APC标记荧光抗体的效价检测抗体效价采用微量血凝抑制试验方法(HI)测定。 用灭活的对应禽流感尿囊毒制备4单位检测抗原，反应在V型96孔板上进行。以红细胞凝 集抑制的最高稀释度为荧光抗体的效价。荧光标记抗体的HI效价应> 1 8。APC标记荧光抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分离 胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%，218V恒压电泳，用0. 25% (w/v)考马斯亮蓝R-250染 色，脱色后观察结果。APC标记荧光抗体SDS-PAGE电泳既具有APC的α、β亚基条带，又 具有抗体的H、L链条带，电泳结果证实APC与抗抗体交联成功。APC标记荧光抗体的稳定性检测纯化的APC标记荧光抗体中加入0. 02%叠氮 化钠，4°C避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价，室温荧光发射光谱在荧光分 光光度计上测定，抗体效价采用血凝抑制试验方法测定，观察荧光亮度和抗体活性的变化。 APC标记的荧光抗体稳定性较好，0. 05mol/L的磷酸缓冲液中4°C保存60天，荧光抗体的荧 光强度保持不变，保存至90天荧光强度降低15%。HI检测结果表明，4C保存60天荧光抗 体的抗体效价维持在1 8，保存至90天抗体效价降至1 4。固相免疫荧光检测试剂盒的组装及应用固相免疫荧光检测试剂盒由溴化氰活化 的琼脂糖微球载体、APC标记的抗禽流感病毒荧光抗体、抗禽流感病毒多克隆抗体、洗涤液、 稀盐酸等组成。固相免疫荧光检测过程为取0. 3g溴化氰活化的琼脂糖凝胶冻干粉，置于 ImM盐酸中溶涨30min，以同样浓度的盐酸冲洗多次，用50mM pH 8PBS (含IOOmM NaCl)快 速冲洗得到ImL活化凝胶，立即与2mL浓度为5mg/ml的抗禽流感病毒抗体混勻，20°C缓慢 振荡作用12h，加入2mL 0. IM的乙醇胺封闭，20°C缓慢振荡作用4h，离心去上清，用50mM PH 8PBS反复冲洗凝胶，离心获得偶联有抗体的琼脂糖凝胶，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成 10% (ν/ν)的悬浮液。取偶联有抗体的琼脂糖凝胶50uL，置于洁净的试管中，加待检病毒 液100uL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗10次。加入5ug/ml浓度的荧光抗体 100uL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗5次。吸取少量微球，滴于低荧光背景的 玻片上，盖片，甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察，判定结果。将荧光强度与背景染色强度 以+表示，分为++++ (最强阳性)、+++(强阳性)、++ (较强阳性)、+ (弱阳性)、_ (阴性) 五级。荧光强度达到++以上判定为阳性。试验设SPF鸡血清阴性对照和PBS空白对照。制备H5亚型禽流感病毒尿囊毒，测定病毒的红细胞凝集价为1 128，EID5tl为10_7 2，病毒的蛋白浓度为12.5mg/mL。以PBS将尿囊毒连续倍比稀释，利用建立的固相免 疫荧光法对每个稀释度逐一进行荧光检测，以能检测出的病毒最高滴度作为该检测试剂盒 的灵敏度。检测结果表明，APC标记的荧光探针进行检测，在红光激发下阳性微球呈明亮 的红色荧光，阴性结果无荧光(附图3)，试剂盒能检测出H5亚型禽流感病毒的最低浓度为 2. 5Xl(T5mg/ml。特异性、重复性检测分别以新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病 病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒等取代禽流感病毒，用固相免疫荧光检测试剂盒进行 荧光检测。检测结果表明该试剂盒具有较好的特异性，除H5亚型禽流感病毒检测呈阳性外 其它病毒检测均无荧光。用试剂盒对同一个稀释度的禽流感病毒样品重复检测3次，检测 结果一致，表明该试剂盒的重复性好。FITC标记抗体荧光探针检测禽流感病毒纯化的禽流感H5抗体用50mM pH 9的碳 酸缓冲液透析过夜，调整浓度为10mg/ml。用上述碳酸缓冲液配制0. lmg/ml的FITC。将抗 体置于10倍抗体体积的FITC溶液中4°C缓慢搅拌透析24h，然后迅速将标记抗体置于50mM PH 7. 2的磷酸缓冲液透析，经常更换缓冲液。以FITC标记的抗体探针代替APC标记的抗体 探针，用固相免疫荧光检测试剂盒对H5尿囊毒检测。结果表明，FITC标记探针检测阳性微 球在蓝光激发下发射绿色荧光，能检测出H5亚型禽流感病毒的最低浓度为1. 25X 10-5mg/ ml，灵敏度比APC标记探针低2倍。表2APC标记抗体荧光探针检测H5亚型病毒
权利要求
一种检测禽流感病毒的荧光抗体的制备方法，包括阴离子交换层析法纯化APC，分别用摩尔比20 50∶1、50 100∶1的化学交联剂SPDP将APC、抗禽流感病毒抗体衍生，DTT以50 100∶1的摩尔比还原抗体衍生物产生抗体 HS，抗体 HS与APC衍生物以摩尔比1∶1 3液相交联，经HPLC纯化制备APC标记的抗禽流感病毒荧光抗体，本发明制备的APC标记的抗禽流感病毒荧光抗体得率高、纯度高、红色荧光明亮、性质稳定，可用于禽流感的快速、鉴别检测。
2.根据权利要求1的方法，其中APC由钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)阴离子交 换层析制备，制备步骤为藻体细胞加入5倍体积(v/w)的20mM磷酸缓冲液(pH6. 8-7. 0)， 反复冻融37次，离心，上清液中加入硫酸铵至终浓度为60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，离心， 沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH7)中，20mM的磷酸缓冲液(pH7)透析，透析液阴离子交换 色谱柱层析纯化，离子交换柱经20mM醋酸缓冲液(pH5.0，含50mMNaCl)预平衡，洗脱液为 20mM醋酸缓冲液(pH3.6，含50mM NaCl)，收集天蓝色洗脱液即为纯化的螺旋藻别藻蓝蛋 白，纯化的APC硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓度 为 5-10mg/mLo
3.根据权利要求1的方法，其中抗禽流感病毒抗体采用灭活的禽流感病毒抗原免疫 SPF鸡，经阴离子交换层析纯化制备，制备步骤为禽流感病毒100倍稀释，尿囊腔接种9-11 日龄SPF鸡胚，每胚0. 2mL, 37-38°C孵育，收集接种24_120h的死胚的尿囊液，红细胞凝集 试验检测滴度> 1 256，无菌检验合格，以0. 3%甲醛37°C灭活24h，按1 3比例加入灭 菌10号白油和吐温-80，用胶体磨乳化成油包水型油乳剂灭活疫苗，制备的禽流感病毒油 乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡，颈部皮下注射，1. OmL/只，首免10天后相同剂量加强免疫一 次，二免1周后采血，测定血清中禽流感病毒HI抗体，当HI效价> 1 256时采集血清，阴 离子交换层析纯化制备禽流感病毒多克隆抗体，电泳鉴定无杂带，-20°C冷冻保存。
4.根据权利要求1的方法，其中荧光抗体的制备采用化学交联法，交联方法为APC、抗 体先用化学交联剂SPDP衍生，SPDP与APC、抗体的摩尔比分别为20-50 U50-100 1， DTT还原抗体的摩尔比为50-100 1，抗体-HS与APC衍生物以摩尔比1 1_3液相交联， 最后经HPLC纯化制备。
5.一种检测禽流感病毒的固相免疫荧光检测试剂盒，其中包括权利要求1制备的APC 标记抗禽流感病毒荧光抗体、琼脂糖微球载体、抗禽流感病毒多克隆抗体、稀盐酸溶液、PBS 等，可用于禽流感病毒的快速免疫荧光检测。
6.根据权利要求5的方法，其中固相载体为微球载体，由琼脂糖经溴化氰活化制备，直 径60-200um，冻干粉，购自Amersia公司，使用前用稀盐酸溶液溶胀处理，溶胀处理步骤为 取0. 3g溴化氰活化的琼脂糖凝胶冻干粉，置于ImM盐酸中溶涨30min，以同样浓度的稀盐酸 溶液冲洗多次，用50mM pH 8PBS (含IOOmM NaCl)快速冲洗得到ImL活化凝胶，活化凝胶应 立即与抗体或抗原结合。
7.根据权利要求5的方法，其中试剂盒的使用方法为取ImL活化凝胶立即与2mL浓度 为5mg/ml的抗禽流感病毒多克隆抗体混勻，20°C缓慢振荡作用12h，加入2mL 0. IM的乙醇 胺封闭，20°C缓慢振荡作用4h，离心去上清，用50mM pH 8PBS反复冲洗凝胶，离心获得偶联 有抗体的琼脂糖凝胶，用IOOmMpH 7. 5的PBS配成10% (ν/ν)的悬浮液。取偶联有抗体的 琼脂糖凝胶50uL，置于洁净的试管中，加待检病毒液100uL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗10次。加入5ug/ml浓度的荧光标记抗体lOOuL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5 的PBS冲洗5次。吸取少量微球，滴于低荧光背景的玻片上，盖片，甘油缓冲液封片，荧光显 微镜下以红光激发，观察、判定结果。阳性微球在红光激发下发射明亮的红色荧光，阴性微 球无荧光。全文摘要
本发明涉及一种检测禽流感病毒的荧光抗体的制备方法及固相免疫荧光检测试剂盒。本发明采用别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记抗禽流感病毒抗体制备荧光抗体，分别用化学交联剂SPDP将APC、抗体衍生，衍生物以适宜摩尔比液相交联，然后经高压液相色谱纯化制备荧光抗体。荧光抗体与CNBr活化的琼脂糖微球、抗禽流感病毒抗体、洗涤液等组装成固相免疫荧光检测试剂盒。试剂盒使用方法为微球载体活化后先用抗禽流感病毒抗体包被，洗涤，包被抗体的微球与待测样品(抗原)结合，洗涤后与荧光抗体结合，洗涤去除未结合的荧光抗体，荧光显微镜下观察、判定结果。本发明制备的荧光抗体交联效率高、纯度高、红色荧光明亮、荧光抗体性质稳定。试剂盒采用的微球固相载体能显著提高荧光检测灵敏度，适于禽流感病毒的快速检测。
文档编号G01N21/64GK101957377SQ20101028432
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者周百成, 张玉忠, 张秀美, 朱丽萍, 李雁冰, 杨少华, 胡北侠, 许传田, 颜世敢 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所