一种鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPV/C-JCX及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物动物疫苗领域，具体设及一株鸡C型禽偏肺病毒及其相关应 用。
【背景技术】
[0002] 禽偏肺病毒（aMPV)是一种新发现的重要的禽类呼吸道疾病的病原，在火鸡和鸡 等禽类上引起的急性、高度传染性上呼吸道感染，引起种鸡和产蛋鸡产蛋量急剧下降，并且 影响蛋壳的质量。该病毒属于副黏病毒科偏肺病毒属，在负差电子显微镜下观察到的禽偏 肺病毒为多边，楠圆形，常见直径为80-200皿，偶尔会有大量长丝状的形态存在，长度可达 lOOOnm。禽偏肺病毒有A、B、C、D四个亚型。2012年我们在我国东南部首次发现鸡C型禽 偏肺病毒感染。在流行病调查中显示我国不管是地方品种，还是国外引种的白羽鸡，aMPV感 染都普遍存在。
[0003]aMPV具有极高传染性，传播速度快，还可造成免疫抑制反应，常伴随细菌继发性感 染，可使感染禽类死亡率增加25% -40%，对养殖业造成严重的经济损失。目前我国还没有 针对禽偏肺病毒感染的疫苗。在我们调查研究过程中，数家企业由于C型禽偏肺病毒感染 造成肉种鸡和大龄蛋鸡生产性能大幅下降，不得不对其进行淘汰，损失巨大。由于鸡C型禽 偏肺病毒为我国首次报道，目前我们主要通过对SPF鸡或者鸡胚进行分离培养和鉴定，但 是运并不能完全满足开展病毒致病机制和疫苗等相关研究的需求。本发明利用非洲绿猴肾 细胞Vero深入研究病毒的体外细胞培养特性发现，最初体外培养并不产生明显病变，经过 连续传代和驯化，获得一株细胞适应病毒。经间接免疫巧光、透射电镜及蛋白质印迹法证实 分离株为鸡C型禽偏肺病毒aMPV/C-JCX，为下一步深入开展aMPV疫苗研究提供了物质材 料。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一株细胞适应性的鸡C亚型禽偏肺病毒，本发明的目的还 在于提供所述禽偏肺病毒的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明通过将野外分离的鸡C型禽偏肺病毒在Vero细胞上 连续传代，获得了一株毒力减弱的细胞适应毒株aMPV/C-JCX，该病毒已于2015年6月 24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为禽偏肺病毒（Avain metapneumovirus)，保藏号为CGMCCNo. 10900。
[0006]本发明病毒是收集国内首次分离到的鸡C型禽偏肺病毒感染病鸡组织研磨液，接 种贴壁生长的单层非洲绿猴肾细胞Vero,细胞培养物作为下一轮传代的接种物，依次连续 传代获得一株细胞培养适应毒株。在适应过程中，早代次培养周期为7-9天，传至60代后 缩短至3-5天可W观察到明显的细胞病变。经过透射电镜、间接免疫巧光和蛋白质印迹法 证实该细胞能够有效的培养C型禽偏肺病毒。病毒透射电子显微镜下观察到病毒粒子呈圆 形，直径约170皿。病毒的滴度IgTCIDSO= 10 4'2/0. 1ml。经过SPF鸡证实该病毒毒力较 弱，具有良好的免疫原性和保护性，该细胞适应病毒毒株是生产病毒疫苗理想候选毒株。
[0007] 进而，本发明还提供所述的鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPV/C-JCX在制备防治禽偏肺 病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用。所述禽偏肺病毒感染引起的疾病可W是禽偏肺病毒 感染引起上呼吸道疾病或-产蛋下降等。可W用所述的鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPV/C-JCX 制备疫苗生产毒种。
[0008] 本发明的有益效果是提供了一株细胞适应毒株aMPV/C-JCX，该毒株可用于制备中 疫苗生产毒种，制备疫苗，用于防治禽偏肺病毒感染引起的疾病。
【附图说明】
[0009] 图1是免疫巧光的检测结果图，在巧光显微镜下观察发现，感染aMPV/C-JCX的 Vero细胞（图A)中可见明显的内巧光染色，而正常未接种细胞（图B)无巧光出现。
[0010] 图2是Western Blot检测实验结果图，使用特异性的病毒蛋白作为一抗，Western Blot检测不同接种时间病毒蛋白的表达发现，接毒细胞在48KD处有明显的蛋白条带。
[0011] 图3病毒形态图，在透射电子显微镜下观察到的病毒粒子呈圆形，直径约170皿。 [001引图4aMPV-JCX接种后并未引起鸡胚发育受阻，图A表示接种aMPV-JCX，B表示接 种PBS(对照组）。
【具体实施方式】
[0013] W下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0014] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0015] 实施例1aMPV/C-JCX毒株的获得及鉴定
[0016] 1.出发病毒aMPV/C-JCZ
[0017] 出发病毒为aMPV/C-JCZ，该病毒已于2015年6月24日在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中屯、（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究 所，邮编100101)保藏，分类命名为禽偏肺病毒（Avainmetapneumovirus)，保藏号为CGMCC No.10889。
[0018] 根据Reed-Muench法计算病毒的EID50, 1姐ID50 = 10 4'V〇. 2ml。通过回鸡试 验证实由aMPV/C-JCZ单独感染即可引起商品代黄羽肉鸡严重的呼吸道症状；肺部和气管 的病理检查发现，病毒感染引起严重的炎性病理损伤。
[0019] 使用QiagenRNeasyMiniKit提取病毒总RNA，使用SuperScriptTMIIIKit[^及 M基因特异性引物，合成的禽偏肺病毒CDNA为模板进行RT-PCR扩增，扩增产物W琼脂糖凝 胶电泳检测，回收后连接在T载体上，克隆成功后由上海生工生物工程技术有限公司进行 测序。M基因（SEQIDNo. 1)和GenBank上登记的A、B、C亚型禽偏肺病毒，依据MEGA5. 10 和DNAstar软件进行序列同源性比较和构建系统发育树，发现aMPV-JCZ与C型禽偏肺病毒 同源性为96. 0% -96. 7%，而与A和B型只有70. 6% -71. 7%的同源性。
[0020] 2、获取病毒样品
[0021] 收集呼吸道症状的病鸡鼻甲骨、气管、喉头和肺组织样品，研磨后在PBS中重悬， 3500巧m/min离屯、15分钟，上清使用0. 22ym过滤器除菌后保存在-80°C。
[0022] 3、病毒在Vero细胞上盲传和适