专利名称：禽肺病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及禽类病毒检测技术领域，具体涉及一对禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法。
背景技术：
禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)又名火鸡鼻气管炎病毒(Turkey Rhinotracheitis Virus, TRTV),属于副粘病毒科肺病毒亚科肺病毒属，为单链负股RNA病毒,可引起火鸡和一些其他禽类上呼吸道疾病。APV基因组包含了 8个主要的结构蛋白基因，基因组全长约为13.4 kb，8个基因从3’端到5’端排列顺序为 N-P-M-F-M2-SH-G-L。最初人们认为APV只有一个血清型，两个基因亚型(A和B)，通过核苷酸序列分析和单克隆抗体分析可以有效将两个基因型区分开。上世纪90年代末，分别在美国和法国出现了两种不同的新型的APV毒株(C型和D型)，改变了之前的看法，人们由此认为APV至少存在四个以上基因型或者多个血清型的毒株。RT-PCR已经被广泛地应用于APV的病原检测中，设计区别不同亚型APV的RT-PCR比设计通用型RT-PCR简单得多。但将亚型特异性RT-PCR作为首选的检测技术会导致当有新型APV存在的时候常常被忽略掉，不利于对APV感染进行有效地检测，D型APV就是在法国存在超过15年后才被认识到的。现有的用于APV检测引物只能检测出其中的某一种亚型，为了便于全面检测该病毒，急需一种通用型的RT-PCR检测方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物。本发明的另一目的是提供一种禽肺病毒RT-PCR检测方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的
禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: Γ2所示。基于上述设计的引物，本发明还保护一种禽肺病毒检测方法，是用上述SEQ IDNO: Γ2所示引物和待检样品RNA进行RT-PCR，如果PCR产物片段大小为319bp或320bp，则待检样品中有禽肺病毒。可以使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，如果电泳结果在319bp或320bp处出现扩增条带，即表明待检样品中有禽肺病毒。上述禽肺病毒检测方法中，RT-PCR的反应体系含有一步法PCR混合酶(PrimeScipt I Step Enzyme Mix)、缓冲液(2X1 Step Buffer)>SEQ ID NO: I 2所不引物、样品RNA和无RNA酶的水(RNase Free H20)。上述禽肺病毒检测方法中，RT-PCR的反应程序为
(1)50°C30min ；
(2)预变性95°C4min ；
(3)变性94°C30sec ;退火55 58°C 20sec ;延伸72°C I min ;共进行 30 个循环；
(4)延伸72°CIOmin0
上述RT-PCR反应程序的步骤(3)中退火温度最佳为57°C。上述禽肺病毒检测方法，RT-PCR扩增产物序列为SEQ ID NO: 3飞中的任意一条时，说明待检样品中有禽肺病毒。该检测方法可以同时检测APV病毒的多种亚型，至少包括A、
B、C、D四个目前已知的亚型。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明的引物特异性高、且片段小、敏感性高，整个PCR过程可以在2h内完成，能够特异地检测出各亚型APV的存在，可以大大减小对APV感染错漏诊断。
图I. APV各亚型病毒检测电泳结果，其中M:DNA Marker DL2000 ;1、空白对照；2、A 型 APV ;3、B 型 APV ;4、C 型 APV。图2. APV各亚型病毒RT-PCR产物测序结果，其中TN-A为A亚型，TN-B为B亚型，TN-C为C亚型，TN-D为D亚型。
具体实施例方式实施例I
1、试验材料
1.1主要试剂与仪器
AxyPrep 体液病毒 DNA/RNA 小量试剂盒(Cat No. AP-MN-BF-VNA-250), TaKaRaPrimeScript One step RT-PCR Kit Ver. 2 (TaKaRa Code:DRRO55A), Thermo 高速低温离心机，Thermo PCR 仪。I. 2 毒株
A、B型APV弱毒株购自海博莱生物有限公司，C型APV弱毒株购自梅里亚生物有限公司，作为待检样品。I. 3引物设计
首先对比APV A、B、C、D基因组N基因序列上共同的保守区域，然后设计一对扩增目的带为319bp或者320 bp的引物TNOI。表I
权利要求
1.禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物，其特征在于核苷酸序列如SEQID N0:l 2所示。
2.ー种禽肺病毒检测方法，其特征在于用权利要求I所述禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物和待检样品RNA进行RT-PCR，如果PCR产物片段大小为319bp或320bp，则待检样品中有禽肺病毒。
3.根据权利要求2所述禽肺病毒检测方法，其特征在于RT-PCR的反应体系含有ー步法PCR混合酶、缓冲液、SEQ ID NO: Γ2所示引物、样品RNA和无RNA酶的水。
4.根据权利要求2所述禽肺病毒检测方法，其特征在于RT-PCR的反应程序为(1)50。。30min； (2)预变性95°C 4min ；(3)变性94°C30sec ;退火55 58°C 20sec ;延伸72°C I min ;共进行 30 个循环； (4)延伸72°CIOmin0
5.根据权利要求4所述禽肺病毒检测方法，其特征在于步骤(3)退火温度为57°C。
6.根据权利要求2所述禽肺病毒检测方法，其特征在于RT-PCR扩增产物序列为SEQIDNO: 3^6中的任意一条时，说明待检样品中有禽肺病毒。
全文摘要
本发明公开了禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法，属于禽类病毒检测技术领域。该通用型RT-PCR检测引物核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示，检测方法是用禽肺病毒通用型RT-PCR检测引物和待检样品RNA进行RT-PCR，如果PCR产物片段大小为319bp或320bp，则待检样品中有禽肺病毒。本发明的引物特异性高、且片段小、敏感性高，整个PCR过程可以在2h内完成，能够特异地检测出各亚型APV的存在，可以大大减小对APV感染错漏诊断。
文档编号C12Q1/68GK102676701SQ20121019044
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者刘闯, 孙石开, 宋永峰, 张祥斌, 覃健萍, 邝春明, 陈 峰, 鲁俊鹏 申请人:广东温氏食品集团有限公司