专利名称：检测木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物检测技术领域，具体涉及ー种检测木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒。
背景技术：
木薯细菌性萎蔫病菌导致的木薯细菌性萎蔫病是木薯上最为严重的病害，是木薯繁育的ー个重要限制因子。该病具有高风险、分布广、可种传的特点，是国际上的ー种重要的植物检疫对象，在我国新出台的《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》被列为检疫性病害。木薯感染此病后可造成木薯产量下降12%_100%，该病害在南非被首次报道，目前在除欧洲以外的全世界的许多国家都有报道。1973年该细菌病害在Nigeria发生时当年就造成木薯产量损失75%，并导致了严重的恐慌。木薯细菌性萎蔫病菌主要为害部位是木薯的叶片、茎部。属系统性分布为害整株病害。叶片染病形成湿色角斑，湿度大时其上流胶，初为白色粘液，后变为黄褐色，致植株萎蔫、流胶。茎部染病常致茎凹陷，分泌出大量胶质物，加速叶片枯萎。块根染病維管束变为黄褐色，根系及維管束出现干腐，严重的全株死亡。病菌在老熟茎杆的皮部里存活，主要靠带菌的种茎进行远距离传播，此外雨水、昆虫、病土及带菌工具也可传播。在严重的木薯细菌性萎蔫病的困扰下，全世界大部分易感病地区都降低了木薯的种植面积。因此需要建立一种准确、高效、快速的木薯细菌性萎蔫病的检测方法，为木薯繁殖材料的检疫工作提供技术支持。但目前还没有能够精确的检测出检测木薯细菌性萎蔫病菌的相关技木。
发明内容
本发明的目的是提供检测木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒，从而能够精确快速的对木薯细菌性萎蔫病菌进行检测，从而弥补现有技术的不足。本发明ー个方面涉及检测木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增引物，为引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO 1-4 0本发明另ー个方面提供ー种木薯细菌性萎蔫病菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其中包括如下的组分(I)模板预处理反应液:3· 2μΜ引物FIP，3. 2μΜ引物ΒΙΡ，0· 4μΜ引物F3，0. 4μΜ引物 Β3，800 μ M dNTP, IXThermol Buffer ；所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分别如SEQ ID NO :1、2、3和4所示;(2)溶液 I :lXThermol Buffer, O. 64U/ μ L Bst DNA Polymerase,所述IXThermol Buffer 成分为20mM Tris-HCl (pH8. 8)，IOmM KCl, IOmM (NH4)2S04,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，pH 8.8。、
本发明的试剂盒用于检测植物中的木薯细菌性萎蔫病菌。本发明的试剂盒根据木薯细菌性萎蔫病菌菌株的TAL效应器蛋白质(pthBXam)保守基因序列设计引物，从而保证了检测方法的特异性。本发明采用改进的LAMP扩增技木，该技术特异性強，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特异性强、灵敏度高，特别适用于基层植保机构及植物产品公司与相关检测部门。
图I:本发明的引物检测木薯细菌性萎蔫病菌LAMP的扩增图谱，其中I空白对照、2阳性样品、3-6阴性对照、M DNA Marker。
具体实施例方式LAMP引物的设计主要是针对靶基因的四个不同的区域，基于靶基因3'端的以及 5'端的4个不同的位点设计4个引物。利用设计的异引物并依靠高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。本发明选用TAL效应器蛋白质(pthBXam)保守基因来设计LAMP引物。申请人在长期的研究中发现TAL效应器蛋白质(pthBXam)保守基因是木薯细菌性萎蔫病菌的特异序列之一，该序列在GenBank上的登录号是HQl 13297. I。本发明提供的木薯细菌性萎蔫病菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其中包括(I)模板预处理反应液其中包括3. 2 μ M引物FIP，3. 2 μ M引物BIP，O. 4 μ M引物F3，O. 4 μ M引物 Β3，800μΜ dNTP, IXThermol Buffer，和 ddH20。引物 FIP、BIP、F3 与 B3 的终浓度比为8 8 I I ο木薯细菌性萎蔫病菌引物F3 5' -CAGAACATCCCGACGCTG-3' (SEQ ID NO 1)B3 5' -GCCCTGTGGCCGTTGA-3' (SEQ ID NO 2)FIP 5' -AGCGCGACCGCTTAAGTCAAG-GTTCCGGCTTACATCCCCA-3' (SEQ ID NO 3)BIP 5' -GGCATTGCCGGCGATCACT-TCGAGCTTCGGAAAGGACCA-3' (SEQ ID NO 4)(2)溶液 I :lXThermol Buffer, O. 64U/ μ L Bst DNA Polymerase,和 ddH20。IXThermol Buffer 反应缓冲液成分为20mM Tris_HCl(pH8. 8)，IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，和 ddH20, pH 8. 8。本发明提供的利用上述试剂盒检测木薯细菌性萎蔫病菌的方法，包括下列步骤( I)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在I. 6-2. O范围内，浓度在IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检模板DNA于94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中45s ;然后94°C水浴25s和59°C水浴45s过程反复进行6个循环，产物用于LAMP模板。(3) LAMP 恒温扩增将上述经过处理的模板预处理溶液25 μ L加入25 μ L溶液I中，63°C加热60min，80°C IOmin,降温至 4°C。(4)核酸凝胶电泳检测
核酸扩增完成后，在反应管中加入6XLoading buffer (组分30mM EDTA ；36%(v/V) Glycerol ;0· 05%(w/v) Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v) BromophenoI Blue),取产物 10 μ L加入2%的琼脂糖凝胶板的样品孔中，IOOv电压，电泳30-40分钟，电泳成像系统拍照。扩增结果在琼脂糖凝胶电泳上为梯形核酸条带，如果出现条带可以判断为阳性，否则为阴性。下列实施例进ー步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。实施例I :对木薯细菌性萎蔫病菌标准样品的检测利用木薯细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增检测试剂盒，检测木薯细菌性萎蔫病菌的标准样品 (I)待检样品和木薯细菌性萎蔫病菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26(l/0D28(l在1.6-2. O范围内，浓度在IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检样品模板DNA于94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中45s ;然后94°C水浴25s和59°C水浴45s过程反复进行6个循环，产物用于LAMP模板。取2份模板预处理反应液23 μ L，分别加入2 μ L ddH20和木薯细菌性萎蔫病菌DNA，重复上述相同步骤，产物用作LAMP模板，分别作为阴性对照和阳性对照；(3) LAMP 恒温扩增将上述经过处理的模板预处理溶液25 μ L加入25 μ L溶液I中，63°C加热60min，80°C IOmin,降温至 4°C。(4)核酸凝胶电泳检测核酸扩增完成后，在反应管中加入6XLoading buffer，取产物10 μ L加入凝胶板的样品孔中，电泳40分钟，电泳成像系统拍照。检测结果如图I所示。结果表明，本发明设计的引物能够检测木薯细菌性萎蔫病菌；不会产生假阴性或假阳性。利用本发明的试剂盒对疑似感染了木薯细菌性萎蔫病菌的样品进行检测，结果为阳性。对该样品的细菌培养检测证实了本发明的试剂盒的可靠性。
权利要求
1.一种检测木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增引物，为引物F3、B3、FIP和BIP，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO 1-40
2.一种木薯细菌性萎蔫病菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其中包括如下的组分 (1)模板预处理反应液3.2 ii M引物FIP，3. 2 ii M引物BIP，0. 4 ii M引物F3，0. 4 ii M弓I物 B3，800iiM dNTP, IXThermol Buffer ；(2)溶液I :lXThermol Buffer, 0. 64U/ u L Bst DNA Polymerase,所述 IXThermol Buffer 成分为20mM Tris-HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4)2SO4,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，pH 8.8。
3.权利要求2所述的试剂盒用于检测植物中的木薯细菌性萎蔫病菌。
全文摘要
本发明涉及检测木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒。所述的引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO1-4。试剂盒内有模板预处理反应液、恒温扩增反应液Ⅰ。检测木薯细菌性萎蔫病菌的方法包括细菌DNA的提取、模板预处理、LAMP恒温扩增、核酸检测。本发明的试剂盒根据木薯细菌性萎蔫病菌菌株的TAL效应器蛋白质(pthBXam)保守基因序列设计引物，保证了检测方法的特异性。本发明采用改进的LAMP扩增技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特异性强、灵敏度高，特别适用于基层植保机构及植物产品公司与相关检测部门。
文档编号C12Q1/68GK102676688SQ20121018981
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者倪新, 厉艳, 吴兴海, 封立平, 王英超, 甘琴华, 纪瑛 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心