专利名称：用于检测ERCC1mRNA的核酸检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是ー种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类非小细胞肺癌(NSCLC)中的ERCCl表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提闻检测精度。
背景技术：
肺癌是全球发病率和病死率最高的肿瘤之一，其中约80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。非小细胞肺癌的治疗要根据肺癌的临床分期来进 行。对I、II、IIIA期主要以手术切除为主，_转移显著者，于壬龙前可辅以化疗或放疗。但是由于其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晩；现今又缺乏有效的早期诊断手段，初诊时约75%的患者失去了第一次手术机会，即确诊时多已不能进行手术治疗，仅能通过化疗或放疗缓解。而晚期NSCLC目前仍以联合化疗为主，但5年生存率不到15%。因而早发现、早诊断是争取良好预后的关键所在。ERCCl基因位于染色体19ql3. 2-13. 3编码ー种含有297个氨基酸的蛋白质，参与DNA链的切割和损伤修复，其表达产物与DNA修复酶缺乏互补基因F(XPF)形成紧密的异ニ聚体(ERCC1 — XPF)，具有损伤识别和切除5’端的双重作用，在核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)中起到限速或调节的重要作用。其活性的高低可反映整个NER修复活性的水平。在ー些肿瘤细胞中，ERCCl，XPB，XPD等核苷酸切除修复因子mRNA表达显著降低，提示核苷酸剪切修复能力的降低，导致细胞发生癌变的几率増加。有报道I一III期NSCLC患者手术标本ERCCl的表达水平与生存期存在一定的关系①I期NSCLC患者存在ERCCl高表达，是术后预后良好的独立指标。②ERCCl表达对I期和II 一III期NSCLC术后生存具有双重效应=ERCCl高表达减少了术后肿瘤复发的危险但同时对DDP耐药，I期NSCLC术后ERCCl高表达发挥更多的是其保护的一面，而II 一III期以钼类耐药或抵抗为主。因而，ERCCl表达水平对于后期的用药有着极其重要的指导作用。在实际应用中，用于检测ERCCl表达的方法主要为免疫组化，尽管该法原理简单，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测ERCCl表达水平。实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时在线检測，反应ERCCl在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于ERCCl基因检测
发明内容
鉴于现有技术中检测ERCCl的不足，本发明设计了检测内參/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测ERCCl基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了ー种用于检测ERCCl mRNA的核酸检测试剂盒。用于检测ERCClmRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、检测用上下游引物ERCCl-F/ERCCl-R 和探针 ERC Cl-Probe、參照用上下游引物 Actin-F/Actin-R 探针 Actin-Probe ;其中，ERCCl-F GGGAATTTGGCGACGTAATTCERCCl-R GCGGAGGCTGAGGAACAG ERCCl-Probe :FAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG_TAMRAActin-F TGAGCGAGGCTACAGCTTActin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA 进ー步地，检测用上下游引物和探针的比例优选为ERCC1-F ERCCl-R ERCCl-Probe 的摩尔比为 2 : 2 : I。參照用上下游引物和探针的比例优选为Actin-F : Actin-R : Actin-Probe的摩尔比为2:2:1。所述阳性对照品为含有ERCCl基因组的溶液；所述阴性对照品为无ERCCl基因组的溶液。RNA提取液可用商业产品QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蜡RNA抽提试剂盒替代。使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对ERCClmRNA进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。利用双标准曲线法，将检测结果与正常人的表达水平(0. 55)相比，能衡量受测者体内ERCCl基因表达水平是否正常，该方法是ー种新型的用于评价患者ERCCl表达水平的方法，也有助于患者的后期治疗方案的确定。由于引入了“正常人”替代了原有的单纯个体检测，不但能够对受测者体内ERCCl基因表达量进行检测，同时还能够与正常水平进行比较，指导后期用药，可用于辅助临床上乳腺癌的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。
图I是阳性检测结果示意图；图2是阴性检测结果示意图。
具体实施例方式实施例I本发明的用于检测ERCClmRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液；RNA 提取液QIAGEN RNeasy FFPE Kit。检测体系PCR 反应液THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(2X )、ERCC1 引物各 0. 8uM、ERCCl-probe (探针)0. 4uM ;Actin 引物各 0. 8uM、Actin-probe (探针)0. 4uM ;其中，ERCCl-F GGGAATTTGGCGACGTAATTCERCCl-R GCGGAGGCTGAGGAACAGERCCl-Probe FAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG-TAMRAActin-F TGAGCGAGGCTACAGCTTActin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ；阳性对照品含ERCCI基因组溶液； 阴性对照品不含ERCCl基因组溶液。实施例2本发明试剂盒的使用方法(I)抽提石蜡切片中的组织RNA:切去组织或者石蜡片样本于I. 5ml离心管中(刮拭);加入Iml组织透明液,振荡混勻后13000rpm离心Imin ;去除上清加入500ml组织透明液振荡混勻后13000rpm离心Imin ;去除上清,加入Iml无水こ醇振荡混勻后13000rpm离心Imin;去除上清后至于37度金属浴IOmin (开盖)，直至液体干燥；參考QIAGEN RNeasyFFPE Kit石蜡RNA抽提试剂盒说明书，提取样本RNA。(2)參考T0Y0B0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为 cDNA。(3)试剂配置按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装X=23ul反应液X (8份内參(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白対照)。(4)加样加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA ;阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。(5)检测检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500 (美国Applied Biosystems 公司)等。反应条件95°C预变性 Imin ；95°C 15s, 58°C 35sec 40 个循环，突光信号于58°C 35sec时米集。(6)结果判断将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。按照以下公式进行计算
权利要求
1.用于检测ERCClmRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于 检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、检测用上下游引物ERCCl-F /ERCCl-R 和探针 ERCCl-Probe、参照用上下游引物 Actin-F/ Actin-R 探针 Actin-Probe ;其中，ERCCl-F GGGAATTTGGCGACGTAATTCERCCl-R GCGGAGGCTGAGGAACAGERCCl-Probe FAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG-TAMRAActin-F TGAGCGAGGCTACAGCTT Actin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA
2.如权利要求I所述的核酸检测试剂盒，其特征在于ERCCl-F ERCCl-R ERCCl-Probe 的摩尔比为 2 : 2 : I。
3.如权利要求I所述的核酸检测试剂盒，其特征在于Actin-F: Actin-R :Actin-Probe 的摩尔比为 2 : 2 : I。
4.如权利要求I所述的核酸检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为含有ERCCl基因组的溶液；所述阴性对照品为无ERCCl基因组的溶液。
全文摘要
本发明公开了用于检测ERCC1mRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于，检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、检测用上下游引物ERCC1-F/ERCC1-R和探针ERCC1-Probe、参照用上下游引物Actin-F/Actin-R探针Actin-Probe；其中，ERCC1-FGGGAATTTGGCGACGTAATTC；ERCC1-RGCGGAGGCTGAGGAACAG；ERCC1-ProbeFAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG-TAMRA；Actin-FTGAGCGAGGCTACAGCTT；Actin-RTCCTTGATGTCGCGCACGATTT；Actin-ProbeFAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
文档编号C12Q1/68GK102758011SQ20121018943
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者周晓犊, 徐建成, 方国伟, 王淑一 申请人:合肥艾迪康临床检验所有限公司