专利名称：罗非鱼重组口服蛋白tat-gh及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH，还涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH的制备方法，还涉及一种能表达重组口服生长素蛋白TAT-GH的基因工程菌株；还涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH在促进罗非鱼生长中的应用。
背景技术：
鱼类生长激素(growth hormone,GH)是由鱼脑垂体远端的嗜酸性细胞分泌与合成的一类单链多肽。它在鱼的生长、能量的固定、性腺的发育等方面都具有重要的调节作用，也是水产养殖中一直备受研究者关注的领域。鱼类GH的分离工作始于上世纪70年代，在80年代中后期形成热点。其最初的分·离技术类似于哺乳类GH的分离，通常将鱼的脑垂体或体外培养的分泌液在碱性条件下匀浆，经柱层析分离后，再采用等电点沉淀法得到较高浓度的GH，但此法沉淀得到的GH溶解度低，难以溶解。不少学者改进方法，采用柱层析后经离子交换层析，再用rpHP LC纯化，或是通过葡聚糖凝胶过滤和反相高效液相色谱纯化两步法得到GH。目前，国内外已有二十多种鱼GH被分离纯化出来，并对这些鱼类GH的氨基酸全序列进行了分析和鉴定，也证明了不同物种间的同源性与差异性。鱼生长激素展现了典型的GH特征，如四个半胱氨酸残基，能形成两个二硫键的能力，推测其能使GH分子形成三级结构和N糖基化位点。对于骨鳔类鱼，GH的序列包含有一组不成对的半胱氨酸残基，推测起着未知的重要功能。本发明所研究的罗非鱼(tilapia)原产于非洲，俗称非洲鲫鱼，隶属于鲈形目丽鱼赴罗非鱼属，为一种中小型鱼。罗非鱼的肉味鲜美，肉质细嫩，含有多种不饱和脂肪酸和丰富的蛋白质，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一，现在已作为世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类。其cDNA的开放阅读框为615bp，编码204个氨基酸，具有鱼类生长激素的基本结构特征从起始氨基酸M到第17位氨基酸S是信号肽部分，成熟肽是187个氨基酸。成熟肽中有4个半胱氨酸，位置非常保守，它们在成熟肽中形成两个二硫键(C69与C177位、C194与C202位)，构成特征性的一个大环和一个小环。在第201位上有一个N-糖基化位点，这个糖基化位点是蛋白转导入膜的信号，也是硬骨鱼GH的特征之利用基因工程菌表达鱼类生长激素是目前大量生产鱼生长激素的主要途径。目前已有多种鱼类GH在大肠杆菌中表达，但由于表达产物通常需要复性处理，耗时耗材，所以不是最理想的表达系统。酵母表达系统可以避免这些缺陷，是一种比较方便和有效的表达系统。而藻类和昆虫等作为表达载体的宿主，可能会获得更高表达量或是更经济的生产鱼GH的途径。细胞生物学研究领域中有一类具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度一般小于20个氨基酸，被命名为细胞穿膜肽或蛋白转导域(PTD)。如人类免疫缺陷病毒(HIV)后期转录的调控子蛋白TAT即为PTD的一种。按照结构和功能的不同可以将TAT蛋白划分为5个区域①酸性N-末端区(1-20位);②半胱氨酸Cys富积区(21 - 39位)，含7个Cys，在HIV的各亚型属于中高度保守核心区(40-47位)，含RKGLGI氨基酸序列基本区(48-72位)，含RKKRRQRRR氨基酸序列，且具有TAR RNA结合活性；⑤细胞黏附的C-末端区(73-86位)，含RGD氨基酸序列，TAT可通过RGD与细胞整合素结合。通过对TAT的序列进一步的研究已确定其第48-57位(RKKRRQRRR)碱性肽段是保持其穿膜活性的最小片段。穿膜肽TAT可以携带多种物质，大至亲水性蛋白和多肽，小到DNA甚至颗粒性物质等，都能高效而快速地进行细胞间或细胞内的传输，且对细胞无毒副作用。TAT蛋白介导的细胞内转运过程存在多种机制。最初推测是非受体、非转运蛋白介导的和非内吞机制，但最终证实其入胞过程是能量依赖的，且需要细胞表面的蛋白多糖的作用。有研究证明，TAT介导的多种物质的入胞机制与其所携带的分子大小密切相关。当TAT连接的是大分子或颗粒性物质时，遵循的是一种能量依赖的内吞途径，然后从核内体中释放出来进入胞浆；而单独的TAT多肽(49-57位)或仅连有小分子的TAT (49-57位)入胞过程则是通过与细胞表面发生静电作用或氢键连接而完成的，该过程是非能量依赖的。总之，TAT穿膜的具体机制还有待研究。
尽管TAT的穿膜机制还不太明了，但以其为代表的系列穿膜肽已经广泛应用于生物和医药学领域，大大推进了分子生物学、细胞生物学、药学、免疫学等的发展。
发明内容
本发明的主要目的是提供了一种TAT-GH融合蛋白，其序列为SEQ ID NO. 2所示。本发明首次将穿膜肽TAT与鱼生长激素(growth hormone, GH)融合表达,获得的融合蛋白可以顺利穿过肠膜细胞，进入血清中直接发挥其促生长作用。本发明的另一个目的在于提供了一种TAT-GH融合蛋白的制备方法，通过PCR重叠延伸技术，以GH基因为模板，采用PCR重叠延伸技术在GH序列的前端分步PCR依次加上长度为33个碱基的TAT序列，PCR扩增得到TAT-GH基因。通过双酶切重组质粒pGEM_T-TAT_GH和质粒pET-32a，连接得到重组质粒pET-32a-TAT-GH，转化E. coli DH5a,得到Escherichiacoli DH5a pET-32a_TAT_GH。将质粒 pET-32a_TAT_GH 转化到表达菌株 Escherichia coliBL21 (DE3)，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株，将该菌株转接到2XYT培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达。本发明的另一个目的是提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠杆菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-tmGH, F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3),CCTCC NO :M2012148。该菌株可以表达穿膜肽TAT和罗非鱼生长激素(growth hormone)的基因工程融合蛋白TAT-GH，使其能顺利穿过细胞膜进入胞内产生作用，该菌株能大量表达TAT-GH蛋白，且操作简便快捷，可更好的应用于工业化生产中，为制备口服促生长制品提供良好的基础。本发明还有一个目的是提供了一种TAT-GH表达蛋白在促进罗非鱼生长中的应用，通过选取大小不同的幼鱼，用一定剂量的融合蛋白分别以不同时间间隔对其口服喂食，观察其促生长效果的差异性，可得出最优化的饲养方式。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
从雄性罗非鱼脑垂体内提取总RNA，以Oligo (dT) 20为引物合成cDNA第一条链。根据Genbank上已经登录的GH序列设计引物，运用RT-PCR方法扩增罗非鱼GH cDNA序列，与运用搭桥法扩增得到的TAT-GH基因分别克隆到表达载体pET32a (+)上，转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中，经菌落PCR和双酶切鉴定得到阳性重组菌，IPTG诱导表达。将纯化的GH和TAT-GH蛋白通过酶联免疫吸附受体测定法(ELISA-RA法)测定其生物学活性，并口服喂食罗非鱼，一段时间后抽取鱼的血清用间接ELISA法检测鱼体内GH含量，证明TAT多肽穿膜活性。蛋白口服喂食罗非鱼苗，检测促生长作用。一种TAT-GH融合蛋白的制备方法，其步骤是A.罗非鱼生长激素基因的制备取已处死的新鲜雄性罗非鱼脑垂体，液氮研磨，Trizol法提取鱼基因组的总mRNA后，以Oligo (dT)20为引物通过RT-PCR得到cDNA，查询GeneBank中已经录入的莫桑比克罗非鱼生长激素GH的核苷酸序列(GenBank:AF033805. I),同时设计GH的PCR上下游引物，扩增得到GH基因。最后克隆到pGEM-T载体(由Promega公司购得)中，转化大肠杆菌JM109 (由Novagen公司购得,本实验室保种)，得到菌株pGEM-T-GH/E. coli JM109，用于基因的增殖和保藏。B. TAT-GH融合基因的制备以步骤A制备得到的GH基因为模板，采用PCR重叠延伸技术在GH序列的前端分步PCR依次加上长度为33个碱基的TAT序列，PCR扩增得到TAT-GH基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。最后克隆到pGEM_T载体中，得到重组载体 pGEM-T-TAT-GH，转化大肠杆菌 JM109，得到菌株 pGEM-T_TAT_GH/E. coli JM109，用于基因的增殖和保藏。C.融合基因表达载体的构建双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-GH和质粒pET_32a(由Novagen公司购得，实验室保种)，胶回收，T4连接酶进行连接，得到重组质粒pET-32a-TAT-GH，转化E. coli DH5a(由Novagen公司购得，实验室保种)，涂布含有100 u g/HilAmp+的LB平板，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是TAT-GH融合基因的大肠杆菌，命名为Escherichia coli DH5a pET-32a_TAT_GH，作为载体的增值和保藏。D.大肠杆菌基因工程菌的制备将质粒pET-32a-TAT_GH转化到表达菌株Escherichia coli BL21 (DE3)(由Novagen公司购得，实验室保种)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3) pET-32a-TAT_tmGH，申请人于 2012 年 4 月 26 日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址中国武汉武汉大学，分类命名大肠杆菌 BL21 (DE3) pET-32a-TAT-tmGH, F^ompT hsdSB (rB_mB_) gal dcm(DE3)，Escherichia coliBL21 (DE3)pET-32a-TAT-tmGH，rompT hsdSBgal dcm (DE3)，CCTCC NO :M2012148。通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-32a-TAT-tmGH,它具有如下特征(I)显微镜下观察，大小1_3微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢，为革兰氏阴性短杆菌。(2)在普通的LB平板中培养，其菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起。(3)兼性厌氧性菌，最适生长温度为37°C，可用IPTG或乳糖自动诱导表达，代谢旺盛，诱导表达4-6h即可达蛋白最大表达量。
E.基因工程融合蛋白的制备将上述基因工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)pET-32a-TAT-tmGH转接到2乂￥!'培养基中(该培养基配方IL : 16g蛋白胨、IOg酵母抽提物、8gNaCl)，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达，其氨基酸序列为SEQ IDNO. 2所示。一种TAT-GH融合蛋白促进罗非鱼生长中的应用，其应用过程是A.将大肠杆菌基因工程菌株发酵所得目的蛋白纯化，得到GH和TAT-GH蛋白。通过酶联免疫吸附受体测定法(ELISA-RA法)测定其生物学活性，检测能否与罗非鱼肝膜和肠膜发生较为强烈的特异性反应。B.将纯化的GH和TAT-GH 口服喂食罗非鱼，一段时间后抽取鱼的血清用间接ELISA法检测鱼体内GH含量，检测TAT多肽能否携带GH蛋白穿过鱼肠壁，进入血液而得到利用。C.进行促生长实验，即将有活性的GH蛋白和TAT-GH蛋白与等量PBS分别喂食大小规格相同的罗非鱼苗，喂食周期为40天。40天后测其平均体重和体长，研究其促生长效果。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果A.首次将穿膜肽TAT与鱼生长激素GH融合表达，获得融合蛋白可以顺利穿过肠膜细胞，进入血清中直接发挥其促生长作用。B.通过对鱼脑垂体的RNA提取，得到完整的总RNA和cDNA序列，保证了基因来源的准确性与完整性，与基因合成相比，更加的经济快捷。C.选取了大肠杆菌作为表达系统，其操作简单，生长周期短，产量高，成本低，适用于大规模的工业化生产中。
图I为一种罗非鱼脑垂体总RNA的提取示意图。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，由大到小依次是28S、18S、5S。图2为一种TAT-GH的PCR扩增示意图。通过PCR重叠延伸技术分3次PCR扩增TAT-GH基因，在GH序列的前端加上TAT序列。扩增产物在1%琼脂糖胶上显示其大小与预期值648bp相符。I DNA Marker (DL2000) 2 :扩增的 TAT-GH 基因(648bp)图3为一种TAT-GH的双酶切鉴定示意图。进行EocRI/BamHI双酶切鉴定，检测到与预期大小相符的片段。I:DNA Marker (DL2000) 2:EocRI/BamHI 双酶切结果(5900bp 和 648bp)图4为一种扩增重组质粒pGEM-T-TAT-GH的构建过程示意图。同时用EocRI/BamHI双酶切质粒载体pGEM_T和TAT-GH，再用T4连接酶连接，得到新的重组质粒pGEM-T-TAT-GH。图5为一种表达重组质粒pET-32a-TAT_GH的构建图示意图。用EocRI/BamHI双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-GH和表达质粒pET_32a，得到的片段TAT-GH与缺口质粒pET-32a连接，获得新的表达重组质粒pET_32a-TAT_GH。图6为一种重组蛋白GH和TAT-GH经IPTG诱导表达示意图。将基因工程表达菌株Escherichiacoli BL21(DE3)pET-32a_tmGH和Escherichiacoli BL21 (DE3) pET-32a-TAT_tmGH，用终浓度 0. 6M 的 IPTG 于 37°C恒温、300rpm 诱导表达5h。收集发酵液离心后的菌体沉淀，经超声波破碎后，收集破碎上清和沉淀。用12%的SDS-PAGE电泳检测，发现在沉淀中有与预期大小40kDa和41. 5kDa相符合的目的蛋白带且大部分以包涵体形式存在，并且表达量较高。I :蛋白Marker ；2 :未诱导的pET32a (BL21)破碎液沉淀；3 :未诱导的pET32a_GH(BL21)破碎液沉淀；4 :未诱导的pET32a-TAT-GH (BL21)破碎液沉淀；5 :未诱导的pET32a (BL21)破碎液上清；6 :未诱导的pET32a_GH (BL21)破碎液上清；7 :未诱导的pET32a-TAT-GH (BL21)破碎液上清；8 :蛋白 Marker ;9: IPTG 诱导的 pET32a (BL21)破碎液上清;10:IPTG 诱导的 pET32a-GH (BL21)破碎液上清;11: IPTG 诱导的 pET32a_TAT_GH(BL21)破碎液上清；12: IPTG诱导的pET32a(BL21)破碎液沉淀；13: IPTG诱导的pET32a_GH(BL21)破碎液沉淀；14: IPTG诱导的pET32a-TAT-GH (BL21)破碎液沉淀。图7为一种纯化的GH和TAT-GH示意图。发酵液离心得到的菌体，超声破碎后用2M尿素洗涤并4°C裂解过夜，进行镍柱纯 化，用含有低浓度咪唑的Wash Buffer将镍柱中的非目的蛋白洗掉。最后用含有高浓度咪唑的Elution Buffer将目的蛋白洗脱下来。4°C复性过夜，透析后，获得有活性的TAT-GH和GH蛋白，进行SDS-PAGE电泳检测。图8为一种Western Blot鉴定不意图。蛋白样品经SDS-PAGE分离后，转移到固相载体NC膜上，使蛋白样品与NC膜结合。封闭NC膜上未与蛋白样品结合的其他位点后，依次加入纯化的兔抗GH血清(一抗)及HRP标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)进行免疫反应，最后经DAB显色，将表达的目的蛋白条带显出。图9为一种罗非鱼肝膜受体与TAT-GH结合活性示意图。ELISA-RA结果表明了罗非鱼肝膜受体和表达的重组生长激素TAT-GH可以发生特异性结合。当肝膜受体浓度一定时(200ug/ml)，随着重组TAT-GH浓度的提高，光密度值会相应升高；将高温失活TAT-GH和活性肝膜受体结合时，光密度值有显著下降；将TAT-GH和肝膜受体同时失活，光密度值进一步降低。图10为一种罗非鱼肠膜受体与TAT-GH结合活性示意图。罗非鱼TAT-GH能够与鱼肠膜受体发生特异性结合。当肠膜受体浓度一定时(200ug/ml),随着TAT-GH浓度的提高，光密度值会相应升高；将高温失活的TAT-GH蛋白和活性肠膜受体结合时，光密度值有显著下降；将TAT-GH蛋白和肠膜受体同时失活时，光密度值进一步降低。图11为一种罗非鱼血清的ELISA检测示意图。与GH组和PBS对照组相比，TAT-GH组的OD49tl值有显著地的升高，即在血清中检测到TAT-GH蛋白的存在。而GH蛋白由于不能穿过肠壁细胞而未能到达血清中，几乎未在血清中检测到。另外，在喂食蛋白6-12h之间，TAT-GH在血清中的含量有所升高，但在12h-24h开始下降，说明TAT-GH在口服12h后开始在肠内降解。
具体实施例方式实施例I :罗非鱼TAT-GH生长激素基因的制备方法，其步骤是(I) Trizol法提取罗非鱼的总RNA
将处死的罗非鱼的脑垂体组织直接放入研体中，加入适量(体积约为垂体组织的3-5倍)液氮研磨。按50 100mg/mL加入Trizol，用匀浆器充分匀浆约1_2分钟。室温(20-25 0C，以下相同)放置5min，使其充分裂解。12000rpm离心lOmin，取上清。按200 y L氯仿/mL Trizol加入氯仿,振荡5分钟,室温放置5min。4°C 12000g离心15min,吸取上层水相于另一离心管中，加入等倍体积异丙醇混匀，室温放置20 30min。4°C 12000g离心lOmin，弃上清，RNA沉于管底。按加入ImL 75% (体积比，以下相同)乙醇洗涤两次。4°C 5000g离心5min，尽量弃上清。室温晾干2 3min，用50 y L经DEPC处理H2O溶解RNA样品。提取的RNA溶解在无RNase的无菌水中，用DNase(RNase-Free)于37°C消化30min以除去DNA的污染。DNase消化完毕进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图I。(2) cDNA第一链的合成按照ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒(购自T0Y0B0公司)说明书，以
Oligo(ClT)20为引物合成cDNA第一链。反应体系如下，依次将以下试剂加入经DEPC水处理并灭菌过的PCR管中
Total20|il
5xRT Buffer4 ill
En/ymc MixI \xl
01igo(dT)2o PrimerI \xl
Total RNA8 \xl
NucIcasc-frcc H2O6 |il反应参数为
(5min
37 °C15 min
95 °C5 min(3) GH基因的扩增将反应后的产物储存于-20°C以作为目的基因克隆的模板。查询GeneBank中已经录入的莫桑比克罗非鱼生长激素GH的核酸序列(GenBank:AF033805. 1)，同时设计GH的PCR上下游引物。由于本实验选取pET_32a ( + )质粒(由Novagen公司购得，实验室保种)作为载体，根据其上的多克隆位点及GH的基因序列，分别选取BamHl和EcoRl作为酶切位点。GH 的上游引物 Pl 5，-CGGGATCCATGAACTCAGTCGTCCTCCA-3，(划线处为 BamH I 位点)，即为 SEQ ID NO. 3 ；GH 的下游引物 P2 5，-CGGAATTCCTACAGAGTGCAGTTTGCCTC-3，(划线处为EcoR I位点)JPSSEQ id no. 4 ;以罗非鱼gh基因为模板，按照以下反应体系和条件进行PCR扩增。
权利要求
1.一种分离重组的基因，其特征在于，其序列为SEQ ID N0:1所示。
2.一种分离重组的融合蛋白，其特征在于，其序列为SEQ ID N0:2所示。
3.—种表达权利要求2所述融合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于大肠杆菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-tmGH, WompT hsdSB (rBmB) galdcm (DE3) ； CCTCC NO :M2012148。
4.权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其步骤为 A.罗非鱼生长激素基因的制备取已处死的新鲜雄性罗非鱼脑垂体，液氮研磨，Trizol法提取GH的总mRNA后，以Oligo (dT)20为引物通过RT-PCR得到cDNA，同时设计GH的PCR上下游引物，扩增得到GH基因；最后克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，用于基因的增殖和保藏；GH 的上游引物 Pl :5’ -CGGGATCCATGAACTCAGTCGTCCTCCA-3’ ；GH 的下游引物 P2 :5’ -CGGAAITCCTACAGAGTGCAGITTGCCTC-3’ ； B.TAT-GH融合基因的制备以GH基因为模板，采用PCR重叠延伸技术在GH序列的前端分步PCR依次加上长度为33个碱基的TAT序列，PCR扩增得到TAT-GH基因；最后克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，用于基因的增殖和保藏； C.融合基因表达载体的构建双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-GH和质粒pET-32a，胶回收，T4连接酶进行连接，转化疋co7iDH5a,涂布含有100 u g/mlAmp+的LB平板，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是含TAT-GH融合基因的大肠杆菌； D.大肠杆菌基因工程菌的制备将质粒pET-32a-TAT-GH转化到表达菌株BL21(DE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株； E.基因工程融合蛋白的制备将步骤D中获得的基因工程菌转接到2X YT培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达。
5.权利要求2所述的TAT-GH融合蛋白在罗非鱼促生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种罗非鱼重组口服蛋白TAT-GH及制备方法和应用。从雄性罗非鱼的脑垂体中提取总mRNA，通过RT-PCR得到cDNA，再通过PCR扩增获得罗非鱼生长激素GH的基因，PCR重叠延伸的方法扩增TAT-GH基因；构建重组质粒pET-32a(+)-TAT-GH。将重组质粒pET-32a(+)-TAT-GH转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式得到高效表达，再通过纯化复性得到活性蛋白，喂食罗非鱼幼苗后能有效地促进其生长发育。
文档编号C12N1/21GK102703483SQ20121018910
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者孟小林, 徐进平, 曾辉, 王健 申请人:武汉凯肽来生物科技有限公司