专利名称：一种产色葡萄球菌gap基因序列及其引物的获取方法
技术领域：
本发明涉及一种基因序列，具体涉及一种产色葡萄球菌gap基因序列及其引物的获取方法，属生物检测技术领域。
背景技术：
葡萄球菌广泛分布于自然界及人体与动物皮肤黏膜表面，是最常见的化脓性球菌，常引起各种化脓性感染、败血症和泌尿道感染等，是医院感染和社区获得性感染的重要病原菌之一。葡萄球菌属至少包含39个已知种，其中11种又可以分为两个或更多的亚种，目前发现的种类已超过了 50种。葡萄球菌属的细菌是一类球形菌，革兰氏染色反应呈阳性。关于葡萄球菌引起鱼类疾病未见报道，许多报道发现葡萄球菌属的细菌为一些鱼类 肠道细菌的优势菌群。赵庆新发现团头鲂肠道菌群中有葡萄球菌属细菌的存在，有研究发现草鱼肠道中的优势菌群为葡萄球菌属细菌；孙云章等报道稚鱼消化道的优势菌有葡萄球菌等。鱼肠道正常菌群是肠道的重要组成部分，对鱼本身没有致病性，但对其他生物有可能有致病性。由于葡萄球菌有极高的相似性(90% 99%)，用16S rDNA不能将其在种的水平上准确鉴定，以往人们使用hsp60, sodA, rpoB, tuf等保守基因对葡萄球菌进行种间判定。葡萄球菌gap基因编码甘油醒-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase),是一种管家基因,研究表明，该基因至少可以在12株葡萄球菌亚种检测至IJ。Yugueros等人采用杂交的方法，用279bpDNA片段检测在所有PCR-gap阳性基因，结果均呈阳性；应用该引物扩增其他菌种，结果都没有出现目的条带。产色葡萄球菌是一类不运动，不产生孢子的革兰氏阳性菌，在环境中广泛存在，并且表现出很强的适应性与异质性，是人与动物的机会致病菌，与猪的渗出性皮炎、脓毒性多关节炎及奶牛的乳腺炎有关。迄今为止，针对淡水鱼类及其水产品中产色葡萄球菌的快速检测方法，国内外尚未见文献报道和发明专利
发明内容
本发明的目的是为了能快速检测淡水鱼类肠道及其水产品中的产色葡萄球菌，提供一种产色葡萄球菌gap基因序列及其引物的获取方法，从已知序列基因的保守序列引物来对gap基因进行PCR检测的方法。主要内容为采取平板划线和稀释涂布相结合的方法对淡水鱼肠道细菌在甘露醇高盐琼脂(MSA)培养基上进行分离筛选，获得I株菌株，通过专用培养基培养后进行形态学观察、生理生化特征和基因序列分子鉴定等系统研究，确定该菌株为产色葡萄球菌；通过培养提取该株菌的基因组DNA后，根据该保守序列进行BLAST核苷酸序列比对，参照葡萄球菌属保守序列设计的用于扩增gap基因片段的特异性，利用引物设计软件primer5. 0设计引物；将设计好的引物送交公司合成，利用PCR技术扩增产色葡萄球菌的基因组gap序列，筛选的这对引物获得了用于检测该菌PCR扩增片段大小为931bp的引物，引物序列为正向 gap-F (5 ’ -3 ’) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R(5’ -3’) GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG。本发明是以如下技术方案实现的一种产色葡萄球菌gap基因序列的获取方法，其特征是采取平板划线和稀释涂布相结合的方法对淡水鱼肠道细菌在甘露醇高盐琼脂(MSA)培养基上进行分离筛选，获得I株菌株，通过形态学观察、生理生化特征和基因序列分子鉴定等系统研究，确定该菌株为产色葡萄球菌。一种产色葡萄球菌gap基因序列的PCR特异引物设计方法，其特征是通过BLAST核苷酸序列比对，找到该物种需要检测的目的基因的保守序列；根据该保守序列，设计用于扩增gap基因片段的特异性引物，用引物设计软件primerf.O设计引物；将引物再通过核苷酸序列比对，确保引物3’端的高度保守性；具体步骤如下 (1)产色葡萄球菌的引物筛选将设计好的引物送交生工生物工程(上海)有限公司合成，对获得的引物利用PCR技术扩增产色葡萄球菌的基因组DNA，检测各对引物是否可用，即能否扩增出清晰、单一、有规则的条带，在筛选的这些引物中，获得了用于检测该菌PCR扩增片段大小为931bp的引物，gap基因编码氨基酸序列310aa，引物序列为正向 gap-F (5，-3，) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R (5，-3，):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ；
(2)产色葡萄球菌的PCR扩增条件优化对获得的该属分离菌株的gap基因专用引物进行PCR条件优化，获得最佳的PCR扩增体系和扩增条件如下最佳的PCR扩增体系为25 yl，包含 2. 5 ii I IOX Reaction Buffer (with Mg2+) ,0. 5u I dNTP (包括 dATP、dITP、dCTP、dGTP，各2. 5mM)，正反向引物(10剛)各0. 5iU，Taq酶0. 3 yl，提取的细菌基因组DNA模板
2.OiU，用灭菌双蒸水ddH20 17. 2 u I补足25iU总体积；最佳的PCR反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，52°C退火50s，72°C延伸45s，30个循环后72°C再次延伸IOmin,PCR产物4°C保存备用；
(3)产色葡萄球菌的分子测序鉴定采用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切下目的带，胶回收试剂盒回收，回收产物克隆后，挑选阳性克隆送上海生工测序；测序后利用BLAST和ClustalX程序进行序列比对分析,并用Neighbor-joining方法构建系统发育树表明该菌株与产色葡萄球菌(Ste/成cAroffiogefles)模式菌株(CCM 3387)同源性为98. 82%，由此鉴定该菌为产色葡萄球菌。本发明通过PCR扩增技术筛选出葡萄球菌属的专用引物，建立一个适合于检测淡水鱼源产色葡萄球菌分子检测技术，更具有如下优点
I、成本底，实验操作安全、可靠。该菌株是采取平板划线和稀释涂布相结合的方法从淡水鱼肠道细菌分离筛选，并通过专用培养基培养后获得，在一般的微生物实验室都可以进行；对菌株进行分子鉴定时，采用普通PCR方法，使用常规的试剂和仪器，不需要探针和构建基因文库，所以避免使用同位素污染。2、技术简单可行。本发明充分利用生物信息学提供的已有信息，通过BLAST核苷酸序列比对，找到该物种需要检测的目的基因的保守序列；根据该保守序列，设计用于扩增gap基因片段的特异性引物，用引物设计软件primerf.O设计引物；将引物再通过核苷酸序列比对，确保引物3’端的高度保守性。3、快速、准确、可靠。与传统检测方法相比，避免了与基因组进行大规模测序，节省了大量的时间和财力，只要找到基因的保守序列，就可以对任何物种的该基因进行跨物种PCR检测；同时本发明引物特异性强，使得扩增特异性和效率大大增强。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。图I为本发明gap基因PCR产物电泳图片。图I 中M 为 DL-2000 DNA marker, gap 片段长度为 931bp。
具体实施例方式本发明可以通过以下几个操作步骤实现
I、产色葡萄球菌的分离培养
将淡水鱼体表用75%的酒精消毒，无菌操作取其肠道中部，置于盛有IOmL的无菌生理盐水的离心管中，剪碎混匀，取适量均匀涂布于甘露醇高盐琼脂培养基上，保持培养基内的温度为恒温37°C，培养18-24h ;挑选典型菌落转种到新的甘露醇高盐琼脂培养基平皿上，反复传代2-3次，筛选出目的菌接种到斜面备用；菌落在平皿上生长成为形态单一的菌落，菌落特征表现为圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的菌落，显微镜形态观察该菌呈现葡萄串状球菌；所述的甘露醇高盐琼脂培养基的成分及制备方法为(g/L):蛋白胨10.0，牛肉粉1.0，D-甘露醇10.0，氯化钠100. 0，酚红0.025，琼脂13.0，pH值7.4±0.2 ;制备时称取本品109. Og,加入IOOOml蒸懼水中，121°C高压灭菌15 min,冷至45-50°C左右时，倾入无菌平皿。2、产色葡萄球菌的生理生化鉴定
对已培养好的该菌株进行4项生理生化特性鉴定后，表明该菌株氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，不能运动，硝酸盐还原阳性，查阅《伯杰氏系统细菌学手册》，该菌株的形态学特征和各项生理生化检测结果基本符合葡萄球菌属特性,初步确定为葡萄球菌属。一种产色葡萄球菌gap基因序列的PCR特异引物设计方法，其特征是通过BLAST核苷酸序列比对，找到该物种需要检测的目的基因的保守序列；根据该保守序列，设计用于扩增gap基因片段的特异性引物，用引物设计软件primerf.O设计引物；将引物再通过核苷酸序列比对，确保引物3’端的高度保守性；具体步骤如下
(1)产色葡萄球菌的引物筛选将设计好的引物送交生工生物工程(上海)有限公司合成，对获得的引物利用PCR技术扩增产色葡萄球菌的基因组DNA，检测各对引物是否可用，即能否扩增出清晰、单一、有规则的条带，在筛选的这些引物中，获得了用于检测该菌PCR扩增片段大小为931bp的引物，gap基因推测编码氨基酸序列310aa，引物序列为正向 gap-F (5，-3，) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R (5，-3，):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ；
(2)产色葡萄球菌的PCR扩增条件优化对获得的该属分离菌株的gap基因专用引物进行PCR条件优化，获得最佳的PCR扩增体系和扩增条件如下最佳的PCR扩增体系为25 yl，包含 2. 5 ii I IOXReaction Buffer (with Mg2+), 0. 5 u I dNTP (包括 dATP、dITP、dCTP、dGTP，各2. 5mM )，正反向引物(10剛)各0. 5 yl，Taq酶0. 3 yl，提取的细菌基因组DNA模板 2.OiU，用灭菌双蒸水ddH20 17. 2 u I补足25iU总体积；最佳的PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火50s，72°C延伸45s，30个循环后72°C再次延伸IOmin,PCR产物4°C保存备用；
(3)产色葡萄球菌的分子测序鉴定采用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切下目 的带，胶回收试剂盒回收，回收产物克隆后，挑选阳性克隆送上海生工测序；测序后利用BLAST和ClustalX程序进行序列比对分析,并用Neighbor-joining方法构建系统发育树表明该菌株与产色葡萄球菌(5模式菌株(CCM 3387)同源性为98. 82%，由此鉴
定该菌为产色葡萄球菌。
权利要求
1.一种产色葡萄球菌gap基因序列的获取方法，其特征是采取平板划线和稀释涂布相结合的方法对淡水鱼肠道细菌在甘露醇高盐琼脂(MSA)培养基上进行分离筛选，获得I株菌株，通过形态学观察、生理生化特征和基因序列分子鉴定等系统研究，确定该菌株为产色葡萄球菌。
2.—种产色葡萄球菌gap基因序列的PCR特异引物设计方法，其特征是通过BLAST核苷酸序列比对，找到该物种需要检测的目的基因的保守序列；根据该保守序列，设计用于扩增gap基因片段的特异性引物，用引物设计软件primerf. O设计引物；将引物再通过核苷酸序列比对，确保引物3’端的高度保守性；具体步骤如下 (1)产色葡萄球菌的引物筛选将设计好的引物送交生工生物工程(上海)有限公司合成，对获得的引物利用PCR技术扩增产色葡萄球菌的基因组DNA，检测各对引物是否可用，即能否扩增出清晰、单一、有规则的条带，在筛选的这些引物中，获得了用于检测该菌PCR扩增片段大小为931bp的引物，gap基因编码氨基酸序列310aa，引物序列为正向 gap-F (5，-3，) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R (5，-3，):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ； (2)产色葡萄球菌的PCR扩增条件优化对获得的该属分离菌株的gap基因专用引物进行PCR条件优化，获得最佳的PCR扩增体系和扩增条件如下最佳的PCR扩增体系为25 yl，包含 2. 5 ii I IOX Reaction Buffer (with Mg2+) ,0. 5u I dNTP (包括 dATP、dITP、dCTP、dGTP，各2. 5禮)，正反向引物(10剛)各0.5111，1&9酶0. 3 yl，提取的细菌基因组DNA模板2. OiU，用灭菌双蒸水ddH20 17. 2 u I补足25iU总体积；最佳的PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火50s，72°C延伸45s，30个循环后72°C再次延伸IOmin,PCR产物4°C保存备用； (3)产色葡萄球菌的分子测序鉴定采用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切下目的带，胶回收试剂盒回收，回收产物克隆后，挑选阳性克隆送上海生工测序；测序后利用BLAST和ClustalX程序进行序列比对分析,并用Neighbor-joining方法构建系统发育树表明该菌株与产色葡萄球菌(Ste/成cAroffiogefles)模式菌株(CCM 3387)同源性为·98. 82%，由此鉴定该菌为产色葡萄球菌。
全文摘要
本发明涉及一种基因序列，具体涉及一种产色葡萄球菌gap基因序列及其引物的获取方法，它采取平板划线和稀释涂布相结合的方法对淡水鱼肠道细菌在甘露醇高盐琼脂(MSA)培养基上进行分离筛选，获得1株菌株，通过专用培养基培养后进行形态学观察、生理生化特征和基因序列分子鉴定等系统研究，确定该菌株为产色葡萄球菌；通过培养提取该株菌的基因组DNA后，根据该保守序列进行BLAST核苷酸序列比对，参照葡萄球菌属保守序列设计的用于扩增gap基因片段的特异性，利用PCR技术扩增产色葡萄球菌的基因组gap序列，筛选的这对引物获得了用于检测该菌PCR扩增片段大小为931bp的引物，引物序列为正向gap-F(5’-3’):ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向gap-R(5’-3’):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG。
文档编号C12R1/44GK102703592SQ20121018826
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月9日 优先权日2012年6月9日
发明者吕爱军, 王艺, 胡秀彩 申请人:江苏师范大学