基于kasp技术检测小麦功能基因的成套引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于KASP技术检测小麦功能基因的成套 引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，基于DNA序列多态性的分子标记受到国内外育种家的高度重视。利用与 目标性状紧密连锁的分子标记进行选择，不受环境影响，选择结果可靠，而且在聚合有利性 状时，可以在回交渗透过程中通过遗传背景选择，减少连锁累赘，加速育种进程。因此，通过 现代分子生物学手段开发控制小麦重要性状的分子标记，对我国小麦育种具有重要意义。
[0003] 迄今为止，小麦遗传育种中常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、STS、CAPS、DArT、SCAR和SNP。随着小麦基因的克隆，基于小麦功能基因开发的功能标记也逐渐得到应 用。在小麦中，几十个重要性状的基因已经克隆，其相应的功能标记为育种家向新品种导入 有利基因提供了方便，通过目标选择，并结合感兴趣性状的功能基因的有利等位变异，提尚 了选择效率，缩短了育种年限。Zhang等（2014)根据控制水稻籽粒大小的基因0sGS3同源 克隆了小麦TaGS-Dl基因，并据此开发了功能标记GS7D，经连锁分析发现与小麦千粒重有 显著的相关性，应用于筛选千粒重较高的品种。Jiang等（2015)克隆了 0sGIF(0sCWI2)在 小麦中的同源基因TaCWI-4A，开发了caps4A标记，用于选择千粒重较高和穗粒数较多的品 种。He等（2009)和Wang等（2009)分别开发了黄色素合成途径中八氢番茄红素合成酶基 因Psy-Bl的功能标记YP7B-1、YP7B-2、YP7B-3 和Psyl-Dl的功能标记YP7D-1、YP7D-2,与 小麦籽粒中的黄色素含量显著相关，可以通过检测该酶的等位基因型筛选黄色素含量较高 (=类胡萝卜素含量较高）、营养价值较好的品种，省去了做成品的步骤，方便了育种家选 择优质品种。所以，利用功能标记检测不同小麦品种功能基因的等位基因型，给育种家辅助 选择品种提供了很大帮助。
[0004] 尽管这些功能标记在小麦功能基因检测方面已得到部分应用，但操作过程繁琐复 杂，需要酶切、电泳，检测效率低。在育种过程中育种家筛选大量后代材料，需要较高成本和 较长时间，此方法难以满足生产需要。因此，建立一种快速、高效、便捷检测不同小麦品种功 能基因的方法非常必要。
[0005] KASP技术（即竞争性等位基因特异性PCR)是目前国际上主流的基因分型方法之 一，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP和特定位点上的InDel进行精准的双等位基因 判断。引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3'端为等位变异碱基，5'端添加通 用荧光接头序列，下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。该技术准确 率高，灵活性超强，无需昂贵的双色标记探针，最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增，快 速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种用于检测小麦功能基因的成套KASP引物。
[0007] 本发明提供了一种用于检测小麦功能基因的成套KASP引物，其中所述小麦功 能基因为Pp〇-Dl基因、TaPod-Al基因、TaCKX6-Dl基因、TaCWl-4A基因、TaGS-Dl基因、 TaGASR7-Al基因、1-FEHw3 基因、Pinb2-v2 基因、Psy-Bl基因、Psyl-Dl基因、TaZds-Al基 因、Talyce-Bl基因、TaPds-Bl基因、Glu-Bl基因，所述成套KASP引物具体由如下（1) - (14) 组成：
[0008] (1)特异于所述Ppo-Dl基因的KASP引物：引物1、引物2和引物3;所述引物1为 自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列1的第22-41位的单链DNA;所述引物2 为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列2的第22-41位的单链DNA;所述引 物3为核苷酸序列如序列表中序列3所示的单链DNA;
[0009] (2)特异于所述TaPod-Al基因的KASP引物：引物4、引物5和引物6;所述引物4 为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列4的第22-42位的单链DNA;所述引 物5为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列5的第22-42位的单链DNA;所 述引物6为核苷酸序列如序列表中序列6所示的单链DNA;
[0010] ⑶特异于所述TaCKX6-Dl基因的KASP引物：引物7、引物8和引物9 ;所述引物 7为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列7的第22-44位的单链DNA;所述引 物8为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列8的第22-39位的单链DNA;所 述引物9为核苷酸序列如序列表中序列9所示的单链DNA;
[0011] ⑷特异于所述TaCWl-4A基因的KASP引物：引物10、引物11和引物12 ;所述引 物10为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列10的第22-53位的单链DNA; 所述引物11为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列11的第22-53位的单链 DNA;所述引物12为核苷酸序列如序列表中序列12所示的单链DNA;
[0012](5)特异于所述TaGS-D1基因的KASP引物：引物13、引物14和引物15 ;所述引物 13为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列13的第22-42位的单链DNA;所述 引物14为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列14的第22-42位的单链DNA; 所述引物15为核苷酸序列如序列表中序列15所示的单链DNA;
[0013] (6)特异于所述TaGASR7-Al基因的KASP引物：引物16、引物17和引物18;所述 引物16为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列16的第22-41位的单链DNA; 所述引物17为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列17的第22-41位的单链 DNA;所述引物18为核苷酸序列如序列表中序列18所示的单链DNA;
[0014] (7)特异于所述1-FEHw3基因的KASP引物：引物19、引物20和引物21;所述引 物19为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列19的第22-41位的单链DNA; 所述引物20为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列20的第22-41位的单链 DNA;所述引物21为核苷酸序列如序列表中序列21所示的单链DNA;
[0015] (8)特异于所述Pinb2-v2基因的KASP引物：引物22、引物23和引物24;所述引 物22为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列22的第22-46位的单链DNA; 所述引物23为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列23的第22-48位的单链 DNA;所述引物24为核苷酸序列如序列表中序列24所示的单链DNA;
[0016] (9)特异于所述Psy-Bl基因的KASP引物：引物25、引物26和引物27;所述引物 25为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列25的第22-41位的单链DNA;所述 引物26为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列26的第22-41位的单链DNA; 所述引物27为核苷酸序列如序列表中序列27所示的单链DNA;
[0017] (10)特异于所述Psyl-Dl基因的KASP引物：引物28、引物29和引物30 ;所述引 物28为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列28的第22-46位的单链DNA; 所述引物29为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列29的第22-47位的单链 DNA;所述引物30为核苷酸序列如序列表中序列30所示的单链DNA;
[0018] (11)特异于所述TaZds-Al基因的KASP引物：引物31、引物32和引物33 ;所述引 物31为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列31的第22-42位的单链DNA; 所述引物32为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列32的第22-42位的单链 DNA;所述引物33为核苷酸序列如序列表中序列33所示的单链DNA;
[0019] (12)特异于所述Talyce-Bl基因的KASP引物：引物34、引物35和引物36 ;所述 引物34为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列34的第22-46位的单链DNA; 所述引物35为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列35的第22-46位的单链 DNA;所述引物36为核苷酸序列如序列表中序列36所示的单链DNA;
[0020] (13)特异于所述TaPds-Bl基因的KASP引物：引物37、引物38和引物39 ;所述引 物37为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列37的第22-46位的单链DNA; 所述引物38为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列38的第22-46位的单链 DNA;所述引物39为核苷酸序列如序列表中序列39所示的单链DNA;
[0021] (14)特异于所述Glu-Bl基因的KASP引物：引物40、引物41和引物42 ;所述引物 40为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列40的第22-45位的单链DNA;所述 引物41为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列41的第22-45位的单链DNA; 所述引物42为核苷酸序列如序列表中序列42所示的单链DNA。
[0022] 进一步，所述标签序列A的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位；所述标签 序列B的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-21位。
[0023] 更加具体的，所述引物1为核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA;所述引 物2为核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA;所述引物4为核苷酸序列如序列表 中序列4所示的单链DNA;所述引物5为核苷酸序列如序列表中序列5所示的单链DNA;所 述引物7为核苷酸序列如序列表中序列7所示的单链DNA;所述引物8为核苷酸序列如序 列表中序列8所示的单链DNA;所述引物10为核苷酸序列如序列表中序列10所示的单链 DNA;所述引物11为核苷酸序列如序列表中序列11所示的单链DNA;所述引物13为核苷酸 序列如序列表中序列13所示的单链DNA;所述引物14为核苷酸序列如序列表中序列14所 示的单链DNA;所述引物16为核苷酸序列如序列表中序列16所示的单链DNA;所述引物17 为核苷酸序列如序列表中序列17所示的单链DNA;所述引物19为核苷酸序列如序列表中 序列19所示的单链DNA;所述引物20为核苷酸序列如序列表中序列20所示的单链DNA;所 述引物22为核苷酸序列如序列表中序列22所示的单链DNA;所述引物23为核苷酸序列如 序列表中序列23所示的单链DNA;所述引物25为核苷酸序列如序列表中序列25所示的单 链DNA;所述引物26为核苷酸序列如序列表中序列26所示的单链DNA;所述引物28为核苷 酸序列如序列表中序列28所示的单链DNA;所述引物29为核苷酸序列如序列表中序列29 所示的单链DNA;所述引物31为核苷酸序列如序列表中序列31所示的单链DNA;所述引物 32为核苷酸序列如序列表中序列32所示的单链DNA ;所述引物34为核苷酸序列如序列表 中序列34所示的单链DNA ;所述引物35为核苷酸序列如序列表中序列35 ;所述引物37为 核苷酸序列如序列表中序列37所示的单链DNA ;所述引物38为核苷酸序列如序列表中序 列38所示的单链DNA ;所述引物40为核苷酸序列如序列表中序列40所示的单链DNA ;所述 引物41为核苷酸序列如序列表中序列41所示的单链DNA ;
[0024] 上述（1)-(14)共14个KASP引物为分别单独包装。
[0025] 本发明所提供的用于检测小麦功能基因的成套KASP引物，也可以为下述（a)或 (b)：
[0026] (a)由来自于上述（1)中的所述KASP引物，以及来自于上述（2)_所述（14)中的 任意N个所述KASP引物组成；所述N为1-13的整数；
[0027] (b)上述（1)中的所述KASP引物。
[0028] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测小麦功能基因的试剂盒。
[0029] 本发明所提供的用于检测小麦功能基因的试剂盒，含有所述成套KASP引物。
[0030] 所述试剂盒中还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A淬灭探针B;
[0031] 所述荧光探针A为与所述标签序列A-致的序列，5'末端连接1个荧光基团A;所 述淬灭探针A为所述标签序列A的反向互补序列，3'末端连接淬灭基团；
[0032] 所述荧光探针B为与所述标签序列B-致的序列，5'末端连接1个荧光基团B;所 述淬灭探针B为所述标签序列B的反向互补序列，3'末端连接淬灭基团。
[0033] 在本发明中，所述荧光报告基团A为FAM;所述荧光报告基团B为HEX;所述荧光淬 灭基团为BHQ。
[0034] 在本发明中，所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B 是存在于KASP 2XMaster Mix中的，其中所述KASP 2XMaster Mix为英国LGC公司产品， 其产品目录号为KBS-1016-002。
[0035] 所述试剂盒中还含有MgCljP ddH20,其中所述MgCl2为英国LGC公司产品，其产品 目录号为10364672,所述ddH20为高压灭菌的双蒸水。
[0036] 本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法。
[0037] 本发明提供了检测或辅助检测小麦功能基因的基因型的方法，其中所述小麦功能 基因为Pp〇-Dl基因和如下中的至少一种：TaPod-Al基因、TaCKX6-Dl基因、TaCWl-4A基因、 TaGS-Dl基因、TaGASR7-Al基因、1-FEHw3 基因、Pinb2-v2 基因、Psy-Bl基因、Psyl-Dl基 因、TaZds-Al基因、Talyce-Bl基因、TaPds-Bl基因、Glu-Bl基因，所述方法具体为如下（A) 或（B):
[0038]⑷由如下（al)，以及如下（a2)-(al4)这13种中的至少一种组成：
[0039] (B)为如下（al);
[0040] (al)检测或辅助检测待测小麦的Ppo-Dl基因的基因型的方法，包括如下步骤：以 所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒（所述荧光报告基团A为FAM ;所述 荧光报告基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测小麦的Ppo-Dl基 因的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈 现蓝色，则所述待测小麦的Ppo-Dl基因的基因型为GG;若所述待测小麦的扩增产物的荧光 信号数据经KlusterCaller软件分析呈现红色，则所述待测小麦的Ppo-Dl基因的基因型 为CC;若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色， 则所述待测小麦的Pp〇-Dl基因的基因型为CG;
[0041] (a2)检测或辅助检测待测小麦的