专利名称：检测THRA基因三种mRNA亚型的引物及所用试剂盒的制作方法
检测THRA基因三种mRNA亚型的引物及所用试剂盒技术领域
本发明涉及生物实验技术和医学诊断技术领域，特别是涉及THRA基因检测领域的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的引物及所用试剂盒。
背景技术：
THRA 基因(thyr ·oid hormone receptor α )即甲状腺激素受:体 α,于 I988 年由 Debuire B.克隆成功。THRA基因由457个腺嘌呤、635个胞嘧啶、637个鸟嘌呤、83个胸腺嘧啶组成，位于人类染色体17qll. 2位置。THRA基因编码的蛋白是甲状腺激素受体，它是甲状腺激素的几个受体之一，能够调节甲状腺激素的生物活性。近年来研究发现，THRA基因与多种疾病相关联。2011年研究发现，THRA基因与乳腺癌相关。甲状腺受体基因的突变和基因表达的改变会导致癌症的发生，Guigon等研究发现，新型的非基因组甲状腺激素受体基因的突变导致甲状腺癌变。2011年，Goumidi L等人研究了 THRA基因多态性与之间的关联，它编码T3核受体TRa I。SNP标记rs939348 TT基因型对阿尔茨海默氏病(AD)存在高风险。甲状腺激素对听力的发展有着至关重要的作用。2001年，Rusch等人研究发现， 发病早期甲状腺功能减退引起耳聋，说明甲状腺激素对听力的发展至关重要。同年，Lily 等人发现，甲状腺激素受体基因的突变抑制了耳聋和甲状腺发育不全。1998年，Williams 研究发现等THRA基因在视网膜发育过程中表达，影响视网膜细胞的生长和增殖。1997年， Sourvinos G等人检测I 42个成对乳腺癌外周血DNA样本，发现24个肿瘤(57%)表现出遗传变异，而标记基因THRAl是抑癌基因的一个有力候选基因。因此，对THRA基因的分析和筛查有助于多种疾病的诊断和检查。
PCR (polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)因其灵敏度高,特异性强， 检测简便、快速，已成为一种成熟技术成为分子生物学研究的关键技术。该技术广泛应用于生物科学的各领域实验中。在PCR实验中，要扩增模板DNA，首先要设计引物，引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物与模板的结合及引物链的延伸都遵循碱基配对原则的。PCR扩增完成之后，再对PCR产物进行进一步的分析。
THRA的外显子有三种形式，以往针对THRA基因的检查需要分别对三种外显子进行独立的实验过程。容易交叉重复干扰，实验过程相对复杂。
PCR过程由高温变性、低温复性和一定温度下延伸三个步骤循环构成。所以在PCR 实验中，对温度的控制非常重要。
在常规的PCR实验中，通常是将DNA样本、引物等试剂根据要求放置于普通384孔或96孔塑料基板内，在基板的表层附上一层透明的塑料膜，以封闭溶液体系。在PCR实验平台的往复温度变化后，通过普通光源或激光透过塑料膜进行分析。
在PCR实验中一般要求DNA样本温度随着PCR的温度同时变化，PCR反应中，从高温到低温或从低温到高温的温度变化灵敏性越高越好。在普通塑料基板上，由于塑料本身在温度传递上有一定的延迟，而且也会吸收一定的热能，导致溶液体系的温度与理想温度有一定误差。另外在通过光源分析时，由于基板的变形及塑料膜本身透光率的问题，导致反应结果出现一定的系统误差。并且当实验的样本量不是很大的情况下，在普通的384孔或 96孔板的基板上，一旦附上塑料膜，对区别已加样的孔和没加样的孔需要仔细辨认，加大了实验者的工作量和工作强度。发明内容
本发明的目的是提供可以在一次检测实验过程中对THRA基因三种亚型进行分别独立扩增的引物及用于THRA基因三种亚型检测的试剂盒，该引物大大地提高实验效率，避免交叉重复干扰，减少工作量，缩短检测实验的时间过程；该试剂盒能增加溶液体系的温度敏感性和光透率，实现溶液体系的温度随PCR仪器的温度变化同步迅速变化。
为达到上述目的，本发明的技术方案是一种检测THRA基因三种mRNA亚型的引物，包括共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA_3共 4条引物。
其中，所述共用引物的序列是CTTCGAGCACTACGTCAACCA。
其中，所述THRA-1 引物的序列是 GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。
其中，所述THRA-2 引物的序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT。
其中，所述THRA-3 引物的序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
本发明还提供一种用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，所述试剂盒包括包括基板和设于所述基板上面的表面覆膜，所述表面覆膜上设有有穴坑，所述穴坑内设有反应体系,所述反应体系含有根据权利要求1至5任一所述的用于检测THRA基因三种mRNA 亚型的引物。
优选的，所述穴坑设有凸沿。
优选的，所述凸沿与所述表面覆膜一体成型。
优选的，所述基板采用亲水性、耐腐蚀、高温下不易变形的透明材料。
优选的，所述基板采用硼硅酸盐超薄玻璃材料。
优选的，所述表面覆膜采用耐高温、变形率小的材料。
优选的，所述表面覆膜采用有机硅塑料为材料。
优选的，所述表面覆膜与所述基板接触的一面设有热熔粘合剂。
优选的，所述反应体系上面设有用于封闭所述反应体系的封闭层。
优选的，所述封闭层为石蜡。
本发明的技术方案中，共用引物的碱基序列是CTTCGAGCACTACGTCAACCA。 THRA-1引物的碱基序列是GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。 THRA-2引物的碱基序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT ο THRA-3 引物的碱基序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
THRA基因有三种亚型，这三种亚型非常相似，其几个外显子分别有三种形式。
第一种为CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTCCGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGGCCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGGCTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAGGAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCTGATGAAGGAGAGAGAAGTGCAGAGTTCGATTCTGTACAAGGGGGCAGCGGCAGAAGGCCGGCCGGGCGGGTCACTGGGCGTCCACCCGGAAGGACAGCAGCTTCTCGGAATGCATGTTGTTCAGGGTCCGCAGGTCCGGCAGCTTGAGCAGCAGCTTGGTGAAGCGGGAAGTCTCCAAGGGCCGGTTCTTCAGCACCAGAGCCCGAAGAGCCCGCAGCAGCGTCTCCTGGAGCTGCTCCACCGAAGCGGAATTCTCCATGCCCGAGCGGTCTGTGGGGAAGACGACAGCAGTGAGGCGGACTCCCCGAGCTCCTCTGAGGAGGAACCGGAGGTCTGCGAGGACCTGGCAGGCAATGCAGCCTCTCCCTGAAGCCCCCCAGAAGGCCGATGGGGAAGGAGAAGGAGTGCCATACCTTCTCCCAGGCCTCTGCCCCAAGAGCAGGAGGTGCCTGAAAGCTGGGAGCGTGGGCTCAGCAGGGCTGGTCACCTCCCATCCCGTAAGACCACCTTCCCTTCCTCAGCAGGCCAAACATGGCCAGACTCCCTTGCTTTTTGCTGTGTAGTTCCCTCTGCCTGGGATGCCCTTCCCCCTTTCTCTGCCTGGCAACATCTTACTTGTCCTTTGAGGCCCCAACTCAAGTGTCACCTCCTTCCCCAGCTCCCCCAGGCAGAAATAGTTGTCTGTGCTTCCTTGGTTCATGCTTCTACTGTGACACTTATCTCACTGTTTTATAATTAGTCGGGCATGAGTCTGTTTCCCAAGCTAGACTGTGTCTGAATCATGTCTGTATCCCCAGTGCCCGGTGCAGGGCCTGGCATAGAGTAGGTACTCCATAAAAGGTGTGTTGAATTGAA第二种为CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTC CGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGG CCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGG CTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAG GAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCT GATGAAGGGTCCGCAGGTCCGGCAGCTTGAGCAGCAGCTTGGTGAAGCGGGAAGTCTCCAAGGGCCGGTTCTTCAGC ACCAGAGCCCGAAGAGCCCGCAGCAGCGTCTCCTGGAGCTGCTCCACCGAAGCGGAATTCTCCATGCCCGAGCGGTC TGTGGGGAAGACGACAGCAGTGAGGCGGACTCCCCGAGCTCCTCTGAGGAGGAACCGGAGGTCTGCGAGGACCTGGC AGGCAATGCAGCCTCTCCCTGAAGCCCCCCAGAAGGCCGATGGGGAAGGAGAAGGAGTGCCATACCTTCTCCCAGGC CTCTGCCCCAAGAGCAGGAGGTGCCTGAAAGCTGGGAGCGTGGGCTCAGCAGGGCTGGTCACCTCCCATCCCGTAAG ACCACCTTCCCTTCCTCAGCAGGCCAAACATGGCCAGACTCCCTTGCTTTTTGCTGTGTAGTTCCCTCTGCCTGGGA TGCCCTTCCCCCTTTCTCTGCCTGGCAACATCTTACTTGTCCTTTGAGGCCCCAACTCAAGTGTCACCTCCTTCCCC AGCTCCCCCAGGCAGAAATAGTTGTCTGTGCTTCCTTGGTTCATGCTTCTACTGTGACACTTATCTCACTGTTTTAT AATTAGTCGGGCATGAGTCTGTTTCCCAAGCTAGACTGTGTCTGAATCATGTCTGTATCCCCAGTGCCCGGTGCAGG GCCTGGCATAGAGTAGGTACTCCATAAAAGGTGTGTTGAATTGAA 第二种为CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTCCGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGGCCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGGCTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAGGAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCTGATGAAGGTGACTGACCTCCGCATGATCGGGGCCTGCCACGCCAGCCGCTTCCTCCACATGAAAGTCGAGTGCCCCACCGAACTCTTCCCCCCACTCTTCCTCGAGGTCTTTGAGGATCAGGAAGTCTAAAGCCTCAGGCGGCCAGAGGGTGTGCGGAGCTGGTGGGGAGGAGCCTGGAGAGAAGGGGCAGAGCTGGGGGCTGAGGGAGACCCCCCCACACCCCTTCTCTCCTTCCTCTCGTCCTTGGATAGATTCAGCTCCCACACACACACCCGCACTGCCCAGGTCCCTCCTCAGACCTCCAGCCCTGGGACAGGGCAAACAACTGAACTTGCTATGGAAAGGACAGTGTGGGAGGCTGGGGGAGCTGTGTCCTGCAGTTCCCAGGACCCCATCCTCTCAGAAGGTAGGGGAAGGGCGGGAGGATTGAGAAGGGACAAGCCACCTTGACCGTAGGGGAAGGAGGAATGTGGGCTGGGGGAAGATGCCCTCAACTCACCCCCTACACACACATGAGAGAGAGCCCCCACCCAGTTCCTTGGCCTAGGTCTCCCCTCCAGGCTGAGGGCCTCTCTACTTCCCCAGATGCCTGGGTGCAAAGAACGGCTTGGCTTGGCTCCTCCTCTGGAGGTTAAAATTTATAGTCATTCTAACTGCACTTTGGAAACCAAGCAAGGGGAGAAGACAAATGAAGAAAAACTAGACAGAGA这三种外显子都有相同的部分
权利要求
1.一种检测THRA基因三种mRNA亚型的引物，其特征在于，包括共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA-3 共 4 条引物。
2.根据权利要求1所述的检测THRA基因三种mRNA亚型的引物，其特征在于，所述共用引物的序列是 CTTCGAGCACTACGTCAACCA。
3.根据权利要求1所述的检测THRA基因三种mRNA亚型的引物，其特征在于，所述THRA-1 引物的序列是 GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。
4.根据权利要求1所述的检测THRA基因三种mRNA亚型的引物，其特征在于，所述THRA-2 引物的序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT。
5.根据权利要求1所述的检测THRA基因三种mRNA亚型的引物，其特征在于，所述THRA-3 引物的序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
6.一种用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包括基板和设于所述基板上面的表面覆膜，所述表面覆膜上设有有穴坑，所述穴坑内设有反应体系，所述反应体系含有根据权利要求1至5任一所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的引物。
7.根据权利要求6所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述穴坑设有凸沿。
8.根据权利要求7所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述凸沿与所述表面覆膜一体成型。
9.根据权利要求6到8任一所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述基板采用亲水性、耐腐蚀、高温下不易变形的透明材料。
10.根据权利要求9所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述基板采用硼硅酸盐超薄玻璃材料。
11.根据权利要求6到8任一所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述表面覆膜采用耐高温、变形率小的材料。
12.根据权利要求11所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述表面覆膜采用有机硅塑料为材料。
13.根据权利要求6到8任一所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述表面覆膜与所述基板接触的一面设有热熔粘合剂。
14.根据权利要求6到8任一所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述反应体系上面设有用于封闭所述反应体系的封闭层。
15.根据权利要求9所述的用于检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒，其特征在于，所述封闭层为石蜡。
全文摘要
本发明公开了检测THRA基因三种mRNA亚型的引物及用于检测检测THRA基因三种mRNA亚型的试剂盒。包括THRA共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA-3共4条引物，通过PCR扩增和凝胶电泳，能够实现在一次检测实验过程中对THRA基因的三种亚型mRNA基因进行分别独立扩增，提高了实验效率，避免交叉重复干扰，减少工作量，缩短检测实验的时间过程，也降低了实验成本。还包括一种试剂盒，有基板和表面覆膜，能增加溶液体系的温度敏感性和光透率，实现溶液体系的温度随PCR仪器的温度变化同步迅速变化。
文档编号C12Q1/68GK103014140SQ20111028591
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者邵敏华, 黄迅威, 沈玲宇 申请人:上海熙洛生物技术有限公司