一种贝类snRNA U6基因及其引物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体地说是一种贝类snRNA?U6基因的全序列及其引物应用于贝类microRNA的表达分析。本发明公开了一种基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法表达分析中的内参基因及引物。我们克隆获得了长牡蛎U6基因全序列，它的同源基因human?snRNAU6表达恒定，可用于miRNA的表达分析内参。并且以它为内参做出的表达结果与miRNA测序表达谱高度吻合。从而旁证了该U6基因适合作为miRNA表达分析的内参。
【专利说明】—种贝类snRNA U6基因及其引物和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说是一种贝类snRNA U6基因的全序列及其引物应用于贝类microRNA的表达分析。
【背景技术】
[0002]贝类，属软体动物门中的瓣鳃纲(或双壳纲)，常见的种类有牡蛎、贻贝、蛤、蛏等。现存种类I万种左右，其中80%生活于海洋中。贝类中绝大多数种均可食用，很多贝类的肉质肥嫩，鲜美可口，营养丰富，具有很高的经济价值，是世界上重要的水产养殖对象。
[0003]MicroRNA (miRNA)是一类在生物界中广泛存在的小分子非编码单链RNA，长约21~24nt，它能通过降解或抑制互补的靶mRNA来进行转录后基因表达调控，并且在生物的各个发育时期和不同的组织器官中广泛表达，参与到生物的各种生理活动中，因其在生物中的重要性,近几年国内外科学家对miRNA的研究倍加重视。对贝类microRNA的研究有助于推动贝类养殖业的发展。贝类中只报导了 65条microRNA (miRBase 18)，且暂时没有可用于microRNA定量的内参基因报导。
[0004]目前对miRNA的表达分析主要有大规模测序，基因芯片和实时荧光定量法。大规模测序和基因芯片法为高通量方法，成本很高，不适于少量miRNA的功能分析。而基于SYBRGreen染料荧光定量PCR的miRNA相对定量法，参见文献:【Shi R, Chiang VL (2005) Facilemeans for quantifying microRNA expression by real-time PCR.Biotechniques 255039:519-525.】表达分析有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势，广受研究人员的欢迎。而在相对定量中，内参的选择尤为重要。
[0005]目前内参的选 择大多数采用一些表达相对恒定的管家基因，如U6，5S rRNA等。U6基因是一种核剪切子RNA，参与到pre-mRNA的加工剪切，它的序列比较保守，在不同的物种中同源性高，参见文献【Brow DA, Guthrie C (1988) Spliceosomal Rna U6 Is RemarkablyConserved from Yeast to Mammals.Nature 334:213-218.】。但是目前在贝类中的 U6 基因序列尚未被克隆，也没有基于贝类U6基因设计的引物。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种贝类microRNA定量的内参基因及其引物。即为基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法表达分析中的内参基因及引物。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0008]一种贝类small nuclear RNA U6基因，具有序列表SEQID No:l中喊基序列。
[0009]根据权利要求所述基因设计的一对内参引物，其特征在于:用于基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法中，其以polyA加尾反转的cDNA为模板的内参引物:
[0010]Sense primer: 5’ -CGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGA-3’
[0011]Ant1-sense primer: 5’ -TGGAACGCTTCACGAATTTGCGTGTCATC-3’。
[0012]所述基因或引物作为内参基因在相对定量法实时荧光定量PCR中的应用。[0013]所述基因或引物作为相对定量中的内参基因在实时荧光定量PCR的贝类microRNA表达分析中的应用，它们的作用在于校正上样量，上样过程中的实验误差，保证实验的准确性。
[0014]具体步骤为:
[0015] a.候选miRNA序列的获得:从已有数据库或其它来源获得欲做表达分析的miRNA序列。
[0016]b.引物设计:根据获得的候选miRNA序列设计该miRNA相应的特异引物(扩增产物单一，具体为溶解曲线峰单一，3%的琼脂糖胶检测条带单一)。
[0017]c.PCR模板的准备:在收集的样品中用E.Z.N.A.? miRNA kit(试剂盒，市购于 OMEGA 公司)提取 <200nt 的 small RNA 后，用 One Step PrimeScriptf miRNA cDNAsynthesis Kit (试剂盒,市购于TaKaRa公司)按照说明书加polyA尾后反转成cDNA。
[0018]d.突光定量PCR反应:用miRNA相应的特异引物和universal reverseprimer (由上述TaKaRa试剂盒提供)以U6基因为内参在ABI 7500FASTreal_time PCR仪中进行。
[0019]e.获得各模板中的相对表达量:结果采用2_ΔΔα法计算，ΔΔ Ct = (Ctniim-Ctu6)
sample2_ (CtmiRNA_Ctu6) sampiel。
[0020]f.根据表达情况进行后续的功能分析。
[0021]本发明具有如下优点:
[0022]1.本发明能够适用于少量miRNA的表达分析，操作相对简单，成本较低，灵敏度闻。
[0023]2.本研究中，我们克隆获得了 U6基因全序列(见实施例1)，它的同源基因humansnRNA u6表达恒定，可用于miRNA的表达分析内参(见实施例4)。并且以它为内参做出的表达结果与miRNA测序表达谱高度吻合(见实施例3)。从而旁证了 U6基因适合作为miRNA表达分析的内参。
[0024]3.本发明提供的U6基因序列保守，与线虫、果蝇、小鼠、人的U6基因同源比对，结果显示该基因在不同的物种中高度保守，同源性可达到83.486% (图1)。
【专利附图】
【附图说明】:
[0025]图1.长牡蛎U6基因与线虫、果蝇、小鼠、人的U6基因同源比对，结果显示该基因在不同的物种中高度保守，只有5’端有一些变异。
[0026]图2.U6内参引物扩增产物的溶解曲线图。
[0027]图3.PCR产物用3 %的琼脂糖胶确定无非特异扩增。
[0028]图4.Ct值与Log (起始模板拷贝数)关系图。
[0029]图5.长牡蛎的 4 个 miRNA 基因(m0203_5p，m0250_3p, m0252_3p, m0420_5p)的相对定量结果(实线)与测序表达谱结果(虚线)的比较。Bla:囊胚期幼虫；Umb:壳顶期幼虫；s:腮组织。
【具体实施方式】
[0030]下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。本发明所采用实验用品均来自市购，所用英文标记均为产品包装名称。
[0031]实施例1
[0032]根据同源序列搜索从长牡蛎基因组中获得推测的牡蛎U6基因序列。在其保守区域设计引物，获得U6基因的部分序列，根据获得的部分序列，利用RACE技术获得U6基因全长。
[0033]序列表(I) SEQ ID NO I的信息
[0034]序列特征
[0035]长度:109nt
[0036]类型:核酸
[0037]链型:双链
[0038]拓扑结构:线形
[0039]分子类型:DNA
[0040]特性名称:snRNA(1 — 109)
[0041]来源:长牡蛎
[0042]序列描述:
[0043]GTACTTGCTTTTCGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT
[0044]根据与其他物种的同源性比对(见图1)，发现该基因序列在不同的物种间高度保守，从而确认为U6基因。
[0045]实施例2
[0046]根据U6基因序列设计一对引物。该对引物特异性高，扩增效率为1.0016，适用的退火温度范围广(54~68°C )。
[0047]根据U6基因全长在Primer Premier 5软件中设i十一对突光定量引物:
[0048]正向引物:5，-CGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGA-3’
[0049]反向引物:5，-TGGAACGCTTCACGAATTTGCGTGTCATC-3，
[0050]该引物扩增出一段90bp的PCR产物:
[0051]CGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCA
[0052]该对引物PCR扩增的具体实施方案如下:
[0053]1、实验材料:长牡蛎幼虫和成体组织腮于取自山东青岛。幼虫样品来自F2子代，Fl是G3家系的51个雌牡蛎和I个雄牡蛎。G3家系由一对来自山东烟台的雌雄牡蛎构建。解剖51个雌牡蛎取卵，用过滤海水将卵冲洗并通过90 μ m的尼龙过滤网过滤后，悬浮于5L的水桶中，卵密度约50，000卵/ml。雄牡蛎的精子用过滤海水冲入一个500ml的烧杯。精子加入到卵子悬浮液中，最终的密度达到10-15个精子包围一个卵子即可。最后得到约2500百万个受精卵悬浮于25 m3过滤海水中26°C培养，密度约30受精卵/ml。囊胚期幼虫用过滤网捞取受精后四个半小时的发育幼虫，壳顶期幼虫取自受精后8.75天的发育幼虫。腮组织取自山东青岛的野生牡蛎。
[0054]2、RNA提取:用E.Z.N.A.? miRNA kit (试剂盒，市购于OMEGA公司)提取< 200nt (分别提取幼虫和成体组织腮)的small RNAs (小分子量的RNA)作为样品备用。[0055]1)先准备好1.5ml的EP管加入Iml的RNA-Solv Reagent (由上述OMEGA试剂盒提供)。
[0056]2)用研钵在液氮中研磨样品后，将粉末转移到1.5ml EP管中。
[0057]3)平行方向水平剧烈摇动30下，室温放置2_3min。
[0058]4)加0.2ml的氯仿。剧烈震荡15sec,在冰上放lOmin。
[0059]5) 12000g，4°C离心15min后，分为三层，油状底层，白色固体中间层和上层水相。RNA全部在上层水相中。
[0060]6)将少于80%的上步骤中的水相转移到新的2.0ml EP管中，加入1/2体积转移水相的无水乙醇，颠倒混匀。
[0061]7)取少于700 μ I的以上混合物放入Hibind RNA mini column (由上述OMEGA试剂盒提供)中，在2ml的收集管中，1000Og室温离心30-60sec。将离心后的液体转入新的2ml的EP管中。
[0062]8)加入0.9倍滤液体积的无水乙醇，颠倒混匀。准备一个MicroFlute RNAcolumn (由上述OMEGA试剂盒提供)放入一个新的2ml的收集管中。
[0063]9)将以上混合液加入MicroFlute RNA column(由上述OMEGA试剂盒提供)中，1000Og离心30_60sec。弃去液体。
[0064]10)把MicroElute RNA column 放回收集管中，加 500 μ I 的 RWB Wash buffer (由上述OMEGA试剂盒提供)，1000Og离心30_60sec。弃去液体。
[0065]11)重复步骤 10。弃去液体后，> 13000g离心2min思干Micro Flute RNAcolumn。
[0066]12)将 MicroFlute RNA column 转入新的 1.5ml EP 管中，用 20 μ I 的 DEPC 水洗脱small RNAs,确保水加在column中间。室温放置2min后，> 13000g离心Imin,收集smallRNAs。
[0067]3、第一链 cDNA 的合成:用 One Step PrimeScript* miRNA cDNASvnthesisKit (试剂盒,市购于TaKaRa公司)按照说明书加将步骤2获得的smallRNAs加polyA尾后反转成cDNA。
[0068]1)配制 20 μ I 的反应体系:10μ I 2 XmiRNA Reaction Buffer Mix, 2 μ I 0.1%BSA, 2 μ I miRNA PrimeScript" RT Enzyme Mix, I μ I small RNAs，5 μ I RNase FreedH20(均由上述TaKaRa试剂盒提供)。
[0069]2)在BioRad PCR仪(PCR仪，市购于BioRad公司)中反应条件:37°C (加尾和反转录60min), 85°C (酶的失活5sec)。
[0070]3)向得到的反转录反应液中添加RNase Free dH20补足至100 μ I。
[0071]4、PCR 反应:在 ABI 7500FAST real-time PCR 仪(PCR 仪，市购于 ABI 公司)中进行。
[0072]I) 10 μ I 反应体系:5 P I 2Χ S YBR" Premix Ex Taq TM II (试剂，市购于TaKaRa 公司)，3 μ I H20,0.2 μ I 50 X ROX Reference Dye II (试剂，市购于 TaKaRa 公司)，1μ I cDNA模板，0.4 uM正向引物，0.4 uM反向引物。
[0073]2) PCR 扩增程序为:95°C (预变性 30sec) ；95°C (变性 3sec)，64°C (复性 30sec)循环40次；仪器自动制作溶解曲线。
[0074]通过观察ABI 7500FAST real-time PCR仪在PCR反应后生成的溶解曲线(见图2)为单一峰判定该对引物无非特异扩增；用211 I的PCR产物在3%的琼脂糖胶中150V电泳25min后用紫外看胶仪拍照，观察到条带单一，从而进一步确定该对引物无非特异扩增(见图3)。
[0075]用RNase Free dH20(无RNA酶的蒸馏水)5倍梯度稀释按步骤I准备的壳顶期(Umb)模板，根据以上步骤4进行实时荧光定量PCR。假设最高模板浓度为1000000个拷贝，根据ABI 7500FAST real-time PCR仪得到的结果Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)与Log(起始模板拷贝数)的关系作图(见图4，R2为相关系数)，斜率=-3.318，扩增效率(E) = 10_1/#w-l，得到其扩增效率E = 1.0016。
[0076]用相同的模板和PCR反应体系，只改变PCR扩增程序中的退火温度探索其适用的温度范围，发现该引物适用的退火温度范围广(54~68°C,见表一)。
[0077]表一温度梯度实验结果
[0078]
【权利要求】
1.一种贝类small nuclear RNA U6基因，其特征在于:具有序列表SEQID No:1中碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述基因设计的一对内参引物，其特征在于:用于基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法中，其以polyA加尾反转的cDNA为模板的内参引物:
Sense primer:5’ -CGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGA-3’
Ant1-sense primer:5’ -TGGAACGCTTCACGAATTTGCGTGTCATC-3’。
3.—种权利要求1或2所述基因或引物作为内参基因在相对定量法实时荧光定量PCR中的应用。
4.根据权利要求3所述基因或引物作为相对定量中的内参基因在实时荧光定量PCR的贝类miCToRNA表达分析中的应用，它们的作用在于校正上样量，上样过程中的实验误差，保证实验的准确性。
【文档编号】C12N15/12GK103484465SQ201210189971
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年6月11日 优先权日:2012年6月11日
【发明者】黄雯, 阙华勇, 许飞, 李莉, 张国范 申请人:中国科学院海洋研究所