一种用于检测egfr基因t790m突变的探针、引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种表皮生长因子EGFR基因外显子 20T790M突变检测的探针、引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类表皮生长因子受体家族（epidermalgrowthfactorreceptorfamily,EGFR 家族）属于酪氨酸激酶受体家族，也被称作ffiR家族或erbB家族。EGFR蛋白酪氨酸激酶 功能区由EGFR基因外显子18-24编码，其中外显子18-20编码N-Lobe，外显子21-24编码 C-Lobe。迄今为止发现的EGFR突变主要位于外显子19至21，外显子20上的T790M突变 是目前较为认可的耐药机制之一，通常是替代的点突变，2369位点上的C突变为T。因此 在临床用药选择时，除敏感突变外，T790M耐药基因的检测也同样重要。进一步的研究亦证 明：NSCLC患者治疗前的EGFR基因T790M突变与患者接受吉非替尼治疗后的疗效呈显著负 相关，因此通过检测EGFR基因T790M突变来准确地预测吉非替尼治疗NSCLC患者获得性耐 药的发生是临床实践中切实可行的实验诊断方法。
[0003] 目前常用的基因突变检测方法有测序法和ARMS-PCR方法，这两种方法均存在一 定的缺陷。测序法灵敏度较低约20%，且操作复杂，检测时间较长，假阴性率较高。ARMS-PCR 方法能够达到1 %的灵敏度，对于肿瘤组织样本能够满足检测需求，但是对于取样方便的血 液样本，如血浆或者血液中的循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量往往低于1 %，ARMS-PCR方法不 足以对血液进行检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。此外，在临床用药过程中产 生的耐药性突变，以前的方法由于灵敏度不够也无法进行检测。因此，从这些低含量样本中 检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方 法。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一种高灵敏度检测EGFR基因T790M突变的试剂盒。
[0005] 在本发明的一方面，提供一种检测EGFR基因T790M突变基因突变检测的引物和探 针，其特异引物与探针包括如下序列：
[0006] 表1EGFR基因T790M突变基因特异性双引物和探针核苷酸序列
[0007] E-20-VI! -R)(>:CTC'A?'TtXACa.;T(i(:ARrTrATC'ATSRQIDNO： ()i E-2U-RI0:C-八T'ATTGT(下r「(.;TGTTCCCTiGACASfTQIDN(.): 02 E-.?Ji-P-C5:FAM-0\T(.K.、CCTTC(.;GCTG(.TTrrr-BHQ! SHQIDNO： 03 E.-2().-Vli-Bl(K:k:CTCACCTC(.VKCC(.n'GCARCTCAT(;ACCA.-NH2 SRQIDNO： 04 l〈-EX2:W:i: (X'TGAGGTAGGAGAATCGrrTGAAS「:Q!DNO: 05 K-EX23-RI:TGGAGTCTTGCTCTGTTCjC'CTASRQIDNO： 06 K-EX23-m:HEX-GCAGTGACTVGAGATCGTGTCACT-BHQISRQIDNO： 07
[0008] 本发明另一方面提供一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，所述试剂盒 包括：P-T790M混合酶、P-T790M阳性对照和P-T790M反应液。反应液内装有相应的T790M基因突变检测和内控试剂，突变由FAM信号指示，内控由HEX(或VIC)信号指示，内控作为 结果判读的一部分，选择的检测区域是人类EGFR基因相对保守的区段，约100bp，这样即便 DNA有降解，内控仍然能够最真实地反应T790M基因有效的DNA量。
[0009]表2试剂盒组成
[0010]
[0011] 本发明另一方面提供一种用于检测EGFR基因T790M突变的PCR反应扩增体系如 下：
[0012] lOxPCR缓冲液 内控上游引物 50-150 内控下游引物 50-150UM 内控HEX探针 50-150uM 突变上游引物 50-150 突变下游引物 50-150 突变FAM探针 50-150uM Block引物 50-15011M Taq酚 0.2-0.8UL dNTP 15~35rnM MgC!2I50~350mM 补纯化水至 65nL
[0013] 本发明再一方面，提供一种检测T790M突变的方法（所述方法用于非诊断目的）， 所述方法包括以下步骤：
[0014] (1)根据COSMIC数据公布的人类EGFR为野生型基因序列，针对EGFR基因20号外 显子T790M突变，设计特异性引物和探针。
[0015] (2)提取血浆检测样本中的DNA。
[0016] (3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。
[0017] (4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：利用特异性引物和荧光探针 进行PCR检测，突变由FAM信号指示，内控由HEX(或VIC)信号指示，通过计算ACt的大小 进行判断，
[0018]ACt=CtFAM_CtHEX，ACt小于8为阳性，反之为阴性。
[0019] 本发明基于ARM-PCR平台，开发一种高灵敏度检测EGFR基因T790M突变的试剂 盒。本试剂盒以血浆DNA为检测样本，通过检测EGFR基因T790M突变，可预测吉非替尼治 疗NSCLC患者获得性耐药的发生，为临床靶向治疗提供依据。本检测方法灵敏度高，检测时 间只需120分钟即可完成，同时具备了特异性好，准确率高，价廉快速，操作简单等优点，可 以满足临床快速检测的实际需求。
[0020] 本发明的有益效果是：本发明采用了特异性引物和探针技术，可以实现血液样本 EGFR基因T790M的快速检测。本发明：（1)引物设计上，将引物上SNP位点设计为G/A兼并 碱基，兼容了所有的效率，提高了扩增效率；⑵灵敏度高，检测灵敏度可达2%。;⑶与采用 数字PCR方法比较，操作简单，节约成本，临床应用范围广；(4)大反应体积血浆样本检测， 使血浆样本DNA上样量变大，体系更稳定，增大了血浆样本的检出率；(5)检测速度快，检测 过程只需要120分钟即可完成，耗时仅需数字PCR的二分之一；(6)本发明检测方法能够检 测外周血标本，从而具有采样方便，能够动态检测的优势。
【附图说明】
[0021 ] 图1为灵敏度分析试验结果PCR图。
[0022] 图2为检测临床样本EGFR基因T790M阳性PCR图之一；
[0023] 图3为检测临床样本EGFR基因T790M阳性PCR图之二
[0024] 图4为检测临床样本EGFR基因T790M阴性PCR图。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而 不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学术语与本领域普通技 术人员所理解具有相同的含义。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例以细胞系检测本发明体系，以H1975细胞系突变为阳性，以阴性血浆样 本做对照。利用本发明实时荧光PCR检测EGFR基因T790M突变的方法包括如下步骤：
[0028] (1)检测样本处理与DNA的提取：
[0029] 细胞系的DNA提取方法如下：加入蛋白酶K和BufferATL，56 °C消化裂解1小 时，加入200mLBufferAL混匀再加入200yL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000Xg(8000rpm)离心lmin，加入 500iiLBufferAWl，6000Xg(8000rpm) 离心lmin，小心打开盖子加入500iiLBufferAW2,6000Xg(8000rpm)离心lmin，空管 离心20000Xg(14000rpm)离心3min，加入lOOuLBufferATE于膜中央，温育5分钟， 20000Xg(14000rpm)离心lmin。
[0030] 血浆DNA的提取方法如下：移取4mL样品加入10mL圆底离心管中，加入1. 8mL BufferQ)L，再加入 50yLProfeinaseKSolution，充分混勾 10s;放入水浴锅中，63°C消 化15min，快速冷却至室温，加入400yLDNATracer,混匀后，再加入3. 3mL预冷的异丙醇， 上卜颠倒混勾，l〇〇〇〇Xg离心5min;沉淀中加入470yLBufferCDB和10yLProteinase KSolution,摇匀，放入水浴锅中，63°C消化10min;冷却至室温，加入200yL无水乙醇，将 沉淀吹打混匀；将沉淀混合液全部移入吸附柱中，lOOOOXg离心30s，倒掉收集管中的液 体；往DNA吸附柱中加入700yLBufferCWl，10000Xg离心30s，倒掉收集管中的液体；往 DNA吸附柱中加入700yLBufferCW2, 10000Xg离心30s，倒掉收集管中的液体；往DNA吸 附柱中加入700yL无水乙醇，lOOOOXg离心30s，丢弃收集管；换用新的收集管，13000Xg 离心5min，丢弃收集管；将吸附柱小心转移至干净的1. 5mL离心管中，往DNA吸附膜中心滴 加 30-100yLBufferCD