一种检测肺癌热点突变基因的组合物及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测肺癌热点突变基因的组合物，所述组合物包含SEQ?NO：1至SEQ?NO：53的引物序列，还包括SEQ?NO：54至SEQ?NO：63的block序列。本发明对肺癌相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测肺癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肺癌患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的价值。
【专利说明】一种检测肺癌热点突变基因的组合物及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，特别是涉及检测肺癌驱动基因热点突变的组合物。
【背景技术】
[0002] 肺癌是一类高发病率、高死亡率的恶性肿瘤。近10年来，我国肺癌的发病率与死 亡率快速增长。肺癌的发病部位有所不同，根据各型肺癌的分化程度和形态特征，目前将肺 癌分为两大类，即小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者包括鳞癌、腺癌和大细胞癌。
[0003] 研究发现，肺癌的发生与EGFR、KRAS、PIK3CA热点基因的突变有很大的关系。
[0004] EGFR基因表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表 达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是 Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt/mT0R通路。当信号传导至细胞核后，弓丨 起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。EGFR信号传导的异常是导致多种肿瘤发生 的原因。
[0005] K-ras基因位于12号染色体短臂上，35kb，属于Ras基因家族的一员。在Ras基 因中，K-Ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路 径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当 K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱， 细胞增殖失控而癌变。
[0006] PIK3CA基因编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶的plio催化亚单位，正常情况下在肺、 乳腺、胃肠和卵巢等器官中均有表达，具有调控体细胞增殖、分化、存活等许多重要功能。研 究发现PIK3CA基因产生突变与肺癌等多种癌症发病存在相关性，4%的肺癌患者体内基因 PIK3CA存在突变。
[0007] 目前检测基因突变的方法主要有以下几种：
[0008] (1)直接测序法。直接测序法是运用探针进行PCR扩增并对扩增产物进行测序和 TA克隆并再次测序以最终确定突变的碱基位置。该方法比较繁琐、耗时长，而且由于自身的 限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20 %的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临 床中的应用与大量的临床样本分析。
[0009] (2)变性高效液相色谱法（DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA 与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。通过洗脱峰的不同判断有无突 变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知 和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5%左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造 成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。
[0010] (3)高分辨率熔解曲线（HRM)。高分辨率熔解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱 和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5%左 右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。
[0011] (4)探针扩增阻滞突变法（ARMS)。利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模 板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件 下，只有在引物3'碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过 设计两个5'端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加 入两种引物及3'端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延 伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在1 %左右。
[0012] (5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应（CAST-PCR)。CAST-PCR法采用优化 TaqMan探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩 增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在1?0. 1 %左右。
[0013] 但这些技术的灵敏度都不高，检测的特异性差，误诊率高，不能满足对肺癌检测的 需求。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的是提供一种肺癌热点基因无创检测的组合物，该组合物及其使用方 法特异性强且灵敏度高。
[0015] 为达上述目的，本发明的技术方案是：一种检测肺癌热点突变基因的组合物，所述 组合物包含SEQ N0:1至SEQ N0:53的引物序列，还包括SEQ N0:54至SEQ N0:63的block 序列。
[0016] 其中，所述组合物在用于PCR扩增时的反应体系为：1?10XPCR缓冲液、0. 1? ImM dNTPs、0.1 ?luM 正向引物、0.1 ?ΙμΜ反向引物、0.1 ?2μΜ block、0.05?2ng/ μ L 模版 DNA、Eva Green 染料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯 化镁。
[0017] 其中，所述block序列为PCR扩增反应中所用，是一段与野生型DNA序列完全匹配 的可偏向性扩增突变DNA序列的突变型特异性引物。
[0018] 其中，所述模板DNA浓度可以低至0. 1?lng/ μ L。
[0019] 其中，所述肺癌热点基因为EGFR、KRAS、PIK3CA基因野生型和EGFR、KRAS、PIK3CA 基因突变型。
[0020] 其中，所述 EGFR、KRAS、PIK3CA 基因包含 G719A、G719S、G719C、E746_A750del (1)、 E746_A750del(2)、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del、E746_T751>A、E746_S752>A、 E746_S752>V、E746_S752>D、L747_A750>P、L747_T751>Q、L747_E749del、L747_T751del、 L747_S752del、L747_A750>P、L747_P753>Q、L747_T751>S、L747_T751del、L747_T751>P、 T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、L861Q、G12R、 G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047。
[0021] 本发明还提供了一种检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，所述使用方法 的步骤为：
[0022] 第一步：将待测样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照进行PCR扩增反应， 其中所述PCR扩增反应以待测DNA为模板，设计针对目的基因突变位点的特异性引物，同时 加入LNA锁核酸修饰，通过对待测DNA样品中的目的基因进行偏向性PCR扩增反应；
[0023] 第二步：根据仪器检测结果中Ct值和MeltCure的判读，判断所述待测样品中目的 基因的突变情况。
[0024] 其中，通过PCR扩增反应结果中扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。
[0025] 所述根据Ct值和MeltCure的判读来判断待测样品中目的基因的突变情况，其具 体步骤为：
[0026] 1).运行CT值的计算，无模板对照应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信 号增强；当Ct值> 45. 0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分 析试验情况；
[0027] 2.)运行内控，一般Ct值〈40.0,可以继续分析，如果Ct值彡40.0,则说明样品 DNA降解严重，不适合试验需要；
[0028] 3).运行阳性质控品，阳性质控的Ct值〈45. 0,熔解曲线最高峰的Tm值在相应突 变的范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果；
[0029] 4).符合上述条件，运行Tm calling程序，通过烙解曲线分析和Ct值，判读样本 是否存在突变：运行Tm calling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围 内，并且Ct〈45,表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：a， 无扩增；b，有扩增，Ct > 45 ;c，有扩增，Ct〈45,但是运行Tm calling程序，烙解曲线最高峰 的Tm值不在相应突变的范围内；
[0030] 5).如果不符合上述第1、3项要求，应重做本次实验；不符合第2项要求，建议重 新从样本中提取DNA，再次检测。
[0031] 其中，所述待测DNA样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为含有EGFR、KRAS、 PIK3CA基因突变的混合质粒或者纯合质粒，所述阴性质控品为不含有EGFR、KRAS、PIK3CA 基因突变的混合质粒或者纯合质粒。
[0032] 其中，所述待测DNA为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞 DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。
[0033] 其中，所述肺癌热点基因为EGFR、KRAS、PIK3CA基因野生型和EGFR、KRAS、PIK3CA 基因突变型。
[0034] 其中，所述 EGFR、KRAS、PIK3CA 基因包含 G719A、G719S、G719C、E746_A750del (1)、 E746_A750del(2)、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del、E746_T751>A、E746_S752>A、 E746_S752>V、E746_S752>D、L747_A750>P、L747_T751>Q、L747_E749del、L747_T751del、 L747_S752del、L747_A750>P、L747_P753>Q、L747_T751>S、L747_T751del、L747_T751>P、 T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、L861Q、G12R、 G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047。
[0035] 其中，所述样品的DNA浓度可以低至0. 1?lng/μ L。
[0036] 其中，所述PCR扩增反应的具体过程分为2个阶段：
[0037] (1)扩增反应，92?97°C预变性5?15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92?97°C 变性10?20s，50?65°C退火10?30s，70?75°C延伸10?35s，并进行35?55个循 环；
[0038] (2)做熔解曲线，92?97°C预变性0· 2?5分钟，20?55°C退火0· 2?5分钟， 60?97°C采集荧光，每秒采集荧光10?30次。
[0039] 本发明所用引物序列如表1和表2所示。
[0040] 表1 EGFR、KRAS、PIK3CA热点基因检测引物序列
【权利要求】
1. 一种检测肺癌热点突变基因的组合物，其特征在于，所述组合物包含SEQ NO :1至 SEQ NO :53的引物序列，还包括SEQ NO :54至SEQ NO :63的block序列。
2. 如权利要求1所述的检测肺癌热点突变基因的组合物，其特征在于，所述组合物在 用于PCR扩增时的反应体系为：1?10XPCR缓冲液、0. 1?ImM dNTPs、0. 1?luM正向引 物、0·l?lμM反向引物、0·l?2μMblock、0·05?2ng/μL模版DNA、EvaGreen染料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯化镁。
3. 如权利要求1或2所述的检测肺癌热点突变基因的组合物，其特征在于，所述block 序列为PCR扩增反应中所用，是一段与野生型DNA序列完全匹配的可偏向性扩增突变DNA 序列的突变型特异性引物。
4. 如权利要求1?3所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在于， 所述使用方法的步骤为： 第一步：将待测样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照进行PCR扩增反应；其中， 所述PCR扩增反应以待测DNA为模板，设计针对目的基因突变位点的特异性引物，同时加入 LNA锁核酸修饰，通过对待测DNA样品中的目的基因进行偏向性PCR扩增反应； 第二步：根据仪器检测结果中Ct值和MeltCure的判读，判断所述待测样品中目的基因 的突变情况。
5. 根据权利要求4所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在于， 通过PCR扩增反应结果中扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。
6. 根据权利要求4所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在于， 所述根据Ct值和MeltCure的判读来判断待测样品中目的基因的突变情况，其具体步骤 为： 1).运行CT值的计算，无模板对照应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信号增 强；当ct值>45.0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分析试 验情况；
2.)运行内控，一般Ct值< 40. 0,可以继续分析，如果Ct值彡40. 0,则说明样品DNA降 解严重，不适合试验需要； 3) .运行阳性质控品，阳性质控的Ct值< 45. 0,熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的 范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果； 4) .符合上述条件，运行Tm calling程序，通过熔解曲线分析和Ct值，判读样本是否 存在突变：运行Tm calling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并 且Ct < 45,表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：a，无扩 增；b，有扩增，Ct > 45 ;c，有扩增，Ct < 45,但是运行Tm calling程序，熔解曲线最高峰的 Tm值不在相应突变的范围内； 5) .如果不符合上述第1、3项要求，应重做本次实验；不符合第2项要求，建议重新从 样本中提取DNA，再次检测。
7. 根据权利要求4所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在于， 所述待测DNA样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为含有EGFR、KRAS、PIK3CA基因突变 的混合质粒或者纯合质粒，所述阴性质控品为不含有EGFR、KRAS、PIK3CA基因突变的混合 质粒或者纯合质粒。
8. 根据权利要求4所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在于， 所述待测DNA为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清 或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。
9. 根据权利要求4所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在于， 所述肺癌热点基因为EGFR、KRAS、PIK3CA基因野生型和EGFR、KRAS、PIK3CA基因突变型。
10. 根据权利要求9所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在 于，所述 EGFR、KRAS、PIK3CA 基因包含 G719A、G719S、G719C、E746_A750del (1)、E746_ A750del(2)、L747_P753 > S、E746_T751 > I、E746_T751del、E746_T751 > A、E746_S752 > A、E746_S752 > V、E746_S752 > D、L747_A750 > P、L747_T751 > Q、L747_E749del、L747_ T751del、L747_S752del、L747_A750 > P、L747_P753 > Q、L747_T751 > S、L747_T751del、 L747_T751 > P、T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、 L861Q、G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、 H1047。
11. 根据权利要求4所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在于， 所述样品的DNA浓度可以低至0. 1?lng/ μ L。
12. 根据权利要求4所述的检测肺癌热点突变基因的组合物的使用方法，其特征在于， 所述PCR扩增反应的具体过程分为2个阶段： (1) 扩增反应，92?97°C预变性5?15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92?97°C变 性10?20s，50?65°C退火10?30s，70?75°C延伸10?35s，并进行35?55个循环； (2) 做熔解曲线，92?97°C预变性0· 2?5分钟，20?55°C退火0· 2?5分钟，60? 97°C采集荧光，每秒采集荧光10?30次。
【文档编号】C12N15/11GK104152551SQ201410344467
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】王弢, 李宗飞, 张利清, 张丽, 乐飚, 徐维琛 申请人:普世华康江苏医疗技术有限公司