专利名称：：一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种利用酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法。特别涉及到的是利用基因定点突变酵母细胞高灵敏度的筛选抗朊病毒药物的方法。
背景技术：
：朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害。目前，全世界的研究者们正致力于寻求建立高通量抗朊病毒药物筛选平台的研究，从而尽快研发出预防和治疗朊病毒引发疾病的药物。目前，在美国和欧洲有关抗朊病毒药物的研发领域中，主要利用动物细胞模型来筛选抗朊病毒的药物。但是由于这个筛选系统技术上的复杂性，只能局限在少数化合物中进行；更重要的是，由于这个筛选系统的实验成本过于昂贵，又具有哺乳类动物内朊病毒交叉传染的危险性，需要P3级以上的无菌实验室和大量的高级技术人员的工作才能保证药物筛选的进行，使得大规模的在已知化合物的范畴内筛选抗朊病毒药物缺乏实用的可能性。最近的研究表明，建立在野生型酿酒酵母细胞(&^c/2mw^cesce"WWae)上的抗朊病毒药物筛选模型在很大的程度上可以取代动物细胞模型，并且具有经济、简单、安全的特性。但是野生型酵母细胞作为抗朊病毒药物筛选模型仍存在着缺陷和不足由于对药物的敏感度较低，使得待测药物用量较大，并容易造成药物筛选时假阴性过高，可能漏筛某些温和型的抗朊病毒的药物。
发明内容为了解决上述问题，本发明根据野生型酿酒酵母细胞(S"cc/^nw^c^ce^T^/ae)中分子伴侣Ssalp对于朊病毒[尸S广]的调控机理，通过基因定点突变酵母细胞内分子伴侣S5^7基因，提供一个高灵敏度的抗朊病毒药物筛选的酵母细胞模型，从而降低待测药物用量，降低药物筛选时假阴性的比率，使得能在更大的范围内高通量筛选抗朊病毒药物。本发明选用的菌种是野生型酿酒酵母细胞(&cc/wro^yc"c^ev/s/"e)来自于美国标准菌种库(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),保藏编号为208719。这种酿酒酵母带有[7^广]朊病毒，固体菌落颜色为白色。本发明的技术方案是基于分子水平的朊病毒的致病机理，以及细胞内分子伴侣在朊病毒的形成过程中的调控作用原理，使用基因突变技术改造了野生型酵母细胞对抗朊病毒药物敏感度低的缺陷。本发明采用的技术方案是一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法，步骤如下1)S5^7-FS7酵母细胞的制备将野生型酿酒酵母细胞(&"/^，;;c^ce^^^)内的分子伴侣S5^/基因编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸，得到基因突变型S^X47-KW酵母细胞，其菌落颜色为粉色；2)筛选抗朊病毒药物S&47-]^7酵母细胞的活化取S&4/-ra7酵母细胞接入l/2YPD培养液中，30°C振荡过夜培养；/-ZS7酵母细胞初始OD值的调试调制/-ra7酵母细胞悬液OD600=0.5;筛选待测药物取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的5X47-FW酵母细胞悬液，在24X:的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的S&^-FS/酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养15天；检测从第一天起，隔天提取100iil前一天的冻存管中的6S47-K7酵母细胞悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好^&4/-1^酵母细胞悬液的培养皿置于24'C恒温培养箱中培养3天，再转入4'C冰箱中培养7天，观察S5L^-:KS7酵母细胞的颜色。通过6"&47-KS7酵母菌落颜色的变化观察待测药物对于朊病毒的治疗效果菌落(即S&47-KW酵母细胞)为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[尸S广]的治愈率愈率=变红的菌落数/总的菌落数x100%。SS^/-!^酵母细胞的基本生理特征对比原来的野生型酵母细胞进行定量化的评估测定相同培养条件下的<S&4/-;KS7酵母细胞与野生型酵母细胞的代时及菌落颜色的指标。结果见表l。表1酵母细胞与野生型酵母细胞的代时及菌落颜色<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*培养条件为1/2YPD，三次测定结果的平均值。本发明的有益效果是分子伴侣基因突变型5"&^-ra7酵母细胞会使该酵母对于抗朊病毒药物的敏感性产生巨大的提高，而这个基因突变对酵母细胞的正常生长及生理特征影响极小，因此可以极大地降低药物筛选过程中的假阴性。可以在活体内安全的筛选出温和型的抗朊病毒药物，为在更大范围内的寻找抗朊病毒的药物奠定基础，为寻找抗哺乳动物朊病毒药物提供了依据。同时，不仅大大降低了待测药物的用量，而且提高了筛选精确度、降低筛选成本消耗。具体实施方式实施例l1)S&47-757酵母细胞的制备(l)基因突变取野生型酿酒酵母细胞(5^cc^ramyc^ce^Ww'fle)来自于美国标准菌种库(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),保藏编号为208719，利用分子生物学上的基因操作技术，使用聚合酶链式反应(PCR)，扩增酵母细胞的分子伴侣S&4/基因，并将其分别连接到pRDW10(C/i"3)质粒和pJ120(丄五t/2)质粒载体上。利用定点突变试剂盒，将pJ120质粒上的S&47基因编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸(UUG密码子—UGG密码子)，突变后的基因启动子仍为&X4/基因的启动子，将突变后的质粒命名为pJ121。然后将突变后的SX47基因进行DNA测序确认，命名为S&^-r57。(2〉基因重组因为S&47基因为生长必须基因，首先，将带有S&47基因的pRDW10(WM3)质粒导入酵母细胞中；其次，利用同源重组技术敲除染色体基因组上的S6^7基因；然后将带有S5L^-ZS7基因的pJ121质粒导入酵母细胞；最后，利用质粒替换技术在含有5-FOA的培养基上筛选出丢失pRDW10质粒的酵母细胞，利用标签基因丄五t/2筛选出含有pJ121质粒的S5L47-r^酵母细胞，制得S&47-FS/酵母细胞。(S)重组细胞(M^-reV酵母细胞)鉴定采用在基因水平的DNA测序、mRNA逆转录测序，以及蛋白质水平的westemblot鉴定，酵母细胞的四分体表现型分析等手段进行鉴定。④保藏S5^-F^/酵母细胞使用酵母菌的常规保藏方法，保藏得到S&47-K7酵母细胞。2)模拟筛选抗朊病毒药物盐酸胍S5^7-FW酵母细胞的活化在无菌操作条件下，挑取3个以上的上述制备的S&4J-ZS7酵母细胞放入装有1/2YPD液体培养基的三角瓶中，30。C振荡过夜培养。酵母细胞初始OD值的调试取上述培养的5^/-!^酵母细胞悬液放入比色杯中，使用紫外分光光度计，用1/2YPD液体培养基调零，UV设置在600nm，测量酵母细胞悬液的OD值，加入酵母细胞悬液或1/2YPD液体培养基来调节OD值至0.5。筛选待测药物取3支无菌冻存管，分别加入含有1/2YPD培养液900^、897^1、895nl;上述调试好的SSv47-FW酵母细胞悬液各10(^l以及lmol/L的盐酸胍(Vl、3^1、5pl，使其终浓度分别为OmM、3mM、5mM。在24'C的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的S&47-KS7酵母细胞10(V1放入新的装有和上述同样含量的1/2YPD培养液和盐酸胍的无菌冻存管中。检测从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的S&4J-KS7酵母细胞悬液适量，稀释后，取10(V1稀释液在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好&&4/-}^酵母细胞悬液的培养皿置于24°(:恒温培养箱中培养3天，再转入4'C冰箱中培养7天，观察&X47-1^酵母细胞的颜色。菌落为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[尸5T]的治愈率愈率=变红的菌落数/总的菌落数x100%。结果见表2。同时，做对比实验，直接用野生型酵母细胞做盐酸胍对朊病毒的作用效果实验，步骤同6S47-:T57酵母细胞。结果见表2。从表2中可以看出SWKTW酵母细胞中，不论盐酸胍的浓度是3mM还是5mM，对于朊病毒[尸S/]的治愈率都极明显的高于的野生型酵母细胞。另外，不论盐酸胍的浓度是3mM还是5mM，5S47-:KW酵母细胞中盐酸胍对[/^/]的治愈率在第3天时就基本超过了野生型酵母细胞中第5天的治愈率。这就说明了S&^-ZW酵母细胞中朊病毒[尸S/]对药物盐酸胍的灵敏性明显高于野生型酵母细胞。表2不同浓度盐酸胍对5S47-;KW酵母细胞和野生型酵母细胞对[PS广]朊病毒的治愈率s<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*数据均为三次测定结果的平均值。实施例21)取实施例1制得的S&47-]^7酵母细胞。2)模拟筛选抗朊病毒药物菲啶(phenanthridine，phe):S5^7-ra7酵母细胞的活化同实施例1。S&47-ySi酵母细胞初始OD值的调试同实施例1。筛选待测药物在该体系中，使用0.5mM盐酸胍作为药物筛选的增效剂。取7支无菌冻存管，4支分别加入含有0.5mM盐酸胍的l/2YPD培养液900W、898.75^1、897.5^1、895|il;上述调试好的5>&4/-^5/酵母细胞悬液各10(^1;以及40mM菲啶(^1、1.25|_il、2.5pl、5^1，使每只冻存管中的药物浓度分别为0.5mM盐酸胍+OmM菲啶、0.5mM盐酸胍+0.05mM菲啶、0.5mM盐酸胍+0.1mM菲啶以及0.5mM盐酸胍+0.2mM菲啶。1支加入1/2YPD培养液895pl、上述调试好的S5^7-KS7酵母细胞悬液100fxl、40mM菲啶5pl使得冻存管中药物浓度为0.2mM菲啶+OmM盐酸胍。2支分别加入l/2YPD培养液900)al、895pl;上述调试好的5"&47-:rS7酵母细胞悬液各100nl;以及lmM的盐酸胍Onl、5^1，使其终浓度分别为OmM(用作阴性对照)、5mM(用作阳性对照)。在24"C的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的S&^-KS7酵母细胞100W放入新的装有和上述同样含量的盐酸胍的1/2YPD培养液、菲啶的无菌冻存管中。检测从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的5^^(7-r57酵母细胞悬液适量，稀释104倍后，取100iil稀释液在l/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好5&4/-;^7酵母细胞悬液的培养皿置于24"恒温培养箱中培养3天，再转入4'C冰箱中培养7天，通过5"&47-KS7酵母细胞的颜色变化，观察加入增效剂盐酸胍的不同浓度菲啶的对于朊病毒的治疗效果。菌落为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[PS/]的治愈率愈率=变红的菌落数/总的菌落数x100%。结果见表3。同时，做对比实验，直接用野生型酵母细胞做加入增效剂盐酸胍的不同浓度菲啶对朊病毒的作用效果实验，步骤同51&47-rW酵母细胞。结果见表3。从此表中可以看出在不同浓度下，同样可以看出实施例l中的结果即5>5^/-1^7酵母细胞对于朊病毒[/^/]的治愈率都极明显的高于的野生型酵母细胞；在各个有效药物浓度下，S&47-;T57酵母细胞中盐酸胍对[尸S/]的治愈率在第3天时就基本超过了野生型酵母细胞中第5天的治愈率。更重要的是，在不足以治愈[i^/]的较低浓度的盐酸胍存在时，可以增强菲啶对于[/^/]的作用效果。表3加入盐酸胍的不同浓度菲啶对5S47-FW和野生型酵母细胞[i^/^朊病毒的治愈率t生长条件治愈率ld3d5d突变型野生型突变型野生型突变型野生型OmMphe+OmMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.2mMphe+0mMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0mMphe+0.5mMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.05mMphe+0.5mMGuHCl0.56%0.00%59.07%17.78%68.87%59.49%0.lmMphe+0.5mMGuHCl1.26%0.80%99.95%32.54%94.65%96.13%0.2mMphe+0.5mMGuHCl1.50%0.67%98.19%35.61%99.32%97.20%5mMGuHCl14.80%3.90%98.10%65.070/099.60%96,71%*数据均为三次测定结果的平均值。实施例31)取实施例1制得的51Sv47-ra7酵母细胞。2)筛选待测药物酵母细胞的活化同实施例1。S&47-KS7酵母细胞初始OD值的调试同实施例1。筛选待测药物取若干支无菌冻存管，按照实施例l的模式，在总体积为lml的混合体系中分别加入一定浓度的待测药物、1/2YPD培养液以及占总体积10。/。的上述调试好的5"&47-:F57酵母细胞悬液；另取2支无菌冻存管按照实施例2分别加入1/2YPD培养液、上述调试好的S&^-I^酵母细胞悬液以及盐酸胍OmM(用作阴性对照)、5mM(用作阳性对照)。在24。C的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的^&4/-1^7酵母细胞10(^1放入新的装有和上述同样含量的1/2YPD培养液、待测药品的无菌冻存管中。检测从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的S&^-KW酵母细胞悬液适量，稀释后，取100nl稀释液在l/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSJ7-;K^酵母细胞悬液的培养皿置于24"C恒温培养箱中培养3天，再转入4'C冰箱中培养7天，通过5X47-:rW酵母细胞的颜色变化，观察不同浓度的待测药物对于朊病毒的治疗效果。菌落为红色表示在该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[户S广]的治愈率愈率=变红的菌落数/总的菌落数x100%。实施例41)取实施例1制得的S&47-FW酵母细胞。2)筛选待测药物S&47-FS/酵母细胞的活化同实施例l。S&4J-KS/酵母细胞初始OD值的调试同实施例1。筛选待测药物使用0.5mM盐酸胍作为药物筛选的增效剂，检测不同浓度梯度的待测药物对朊病毒[/^/]的作用效果。取若干支无菌冻存管，按照实施例2的模式，在总体积为lml的混合体系中加入一定浓度的待测药物、含有0.5mM盐酸胍的l/2YPD培养液以及占总体积10。/。的上述调试好的S&47-FW酵母细胞悬液；另取2支无菌冻存管按照实施例2分别加入1/2YPD培养液、上述调试好的S^7-:rW酵母细胞悬液以及盐酸胍0mM(用作阴性对照)、5mM(用作阳性对照)。在24X:的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的5^4/-}^7酵母细胞10(^1放入新的装有和上述同样含量的含盐酸胍的1/2YPD培养液、待测药物的无菌冻存管中。检测从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的s&47-;rw酵母细胞悬液，稀释后，取100nl稀释液在l/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好5>>^/-:^7酵母细胞悬液的培养皿置于24。C恒温培养箱中培养3天，再转入4'C冰箱中培养7天，通过S&^-yS/酵母细胞的颜色变化，观察在增效剂盐酸胍存在时，不同浓度的待测药物对于朊病毒的治疗效果。菌落为红色表示在该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[i^/1的治愈率愈率=变红的菌落数/总的菌落数x100%。1权利要求1、一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法，其特征在于步骤如下1)SSA1-YS1酵母细胞的制备将野生型酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae)内的分子伴侣SSA1基因编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸，得到基因突变型SSA1-YS1酵母细胞，其菌落颜色为粉色；2)筛选抗朊病毒药物SSA1-YS1酵母细胞的活化取SSA1-YS1酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃振荡过夜培养；SSA1-YS1酵母细胞初始OD值的调试调制SSA1-YS1酵母细胞悬液OD600＝0.5；筛选待测药物取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1～5天；检测从第一天起，隔天提取100μl前一天的冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSA1-YS1酵母细胞悬液的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，观察SSA1-YS1酵母细胞的颜色。全文摘要本发明公开了一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法。采用的技术方案是将野生型酿酒酵母细胞内的分子伴侣SSA1基因编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸，得到基因突变型SSA1-YS1酵母细胞；然后经SSA1-YS1酵母细胞的活化；初始OD值的调试；制备筛选待测药物检测溶液；从第一天起，隔天提取适量SSA1-YS1酵母细胞悬液稀释后平板涂布；置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，观察SSA1-YS1酵母细胞的颜色。本发明极大地降低药物筛选过程中的假阴性，不仅待测药物的用量少，而且提高了筛选精确度、降低了筛选成本消耗。文档编号C12Q1/18GK101481729SQ200910010219公开日2009年7月15日申请日期2009年1月21日优先权日2009年1月21日发明者尧宋,宋有涛,辉李申请人:辽宁大学