专利名称：一种低产氨基甲酸乙酯葡萄酒酵母的筛选及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术食品与酿酒工程技术领域，是现代生物和化工工程技术与传统酿造工程技术的有机结合，是对目前葡萄酒生产中使用的葡萄酒酵母的性能改进而创造出一种适用于葡萄酒生产并能显著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量的葡萄酒酵母的筛选方法及其应用。
背景技术：
随着我国经济发展和人民生活水平的提高，人们对食品保健和质量安全越来越重视。葡萄酒属富含营养并具保健作用的绿色饮品。20世纪90年代以来，我国葡萄酒的生产量、消费量均快速增长。葡萄酒产量从2000年20. 19万吨增长到2008年120多万吨，已跃居世界第六位。伴随着葡萄酒行业的快速发展，葡萄酒市场激烈竞争和国外葡萄酒对我国市场冲击也很严重。EC被发现是一种潜在致癌物以来，备受世界各国食品主管部门关注， 近年来各国食品安全部门有关EC的报道也不断出现。我国作为发酵食品和酒精饮料生产和消费大国更应该重视EC问题，应该合理设置葡萄酒贸易技术壁垒，防止国外EC含量高的葡萄酒进入我国市场，抵御或缓解国际葡萄酒市场对我国的冲击和挑战，保护我国葡萄酒消费者的利益及我国葡萄酒行业。与此同时急需对我国发酵食品和酒精饮料(尤其是葡萄酒)生产工艺的改进而创造出一种适用于葡萄酒生产并能显著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量的葡萄酒酵母的筛选方法。根据目前国内外的研究资料，一般认为葡萄酒中EC形成主要与两种前体物质有关，既尿素和瓜氨酸。尿素和瓜氨酸在复杂的酒体环境中会乙醇自发反应生成EC。反应式如图1。尿素和瓜氨酸在葡萄酒中的积累分别是葡萄酒酵母iSaccheiromyces cererisiae)和葡萄酒MLB乳酸菌对葡萄汁中精氨酸代谢的结果。葡萄酒中EC的形成的生物学机理主要与两条途径有关，即酵母的尿素循环途径和MLB的精氨酸脱亚氨基酶途径。另外，也有研究表明所有的氨甲酰类化合物都可能是EC的前体物质，这主要包括尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氨甲酸、天冬氨酸、尿囊素等。EC的形成与葡萄酒酿造时加入的营养添加剂及和发酵、陈酿、贮藏温度和时间也有关系。目前国内外葡萄酒生产中降低可能形成EC的前体物质一氨甲酰类化合物(主要包括尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氨甲酸、天冬氨酸、尿囊素等)含量的方法主要有
(1)葡萄种植者提供葡萄藤叶中氮含量平均降低40%的葡萄植株，和尽量减少施用尿素、氨氮类复合肥。(2)葡萄酒酵母代谢精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特异性。所以有人提出选育不分泌尿素或分泌尿素量低的酵母菌株，特别是选育精氨酸酶活力低或用分子育种手段获得精氨酸酶缺陷型酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含量的主要措施之一。英属哥伦比亚大学葡萄酒研究中心的专家发现，用他们改进的专利产品白兰地发酵剂生产的葡萄酒中EC 含量比其它发酵剂生产的少839Γ89%。
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(3)苹果酸-乳酸发酵菌(MLB)的精氨酸代谢及瓜氨酸分泌也具有菌株特异性， 在进行MLB葡萄酒降酸时，应选择精氨酸代谢途径很弱或代谢中没有瓜氨酸分泌的菌株， 以尽量降低葡萄酒苹果酸-乳酸发酵阶段EC的产生。法国和阿根廷已经完成O. oeni和 L. hilgardii的arc基因簇全序列测序，这将为抑制MLB的精氨酸代谢研究提供更多的信息，但没有选育成功实例报道。(4)选择合理得酿造工艺，不向葡萄汁中添加过量的含氮营养剂，葡萄酒的陈酿、 贮藏、运输尽量在低温下进行也是减少EC产生量的方法。综上所述采用某种筛选方法，分离选育不分泌尿素或分泌尿素量低的酵母菌株， 特别是选育精氨酸酶活力低下菌株，是可以降低葡萄酒中EC含量的。本专利通过以下筛选方法，分离筛选出一株能显著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量的葡萄酒酵母菌株，从而完成了发明。
发明内容
本发明的一个目的是公开了一种低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母 Bl (F-15A1—Bi)编号 FI5-1-5 菌株(CGMCCN04727)。该菌株能显著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量。其保藏地点是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间2011年4月1日，拉丁名称免⑶力狀傭凡^ cererisiae，它具有的生理、生化特征如下
(1)观察菌株形态为奶油色(浅黄色)至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。(2)诱变结果及稳定性试验低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母刀豆氨酸抗性菌株Bi，编号为FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)，在同样条件下诱导精氨酸酶，测定原始菌株 (F-15-A1)和 Bl (F-15A1—Bi)编号 FI5-1-5 菌株(CGMCCN04727)的精氨酸酶活如附 16 图所示，原始菌株的比活力大约是Bl (F-15-A1-B1)，编号FI5-1-5的6倍。本发明的另一个目的是公开了低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母B1(F-15A1-B1) 编号FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)的筛选方法。本发明还一个目的是公开了低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母B1(F-15A1-B1)编号FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)在作为葡萄酒发酵剂方面的应用。为实现上述目的，本发明提供了低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母Bl (F-15A1-B1) 编号FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)菌株的筛选方法，该方法包括以葡萄酒酵母为出发菌株， 经紫外线一吖啶橙诱变，筛选获得刀豆氨酸抗性FI5-1-5菌株；其过程如下
(1)以活性干酵母F-15和从葡萄园分离出葡萄酒酵母G-1，并在混合培养基上长出单菌 F-15-A1 ；
(2)筛选获得刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1经活化培养，其条件为取新鲜培养的斜面菌苔一环，加入盛有10mL，5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38、0°C水浴中活化2(T30min，直至
有大量气泡产生；
(3)将上述培养活化后的菌株，接种至含有刀豆氨酸、精氨酸、鸟氨酸的混合氨基酸初筛培养基中进行培养；
(4)挑取可在混合氨基酸初筛培养基上生长的菌落，分别移接至精氨酸、鸟氨酸复筛培
5养基中培养；
(5)选择在精氨酸复筛培养基中不能生长，而在鸟氨酸复筛培养基中可以生长的菌种为所需的刀豆氨酸抗性菌株Bi，编号为FI5-1-5菌株(CGMCCNQ4727)；
(6)将分离出来的刀豆氨酸抗性菌株Bi，接种YEPD液体培养基活化Mh后，吸取0.ImL 菌液涂布在混合培养基培养3d，在混合培养基上可以长出菌落的菌株进行保存。本发明所述的经紫外线一吖啶橙诱变的方法是取生长良好的F-15-A1种子液， 在紫外照射90s，然后把600 μ L经过紫外诱变的菌悬液接入到含有5mL诱变培养基的试管中30°C避光水浴振荡培养1 ；其中诱变培养基中含有lmg/mL吖啶橙，剂量分别为80 μ L， 100 μ L, 150 μ L, 200 μ L, 250 μ Lo本发明所述的初筛培养基指的是琼脂培养基和刀豆氨酸培养基其中琼脂培养基为2%琼脂，洲葡萄糖，50mL纯水在115°C灭菌15min，50°C水浴保温；刀豆氨酸培养基为1. 7g/L YDB (酵母氮源基础培养基)，Img刀豆氨酸，10. OmM鸟氨酸，IOmM精氨酸，纯水 50MmL，过滤灭菌于50°C水浴保温；将这两种培养基混合，迅速到平板即制得初筛培养基。本发明所述的精氨酸、鸟氨酸复筛培养基成分为(1)精氨酸培养基1.7g/L YDB (酵母氮源基础培养基)，IOmM精氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂；(2)鸟氨酸培养基 1. 7g/L YDB, IOmM 鸟氨酸，20g/L 葡萄糖，20g/L 琼脂。本发明所述的筛选方法，其中还包括验证精氨酸酶活低的葡萄酒酵母，该验证步骤和方法为将活性干酵母F-15和F-15-A1和Bl分别接种到YEPD (酵母完全培养基)中， 30°C过夜培养，发酵液5000r/min离心5min收集菌体，用无菌水洗3次，转接到精氨酸酶诱导培养基上30°C培养证，测定活性干酵母F-15、F-15-A1和Bl的精氨酸酶的活性，每个菌株作三个重复，1个精氨酸酶的活力单位定义为在PH9.5及37°C下，在0. IM精氨酸溶液中， 每min产生Inmol鸟氨酸所用酶的量。其中还包括验证氨基甲酸乙酯低的葡萄酒酵母，该验证步骤和方法为 (1)模拟葡萄汁发酵的验证步骤和方法
①模拟葡萄汁培养配制储液A 在375 mL蒸馏水中加入葡萄糖100g，果糖100g，定容至500mL ；储液B 在250mL蒸馏水中加入L-酒石酸6g，L-苹果酸3g，柠檬酸0. 5 g ；储液 C 在250mL蒸馏水中加入无硫酸氨的氮基础培养基1. 7g，肌醇6 mg,氯化钙0. 2g，磷酸铵 lg, L-精氨酸0. 8g, L-脯氨酸lg，DL-色氨酸0. Ig ；将储液A、B、C混合后用氢氧化钾调节 pH至3. 25，过滤除菌；
②模拟葡萄汁发酵将编号为FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)斜面保存的菌苔转接到装有50mL模拟葡萄汁培养基的三角瓶中，在30°C，150r/min条件下过夜培养；然后再将 50mL过夜培养物转接到500mL模拟葡萄汁培养基中，在下静置厌氧发酵5 7天，发酵结束后取样测定氨基甲酸乙酯含量；
本发明被筛选的葡萄酒酵母F-15-A1、G-1为未经基因修饰的酵母；筛选出的编号为 FI5-1-5菌株是经过基因修饰的。其中筛选出的F-15-Al、G-l、FI5-l-5菌株(CGMCCN。4727) 酵母已具备精氨酸酶活性低的性质，都能获得低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母。本发明筛选出的F-15-A1、G-1、和 Bl (F-15A1—B1)编号 FI5-1-5 菌株 (CGMCCN04727)酵母已具备精氨酸酶活性低的性质。也就是说每株都能或多或少地降低葡萄酒的氨基甲酸乙酯的含量。
本发明通过特定的筛选方法，分离筛选出一株能显著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯 (EC)含量的葡萄酒酵母菌株。具体的研究过程如下
1、发明理论依据和思路
根据测定中国四大葡萄酒产区不同葡萄品种的氮源与EC相关性可知，精氨酸的代谢与EC的形成相关性最大，因此通过研究酵母对精氨酸的代谢途径来降低EC的生成量。如图2所示，精氨酸被酵母分解为尿素和鸟氨酸，而尿素是一种氮源代谢的重要产物，这种化合物可以与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯，所以在发酵培养基中尽可能消除或减少尿素的生成量，而菌株和发酵温度对于最终发酵液中的尿素水平有显著影响。图2显示了在酵母菌中精氨酸分解代谢和转运相关的基因，CANl编码的专一性转运蛋白对精氨酸进行转运， GAPl编码的转运蛋白不仅可以对精氨酸进行转运，还可以对其他氨基酸进行转运。精氨酸降解的第一步是由精氨酸酶(CAR1编码)催化的，生成鸟氨酸和尿素。尿素被尿素酰胺解酶 (DUR1，2编码产生，一种双功能酶)催化而进一步代谢。尿素酰胺解酶有两方面的活性尿素羧化产生尿基甲酸(Allophanate)，和水解尿基甲酸，生成2分子朋3和1分子C02。许多其它微生物都有脲酶的作用，直接降解尿素生成2分子NH3和1分子C02。酵母属的酵母不具有脲酶活性。这样带来的问题是，酵母由于生理的原因而需要两步反应才能降解尿素。在这个途径中尿素羧化酶需要能量和一种基本的维生素(生物素)来催化尿素的降解。因此在缺乏能量和维生素的情况下，尿素就不能被酵母降解。这种方式的优点是将过量的氮源以 (相对无毒的)尿素的形式通过尿素促进扩散通透酶释放出去，而不是生成(毒性较大的)铵离子，另外铵离子也不易释放出去，因为至今还未见有铵离子促进扩散系统的报道。如上所述，酵母属的酵母倾向于快速吸收培养基中的可供氮源，有时也能造成细胞内含氮物质浓度过高。排出尿素的能力的功用是，通过产生一种低毒性并且在生理和环境条件许可时易于重新吸收的含氮化合物，来调节细胞内含氮化合物的总水平。酵母这样代谢也会产生另一个结果，那就是增大了在发酵后期释放的尿素会与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯概率。精氨酸的生物合成是通过细胞内的代谢网络进行的，该代谢网络由众多的酶催化相互关联的一系列化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。在酵母中L-精氨酸的合成是从谷氨酸开始的，经历一个由8种酶的催化的合成途径，L-精氨酸是合成途径的最终产物，合成途径如图3所示
精氨酸合成途径的调控体系是一个负控制阻遏体系，与精氨酸生物合成有关的结构基因形成精氨酸调节子，精氨酸合成有关的八个酶是由九个基因所编码，这九个基因组成五个操纵子，它们可以接受同一个调节基因argR发出的信号，从而进行协调活动。除此之外， 精氨酸调节子上还有一个argP基因，它编码鸟氨酸、赖氨酸的运输蛋白。调节基因argR所编码的阻遏物蛋白必须与辅阻遏物精氨酰-tRNA结合才能被活化，活化的阻遏物蛋白复合物阻遏精氨酸调节子的转录，但它对各个基因的转录的抑制效应不同。由于微生物合成精氨酸的途径不同，其合成的调节机制也不同。在酵母中，被精氨酸抑制的关键酶是合成途径的第2个酶一乙酰谷氨酸激酶，或第五个酶一乙酰鸟氨酸乙酰转移酶，其余的酶受精氨酸的阻遏。根据上面对精氨酸分解代谢和合成代谢途径的分析，选育出一株低产氨基甲酸乙酯的酿酒酵母，筛选思路如下
第一种筛选思路筛选出的酵母不能利用精氨酸，从而不能产生尿素，氨基甲酸乙酯的
7量也就会相应的减少。但是在一般的葡萄汁中的主要氨基酸是脯氨酸和精氨酸，而脯氨酸降解的第一步是在线粒体中进行的，需要分子氧作为氢的受体。在厌氧发酵条件下，脯氨酸不能作为氮源利用。如果酵母再不能利用精氨酸，就会导致氮源缺乏，发酵终止或不完全。 因此这种完全使酵母不能利用精氨酸的筛选思路不可行。第二种筛选思路酵母属的酵母能在细胞内可以积累大量氨基酸，碱性氨基酸和中性氨基酸被大量存在于液泡中，这种亚细胞结构隔开了酶和它们的底物，这样更能适应氨基酸的代谢调节机制。液泡的这种隔离作用使得细胞能迅速地吸收培养基中可利用的氮源，并将氮源储存在液泡中，然后在需要时通过调节向细胞质中的释放速率来利用这些物质。考虑到环境因素，酵母的调节方式似乎更好，因为酵母需要保证在培养基中积累乙醇的情况下对抗强大的质子流，这种快速吸收培养基中可供氮源的方式是酵母与其他不能采用这种方式积累和储存氨基酸的微生物竞争的强大手段。因此我们可以筛选出的酵母具有很低的精氨酸酶活，使精氨酸进行缓慢代谢，这样酵母就不会由于快速利用精氨酸产生大量尿素，细胞对于产生的少量尿素也能进行进一步的降解，因此细胞向环境排出的尿素减少， 相应的产生氨基甲酸乙酯的量也就减少了，从而达到我们筛选低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母的目的。根据第二种筛选思路选育一株精氨酸酶(CAR1编码)酶活相对较低的菌株，可以利用结构类似物的抗性进行选育，选育结构类似物抗性突变株，也是代谢控制发酵育种的主流。因此选用L-刀豆氨酸作为L-精氨酸的结构类似物(如附图4)做抗性筛选。在各种含有精氨酸的有机体中，精氨酸一tRNA合成酶错误地将刀豆氨酸认为精氨酸，刀豆氨酸随即合成到初期的多肽中，含刀豆氨酸的的蛋白质最终会打乱RNA和tRNA的正常代谢。这些含有L-刀豆氨酸的蛋白质在结构和作用方面存在缺陷，形态和生长上出现异常，如蛋白质的组成和结构的变异，酶活性的减弱，细胞对热、辐射或其它刺激物的承受能力的降低。这些已经改变了生理活性、结构异常的蛋白质会破坏细胞生长所必需的关键过程。可靠实验表明合成功能紊乱的包含L-刀豆氨酸的蛋白质是L-刀豆氨酸具有抗代谢性的重要基础。正是L-刀豆氨酸被细胞选择性地吸收破坏了细胞生长所必需的蛋白质，使L-刀豆氨酸起到抗代谢的作用。根据上面的分析，设计出一个筛选平板(混合培养基)对于精氨酸代谢正常的酿酒酵母来说(精氨酸酶酶活高)，精氨酸和刀豆氨酸一起进入细胞，由于精氨酸被精氨酸酶快速代谢，刀豆氨酸与精氨酸一tRNA合成酶结合，这样导致合成功能紊乱的包含L-刀豆氨酸的蛋白质，破坏细胞的生长；而对于精氨酸代谢异常的酿酒酵母(精氨酸酶酶活低)，虽然精氨酸和刀豆氨酸一起进入细胞，但由于精氨酸酶活低，不能很快的对精氨酸进行代谢，细胞内积累的精氨酸与刀豆氨酸竞争结合精氨酸一tRNA合成酶，这样导致的结果是一方面刀豆氨酸不能与精氨酸一tRNA合成酶结合，不能合成有缺陷的蛋白，从而不能破坏细胞的生长；另一方面精氨酸的积累，精氨酸与精氨酸一tRNA合成酶结合，激活调节基因argR所编码的阻遏物蛋白，活化的阻遏物蛋白复合物阻遏精氨酸调节子的转录，造成氮源向其它途径代谢而不合成精氨酸。将细胞悬浮液涂布在混合培养基平板上，在30°C条件下培养三天，如果长出菌落说明CARl发生突变，精氨酸酶没有活性或是活性很低；如果没有菌落长出，说明CARl未发生突变，细胞内没有精氨酸的积累，因此刀豆氨酸抑制了细胞的生长。这样就可以在混合培
8养基的平板上筛选出CARl突变的菌株。 为了防止所筛出的菌株发生的是CANl突变，因此需要进行验证。把在混合培养基上长出的菌落分别接种到鸟氨酸培养基和精氨酸培养基上，如在精氨酸培养基上不长或生长微弱而在鸟氨酸培养基上长说明是CARl发生的突变。如在两个培养基上都长，有可能 CANl发生了突变，使得刀豆氨酸不能进入细胞内，因此可以在混合培养基上生长。
综上所述设计三个筛选平板
1).鸟氨酸培养基1.7 g/L YDB，IOmM鸟氨酸，20 g/L葡萄糖；
2).精氨酸培养基1.7 g/L YDB，IOmM精氨酸，20 g/L葡萄糖；
3).混合培养基1.7 g/L YDB, 10mg/L刀豆氨酸，IOmM鸟氨酸，IOmM精氨酸，20 g/L 葡萄糖。2.本发明的操作流程如附图5所示 (1)出发菌株的获得
①从国内外葡萄酒活性干酵母生产厂商收集索取20多种样品。②从国内河北沙城怀涿盆地葡萄产区、河北昌黎葡萄产区、山东烟台葡萄产区和天津蓟县葡萄产区等地采集的葡萄皮上分离出的各种野生葡萄酒酵母。③由目前葡萄酒工厂生产使用的葡萄酒酵母菌株经化学诱变获得的突变株。(2)目的菌株的筛选
出发菌株一活性葡萄酒干酵母的活化一筛选平板分离(混合培养基平板)一CANl突变验证(鸟氨酸培养基平板和精氨酸培养基平板)一精氨酸酶活检测一精氨酸酶活低的菌株。(3)低产氨基甲酸乙酯菌株的发酵实验
精氨酸酶活低的菌株一模拟葡萄汁发酵(发酵性能及氨基甲酸乙酯检测)一生产性葡萄汁发酵(发酵性能、氨基甲酸乙酯及葡萄酒香气成分的检测)一获得保持优良发酵性能， 酿制的葡萄酒香气好并具有低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌株。本发明菌株的特征如下
(1)采用代谢控制发酵理论与经验结合酵母菌的尿素、精氨酸的代谢途径，巧妙地设计刀豆氨酸(精氨酸的结构类似物)抗性平板，和CANl突变验证平板，能快速、高通量地分离筛选出低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌株。(2)低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌F15-1-5菌株，经精氨酸酶活检测其活性是出发菌株的1/6 10 ；以模拟葡萄汁为原料，测定比较出发菌株和？15-1-5(06110队4727) 菌株发酵原酒的氨基甲酸乙酯含量，发现EC含量刀豆氨酸抗性菌株FI5-1-5(CGMCCNq4727) 比原始菌株下降57. 48% ；潜在EC含量下降65. 25 ；它在工业生产葡萄汁发酵中，显示能很好利用果糖、葡萄糖，菌体生长和酒精生成速率高等优良酿造特性，并能保持原酒的香气成分。本发明的优点和有益效果为
1、本发明是现代保健食品和传统酿造工程技术的有机结合，它是应用酵母的代谢及代谢控制理论设计的，能快速、高通量地从葡萄酒活性干酵母、酿酒葡萄产区的中分离出的各种野生葡萄酒酵母以及葡萄酒酵母的诱变菌株中分离筛选出低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌株。2、本发明筛选出的葡萄酒酵母F15-1-5菌株，能完全适用于目前国内葡萄酒(干
9红、干白葡萄酒)的生产工艺，既不需作任何的工艺过程和操作的改变，又不需添加或改造生产设备，就能应用于葡萄酒的工业化生产，生产性能优良，产品保持原有风味的基础上， 显著降低氨基甲酸乙酯的含量。本发明技术先进、应用价值高，具有极高的社会和经济效益。
图1为乙醇自发反应生成EC的反应式； 图2为精氨酸的分解代谢和转运图3为精氨酸生物合成途径；图中的酶1.乙酰谷氨酸合成酶2.乙酰谷氨酸激酶3.乙酰谷氨酸半醛脱氢酶4.乙酰鸟氨酸转氨酶5.乙酰鸟氨酸酶6.鸟氨酸转氨甲酰酶7.精氨酸琥珀酸合成酶8.精氨酸琥珀酸酶9.乙酰鸟氨酸转移酶10.氨基甲酰磷酸合成酶(CPS)； 图4为L-精氨酸与L-刀豆氨酸的结构图； 图5为低产氨基甲酸乙酯葡萄酒酵母(CGMCCNJ727)选育流程图； 图6为混合培养基； 图7为鸟氨酸基本培养基(Al); 图8为精氨酸基本培养基(Al); 图9为鸟氨酸基本培养基(A2)； 图10为精氨酸基本培养基(A2)； 图11为WL营养培养基筛选出菌株形态； 图12为混合培养基上筛选出菌株；
图13为紫外线一吖啶橙诱变后在混合培养基上长出Bl菌株； 图14为鸟氨酸基本培养基(Bi); 图15为精氨酸基本培养基(Bi)； 图16为精氨酸酶活比较图； 图17为干红葡萄酒酿造工艺流程图。
具体实施例方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中刀豆氨酸有市售； F15活性干酵母有市售；鸟氨酸和精氨酸有市售；吖啶橙有市售。实施例1 1.菌种的活化
取市售F15活性干酵母0. 2g，加入盛有10mL5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38、0°C水浴中活化2(T30min，直至有大量气泡产生。2.将活化后的干酵母液0.1 mL涂布在混合培养基上，在30°C条件下培养三天， 如附图6所示
3.把在混合培养基上长出的单菌落Al和A2挑出放入盛有无菌水的试管中，通过稀释分离法再把0. 1 mL菌液涂布在混合培养基中进行单菌落的分离。4.为了防止所筛出的菌株发生的是CAm突变，因此需要进行验证。把在混合培养基上长出的单菌落分别接种到鸟氨酸培养基和精氨酸培养基上，如在精氨酸培养基上不长或生长微弱而在鸟氨酸培养基上长说明是CARl (精氨酸酶编码基因)发生的突变。如在两个培养基上都长，有可能CANl (精氨酸酶编码基因)发生了突变，使得刀豆氨酸不能进入细胞内，因此可以在混合培养基上生长，如附7、8、9、10图所示
5.将初筛获得的酿酒酵母属酵母Al扩培后按5%的接种量接种入2. 5L广口瓶里，总装液量为1.8L，用葡萄汁进行小容器发酵试验。比较初筛菌株的发酵速率和所获得酒的理化指标与工业对照菌株之间的差别，从而得出比较理想的能够适合与工业生产上发酵的菌株。实施例2
1.自然发酵酵母的分离
在葡萄园中多点收集葡萄浆果，除梗破碎后装入灭过菌或熏硫的容器中自然发酵，自发酵旺盛至发酵结束，每三天接种一次，吸取0. ImL涂布在YEPD (酵母完全培养基.)培养基上，在30°C培养箱培养2-3d，挑取单菌落保存。2. WL营养培养基筛选
WL营养培养基是被设计用来监测饮料发酵过程中的微生物类群。研究表明，在葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型的酵母菌种都可以用WL营养培养基进行区分，主要基于菌落颜色及菌落形态。酿酒酵母属酵母在WL营养培养基上生长的菌落颜色及其形态表现为奶油色带绿色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油状。将分离出来的酵母菌株，接种 YEPD液体培养基活化24h后接种到WL营养培养基，27°C培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色(浅黄色)至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。得到符合酿酒酵母在WL营养培养基上菌落颜色及形态的菌株进行保存，如附图11所示
3.将分离出来的酵母菌株，接种YEPD液体培养基活化24h后，吸取0.ImL菌液涂布在混合培养基培养3d，在混合培养基上可以长出菌落的菌株进行保存，如附图12所示
4.为了防止所筛出的菌株发生的是CANl突变，因此需要进行验证。把在混合培养基上长出的单菌落分别接种到鸟氨酸培养基和精氨酸培养基上，如在精氨酸培养基上不长或生长微弱而在鸟氨酸培养基上长说明是CARl发生的突变，并进行保存。如在两个培养基上都长，有可能CAm发生了突变，使得刀豆氨酸不能进入细胞内，因此可以在混合培养基上生长。5.小容器酿酒试验
将初筛获得的酿酒酵母属酵母G-I扩培后按5%的接种量接种入2. 5L广口瓶里，总装液量为1.8L，用葡萄汁进行小容器发酵试验。比较初筛菌株的发酵速率和所获得酒的理化指标与工业对照菌株之间的差别，从而得出比较理想的能够适合与工业生产上发酵的菌株。将理化检测结果中酒精度大于9% (V/V)、残糖小于4g/L、挥发酸小于0.6g/L的原酒判定为合格，则其相应的酿酒酵母判定为符合工业发酵的要求。
实施例3 1.菌种的活化
取F-15-A1斜面的菌苔接入盛有10mL5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38、0°C水浴中活化2(T30min，直至有大量气泡产生。2.紫外线一吖啶橙诱变取生长良好的F-15-A1种子液，在紫外照射90s，然后
11把600 μ L经过紫外诱变的菌悬液接入到含有5mL诱变培养基的试管中30°C避光水浴振荡培养12h。(诱变培养基中含有lmg/mL吖啶橙，剂量分别为80 μ L，100 μ L，150 μ L，200 μ L， 250 μ L)；
3.将诱变后酵母菌液液0.1 mL涂布在混合培养基上，在30°C条件下培养3d，如附图 13所示把在混合培养基上长出的单菌落B1(F-15-A1-B1)挑出放入盛有无菌水的试管中， 通过稀释分离法再把0. 1 mL菌液涂布在混合培养基中进行单菌落的分离。4.为了防止所筛出的菌株发生的是CAm突变，因此需要进行验证。把在混合培养基上长出的单菌落分别接种到鸟氨酸培养基和精氨酸培养基上，如在精氨酸培养基上不长或生长微弱而在鸟氨酸培养基上长说明是CARl发生的突变。如在两个培养基上都长，有可能CAm发生了突变，使得刀豆氨酸不能进入细胞内，因此可以在混合培养基上生长，如附图14、15所示
5.将活性干酵母F-15-A1和诱变获得的刀豆氨酸抗性菌株Bl (F-15-A1-B1)分别接种到YEPD中，30°C过夜培养，发酵液5000r/min离心5min收集菌体，用无菌水洗3次，转接到精氨酸酶诱导培养基上30°C培养证，测定活性干酵母F15和Bl的精氨酸酶的活性。每个菌株作三个重复。1个精氨酸酶的活力单位定义为在PH9. 5及37°C下，在0. IM精氨酸溶液中，每min产生Inmol鸟氨酸所用酶的量。在同样条件下诱导精氨酸酶，测定原始菌株和 Bl的精氨酸酶活如附图16所示，原始菌株的比活力大约是Bl的6倍，这也证实在前面酵母初筛时进行的验证试验，Bl在精氨酸基本培养基上有缓慢的生长，说明Bl还是有精氨酸酶活。实施例4
1.将上述分离或诱变筛选出来的刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1、G-1和Bl (F-15-A1-B1) 按照实施列3的操作方法测定它们的精氨酸酶活性，获得菌株的精氨酸酶活性最低，仅为原始菌株的1/10，被编号为刀豆氨酸抗性菌株B1(F-15A1-B1)编号FI5-1-5菌株 (CGMCCN04727)。2.将分离出来的刀豆氨酸抗性菌株F15-1-5，接种YEPD液体培养基活化24h后， 吸取0. ImL菌液涂布在混合培养基培养3d，在混合培养基上可以长出菌落的菌株进行保存。3.为了防止所筛出的刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1-B1在传代过程中发生的是CANl 突变，因此需要进行验证。把在混合培养基上长出的单菌落分别接种到鸟氨酸培养基和精氨酸培养基上，如在精氨酸培养基上不长或生长微弱而在鸟氨酸培养基上长说明是CARl 发生的突变，并进行保存。如在两个培养基上都长，有可能CANl发生了突变，使得刀豆氨酸不能进入细胞内，因此可以在混合培养基上生长。不断地在进行上述纯化。4.模拟葡萄汁发酵 ①模拟葡萄汁培养配制
储液A 在375 mL蒸馏水中加入葡萄糖100g，果糖100g，定容至500mL ； 储液B 在250 mL蒸馏水中加入L-酒石酸6g，L-苹果酸3g，柠檬酸0. 5g ； 储液C 在250 mL蒸馏水中加入无硫酸氨的氮基础培养基1. 7g，肌醇6mg，氯化钙 0. 2g，磷酸铵lg，L-精氨酸0. 8g，L-脯氨酸lg，DL-色氨酸0. Ig ；
将储液A、B、C混合后用氢氧化钾调节pH至3. 25，过滤除菌。特别加以注意的是培
12养基须现用现配，储液A、B、C混合Ia1后会出现沉淀。②模拟葡萄汁发酵
将一环(菌苔)刀豆氨酸抗性菌株FI5-A1-B1斜面保存的菌苔转接到装有50mL模拟葡萄汁培养基的三角瓶中，在30°C，150r/min条件下过夜培养。然后再将50mL培养物转接到500mL模拟葡萄汁培养基中，在下静置厌氧发酵5 7天，发酵结束后取样测定氨基甲酸乙酯含量，发现EC含量刀豆氨酸抗性菌株F-I5-A1-B1 (CGMCCN04727)比原始菌株下降 57. 48% ；潜在EC含量下降65. 25% 实施例5
1.小容器酿酒试验
将刀豆氨酸抗性菌株F-I5-A1-B1 (CGMCCN04727)扩培后按5%的接种量接种入2. 5L广口瓶里，总装液量为2L。将发酵红葡萄酒的广口瓶放在18°C恒温箱中进行小容器发酵试验。2.选取烟台君顶酒庄葡萄园生产的蛇龙珠葡萄进行的酿造实验，酿造工艺流程 (属于常规的酿造方法)分别如附图17所示；发酵结束后测定残糖均很低，小于4g/L，酒精度均大于9% (V/V)，因此筛选出来的菌株都符合工业发酵的要求。发酵完成后澄清过滤所得的干红原酒，取样测定氨基甲酸乙酯含量和香气成分及含量。结果如下(1)刀豆氨酸抗性菌株FI5-A1-B1(CGMCCNq4727)比原始菌株下降 61. 87% ； (2)刀豆氨酸抗性菌株FI5-A1-B1 (CGMCCN04727)发酵的原酒的香气成分及含量和原始菌株基本吻合，没有发生改变。
权利要求
1.一种低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母FI5-1-5菌株，其保藏号为CGMCCN04727。
2.权利要求1所述菌株的筛选方法，该方法包括以葡萄酒酵母为出发菌株，经紫外线一吖啶橙诱变，筛选获得刀豆氨酸抗性FI5-1-5菌株；其过程如下(1)以活性干酵母F-15和从葡萄园分离出葡萄酒酵母G-1，并在混合培养基上长出单菌 F-15-A1 ；(2)筛选获得刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1经活化培养，其条件为取新鲜培养的斜面菌苔一环，加入盛有10mL，5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38、0°C水浴中活化2(T30min，直至有大量气泡产生；(3)将上述培养活化后的菌株，接种至含有刀豆氨酸、精氨酸、鸟氨酸的混合氨基酸初筛培养基中进行培养；(4)挑取可在混合氨基酸初筛培养基上生长的菌落，分别移接至精氨酸、鸟氨酸复筛培养基中培养；(5)选择在精氨酸复筛培养基中不能生长，而在鸟氨酸复筛培养基中可以生长的菌种为所需的刀豆氨酸抗性菌株Bi，编号为FI5-1-5菌株(CGMCCNQ4727)；(6)将分离出来的刀豆氨酸抗性菌株Bi，接种YEPD液体培养基活化Mh后，吸取0.ImL 菌液涂布在混合培养基培养3d，在混合培养基上可以长出菌落的菌株进行保存。
3.权利要求2所述的筛选方法，其中所述经紫外线一吖啶橙诱变的方法是取生长良好的F-15-A1种子液，在紫外照射90s，然后把600 μ L经过紫外诱变的菌悬液接入到含有 5mL诱变培养基的试管中30°C避光水浴振荡培养1 ；其中诱变培养基中含有lmg/mL吖啶橙，剂量分别为 80 μ L, 100 μ L, 150 μ L, 200 μ L, 250 μ Lo
4.权利要求2所述的筛选方法，其中步骤(3)中所述的初筛培养基指的是琼脂培养基和刀豆氨酸培养基其中琼脂培养基为 琼脂，洲葡萄糖，50mL纯水在115°C灭菌 15min, 50°C水浴保温；刀豆氨酸培养基为1. 7g/L YDB, Img刀豆氨酸，10. OmM鸟氨酸，IOmM 精氨酸，纯水50MmL，过滤灭菌于50°C水浴保温；将这两种培养基混合，迅速到平板即制得初筛培养基。
5.权利要求2所述的筛选方法，其中步骤(4)中所指的精氨酸、鸟氨酸复筛培养基成分为⑴精氨酸培养基1.7g/L YDB，10mM精氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂；(2)鸟氨酸培养基:1.7g/L YDB，10mM鸟氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂。
6.权利要求2-5任一项所述的筛选方法，其中还包括验证精氨酸酶活低的葡萄酒酵母，该验证步骤和方法为将活性干酵母F-15和F-15-A1和Bl分别接种到YEPD中，30°C过夜培养，发酵液5000r/min离心&nin收集菌体，用无菌水洗3次，转接到精氨酸酶诱导培养基上30°C培养证，测定活性干酵母F-15、F-15-A1和Bl的精氨酸酶的活性，每个菌株作三个重复，1个精氨酸酶的活力单位定义为在PH9. 5及37°C下，在0. IM精氨酸溶液中，每min 产生Inmol鸟氨酸所用酶的量。
7.权利要求2-5任一项所述的筛选方法，其中还包括验证氨基甲酸乙酯低的葡萄酒酵母，该验证步骤和方法为模拟葡萄汁发酵的验证步骤和方法①模拟葡萄汁培养配制储液A 在375 mL蒸馏水中加入葡萄糖100g，果糖100g，定容至500mL ；储液B 在250mL蒸馏水中加入L-酒石酸6g，L-苹果酸3g，柠檬酸0. 5 g ；储液C 在250mL蒸馏水中加入无硫酸氨的氮基础培养基1. 7g，肌醇6 mg,氯化钙0. 2g，磷酸铵 lg, L-精氨酸0. 8g, L-脯氨酸lg，DL-色氨酸0. Ig ；将储液A、B、C混合后用氢氧化钾调节 pH至3. 25，过滤除菌；②模拟葡萄汁发酵将编号为FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)斜面保存的菌苔转接到装有50mL模拟葡萄汁培养基的三角瓶中，在30°C，150r/min条件下过夜培养；然后再将 50mL过夜培养物转接到500mL模拟葡萄汁培养基中，在^TC下静置厌氧发酵5 7天，发酵结束后取样测定氨基甲酸乙酯含量。
8.权利要求2-4所述的筛选方法，其中被筛选的葡萄酒酵母F-15-A1、G-1为未经基因修饰的酵母；筛选出的编号为FI5-1-5菌株是经过基因修饰的。
9.权利要求2所述的筛选方法，其中筛选出的F-15-A1、G-I、FI5-1-5菌株 (CGMCCN04727)酵母已具备精氨酸酶活性低的性质，都能获得低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母。
10.权利要求1所述的低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母FI5-1-5菌株(CGMCCN04727) 在作为葡萄酒发酵剂方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母的筛选方法及在葡萄酒生产中应用。此方法采用精氨酸的结构类似物—刀豆氨酸抗性平板，可从自然界分离的、市售售(商品)活性干酵母以及化学诱变剂诱变的突变株中筛选出低产氨基甲酸乙酯的菌株。此法是应用酵母氨基酸代谢理论设计的，方法简便，能快速分离并获得目的菌株。本发明将获得刀豆氨酸抗性菌株B1，编号为FI5-1-5菌株(CGMCC NO.4727)应用于小型发酵容器葡萄酒的酿造中，在具备优良的葡萄酒酿造性能的基础上，能有效地显著降低葡萄酒生产中的氨基酸甲酸乙酯的含量,具有工业化生产应用的潜力。
文档编号C12N15/01GK102220252SQ20111012948
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者张健, 李磊, 王德培, 高年发, 高强 申请人:天津科技大学