专利名称：具有转化虎杖苷为白藜芦醇的虎杖茎内生菌j1的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种虎杖内生菌，尤指一种与虎杖的共发酵条件下可将虎杖中的虎杖苷转化为白藜芦醇的虎杖茎内生菌JI。
背景技术：
虎杖中白黎芦醇是一种天然活性多酚物质，具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基等作用，它已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一，是继紫杉醇以后的又一绿色抗癌物质。虎杖中白黎芦醇往往以虎杖苷的形式存在，干燥虎杖根茎中白黎芦醇含量仅为 0. 1% -0.2%，而虎杖苷含量约2%，虎杖苷在肠道中糖苷酶作用下分解为白黎芦醇，发挥其药理作用。国内关于通过对虎杖中虎杖苷进行转化以提高白黎芦醇含量的报道较多，如自然酶解法、复合酶酶解法、及用纤维素酶对粗提取虎杖苷进行酶解；国外有学者采用提纯的葡萄糖苷酶对虎杖苷进行转化；还有用酸碱水解法分别对虎杖苷进行分解。以上方法专一性低、操作较繁琐，成本高、转化率低(1.23%-1.68%)，并对环境造成污染。而，从天然资源中采取化学等方法提取有效成分费时、费力、浪费资源，因此，微生物转化法逐渐应用于天然产物的研究中。但至今未见有关利用植物内生菌或人肠道内细菌对虎杖进行转化的报道。因此从筛选虎杖内生菌或人肠道内细菌对虎杖进行转化具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种虎杖茎内生菌J1，该菌与虎杖的共发酵下，可将虎杖中的虎杖苷转化为白藜芦醇。本发明所述的虎杖茎内生菌J1，其分类命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum) J1，已于2011年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO. 4559。本发明菌株Jl的菌落形态在肉眼下观察到本发明菌株Jl在CYA培养基上培养7d后，菌落直径35mm 左右；菌落表面形成大量的孢子，颜色为深绿色；菌落边缘不整齐，中央突起，无渗出液，无特殊气味，菌落背面黄色，见图1。在MEA培养基上培养7d后，直径达10mm-15mm，菌落菌落边缘呈锯齿状，无渗出液，无特殊气味，菌落背面黄色，见图2。在G25N培养基上生长局限，28°C培养7d后，直径7mm-10mm。菌落外围白色，中间有少量的青灰色孢子，菌落背面浅黄色，见图3。在CA培养基上培养7d后，直径观_35讓，菌落边缘不整齐；菌丝白色，表面有少量黄色溢出物，菌落背面黄色，见图4。用SDS法提取本发明菌株的DNA，采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，获得扩增片段，扩增片段测序。序列经GenBank中BLAST同源性比对，结果表明本发明菌株与登陆号为FJ977097. 1的草酸青霉(Penicillium oxalicum)同源性最高，相似性为99%，结合菌落形态和显微特征结果，可以判定本发明菌株为草酸青霉(Penicillium oxalicum)的一个新种,命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum) Jl。将本发明菌株Jl接入10%虎杖煮提液(pH自然)中，经本发明菌株与虎杖的共发酵可转化虎杖中的虎杖苷为白藜芦醇，发酵条件为菌株孢子悬浮液浓度lX106CFU/mL， 接种量为10%，温度为27-29°C，160-200rpm摇床发酵培养84-96h。较佳的发酵条件为菌株孢子悬浮液浓度lX106CFU/mL，接种量为10%，温度为^°C，转速为180rpm，发酵时间为 96h。如此，通过微生物发酵可直接将虎杖中的虎杖苷转化为白藜芦醇，不需要进行虎杖苷的提取，可节约成本，减少对环境的污染。
图1是本发明菌株在CYA上培养7d后的菌落图。图2是本发明菌株在MEA上培养7d后的菌落图。图3是本发明菌株在G25N上培养7d后的菌落图。图4是本发明菌株在CA上培养7d后的菌落图。图5是虎杖苷标样(40 μ g/ml) HPLC图(图中1指虎杖苷标准曲线)。图6是白藜芦醇标样(40 μ g/ml)HPLC图(图中2指白藜芦醇标准曲线)。图7是发酵前培养液中虎杖苷、白藜芦醇含量HPLC检测图谱。其中曲线1指虎杖苷，曲线2指白藜芦醇。图8是发酵后的发酵液中虎杖苷、白藜芦醇含量HPLC检测图谱。其中曲线1指虎杖苷，曲线2指白藜芦醇。
具体实施例方式实施例1将从湖南省涟源田心坪村采集的野生虎杖取茎杆，用无菌水冲洗干净，然后用灭菌滤纸吸干水分。(以下无菌操作)75%乙醇浸泡消毒3 5min，无菌水冲洗3 4次， 0. 升汞消毒30s，再用75%乙醇消毒lmin。将根、茎秆韧皮部切去，取木质部用无菌剪刀剪成0.5cmX0.5cm的小块。无菌水冲洗3 4次，于灭菌的研钵中研磨成浆液。研磨浆液无菌水稀释10倍后，移取Iml研磨稀释液，在初筛培养基上常规涂布。每种材料平行3次， 分别在培养72 120h，挑选长势良好的不同形态菌落于PDA平板上划线分离，28°C培养7 后，取单菌落3次重复划线分离，得到纯化的本发明菌株转接到PDA斜面保藏备用。实施例2采用HPLC法检测发酵液中虎杖苷和白藜芦醇含量对照品溶液的配制和标准曲线绘制精密称取白藜芦醇和虎杖苷标准品0. 2mg于ImL甲醇中，混勻，得含白藜芦醇、虎杖苷0. 2mg/mL对照品储备液，备用。精密吸取对照品溶液100，200，300,400, 500 μ L用甲醇稀释至ImL中，混勻，制成不同浓度的对照品。按色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积 Y为纵坐标，进样浓度X为横坐标，绘制标准曲线，见图5和图6，并计算回归方程。样品溶液制备
将本发明菌株Jl接入10%虎杖煮提液(pH自然)中(孢子悬浮液浓度IX IO6CFU/ mL，接种量为10%，装液量100mL/250mL三角瓶)J8°C，180rpm摇床中发酵培养96h。发酵液IOOOOrpm离心IOmin后，取上清液100 μ L，0. 45 μ m微孔过滤后，加900 μ L甲醇稀释，混
勻，备用。含量测定精密称取样品溶液，按色谱条件进样，平行3次，根据峰面积计算样品溶液中虎杖苷、白藜芦醇含量，见图8。发酵前培养液中虎杖苷、白藜芦醇含量的HPLC检测见图7，其中， 虎杖苷浓度为44. 164μ g/ml，白藜芦醇浓度为6. 364μ g/ml。色谱条件流动相甲醇水GO 60)，色谱柱=ODS-C18柱(150mmX4. 6mm, 5 μ m)，流速0. 6mL/min,进样量10 μ L，紫外检测波长306nm,柱温为25 °C。结果显示每次设置3个平行对照，对比色谱图，可以看出虎杖苷的吸收峰面积明显减小，白黎芦醇的吸收峰面积明显增加，这与标准品色谱图为对照是一致的，且通过计算可知，发酵液中虎杖苷浓度为8. 817 μ g/ml、白藜芦醇浓度为25. 348 μ g/ml，转化率为 75 %，这充分证明了本发明菌株与虎杖的共发酵可转化虎杖苷为白藜芦醇。本文中提及的培养基的配制初筛培养基=MgSO40. 5g，NaNO3 5g，FeSO4 0. Olg, KH2PO4 lg，琼脂 18g，加 10%虎杖煮提液至lL，pH自然。查氏母液(Czapek concentrate) =NaNO3 30g，KCl 5g，MgSO4 ·7Η20 5g，FeSO4 ·7Η20 0. lg, ZnSO4 · 7Η20 0. lg, CuSO4 · 5Η20 0. 05g，蒸溜水 100mL。查氏酵母膏琼脂(CzapekYeast Extract Agar, CYA) =K2HPO4 l.Og，查氏母液 IOmL,酵母粉5g，蔗糖30g,琼脂15g，蒸馏水IL0麦芽汁琼脂(Malt Extract Agar, MEA)麦芽膏20g，蛋白陈1. 0g,葡萄糖20g,琼脂20g，蒸馏水IL025%甘油硝酸盐琼脂(25% Glycerol Nitrate Agar, G25N) =K2HPO4 0. 75g，查氏母液7. 5mL,酵母粉3. 7g，甘油250g，琼脂12g，蒸馏水750mL。查氏(CzapekAgar, CA) =NaNO3 3g, K2HPO4 lg, MgSO4 · 7H20 0. 5g, KCl 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. 01g，蔗糖 30g，琼脂 15g，蒸馏水 IL0
权利要求
1.一种虎杖茎内生菌株，其分类命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum) J1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2011年1月17日，保藏编号为 CGMCC NO. 4559。
2.一种发酵法制备转化虎杖苷为白藜芦醇的发酵液的方法，其特征在于发酵所用菌株为权利要求1所述的菌株；发酵所用培养基为10%虎杖煮提液，pH自然；发酵条件为菌株孢子悬浮液浓度lX106CFU/mL，接种量为10%，温度为27- °C，转速为160-200rpm，发酵时间为84-%h。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵条件为菌株孢子悬浮液浓度 lX106CFU/mL，接种量为10%，温度为^°C，转速为180rpm，发酵时间为％h。
4.如权利要求2或3所述方法得到的转化虎杖苷为白藜芦醇的发酵液。
全文摘要
一种虎杖茎内生菌株，其分类命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)J1，已于2011年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.4559。将本发明菌株接入虎杖煮提液的培养基中，可转化虎杖中的虎杖苷为白藜芦醇，从而可直接将虎杖苷通过微生物发酵转化为白藜芦醇，不需要进行虎杖苷的提取，可节约成本，减少对环境的污染。
文档编号C12P7/22GK102212486SQ20111012895
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者刘华金, 夏菠, 易有金 申请人:湖南农业大学