专利名称：一种编码缺刻缘绿藻δ-6脂肪酸延长酶的dna序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA序列，具体地说，是一种编码缺刻缘绿藻Δ -6脂肪酸延长酶的DNA序列及其应用。
背景技术：
ArA (花生四烯酸，arachidonic acid，20 4n_6)是人类营养的一种必需脂肪酸，与二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA，22 6n_3)等一样都是人脑膜磷脂的主要成分，同时还有其它许多生理学及药理学活性。例如，它在细胞内发挥第二信使作用，参与造血免疫调节，引起血管舒张，参与肝、胆等器官多种功能的调节，是内循环系统和中枢神经系统中起重要作用的前列腺素和白介三烯的前体。ArA还是成熟母乳的一种重要成分，它对产后婴儿的视力和智力发育都是必需的。因此，FA0/WH0 (1994)推荐在婴儿奶粉中添加 ArA0目前ArA的商业来源主要是海洋鱼油和动物脏器，但两者含量都很低，分别只占干重的0. 2%和0. 5%，而真菌发酵生产ArA存在生产成本高、发酵周期长等缺点。微藻能够利用简单的无机盐为营养，吸收并转化光能，固定CO2，在细胞内合成并积累大量ArA。缺刻缘、缘佩Myrmecia incisa)是一种单细胞绿藻，属于绿藻门、jTrebouxiophyceae纲，细胞常聚集在一起形成类似非定形群体的细胞团。缺刻缘绿藻能够大量合成并积累ArA，尤其是在氮饥饿条件下，ArA含量可以达到藻体干重的7%甚至21%，而且95%以上的ArA是以三酰甘油(triacylglyceroLTAG)的形式贮存在细胞中，它们占脂肪酸总量的60%。这种藻不仅是目前已知藻类中ArA含量最高的物种，与其它含有多不饱和脂肪酸(PUFA)如DHA、EPA的藻类相比，缺刻缘绿藻的PUFA含量也是最高的。因此缺刻缘绿藻极有希望成为利用大型光生物反应器以工业化规模生产ArA的潜在物种。微藻中存在两条合成ArA的途径，即ω 6途径中的“ Δ 6途径”和“ Δ 8途径”。PUFA 的从头合成是从C18:ln-9开始，八12去饱和酶作用生成(18:2"9’12。在经典的“Δ6途径” 途径中，α8:2Δ9’12去饱和为α8:3Δ6’9’12，再延长为020:3"8'11'14和去饱和生成020:4"5'8'11'14 (ArA)0而在可替代的“ Δ8途径”途径中，α8:2Δ9’12延长为C20 2Δ11’14，再在去饱和酶作用下先后生成ε20:3Δ8’"’14和ArA。每条途径中延长酶和去饱和酶基因都是合成中的关键酶。 在氮饥饿限制下，ArA的合成和大量累积与这些基因的活性调节和功能有着必然的联系。中国专利文献CN1017M637A公开了一种球等鞭金藻Δ9延长酶的核苷酸序列及其应用，该发明涉及一种从产DHA的球等鞭金藻中分离的编码Δ9延长酶的核苷酸序列及其应用。中国专利文献CN1625597A公开了一种新的延长酶基因及多不饱和脂肪酸的制备方法，该发明涉及一种具有一序列的延长酶基因，或其同系物、衍生物或类似物，还涉及多不饱和脂肪酸的制备方法。但是关于编码缺刻缘绿藻△-6脂肪酸延长酶的DNA序列及其应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种编码缺刻缘绿藻△ -6脂肪酸延长酶的DNA序列。本发明的再一的目的是，提供一种重组表达载体。本发明的另一的目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。本发明的第四个目的是，提供以上所述DNA序列、重组表达载体和基因工程化的宿主细胞的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种编码缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶的DNA序列，所述的DNA序列包括
a、SEQID NO. 10所述的核苷酸序列，或
b、与a所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种重组表达载体，所述的载体是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。所述的载体是pYES2载体。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种基因工程化的宿主细胞， 所述的宿主细胞选自于下列一种宿主细胞
a、用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞；
b、用权利要求4所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。所述的宿主细胞是酵母细胞。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是所述的DNA序列、所述的重组表达载体或所述的宿主细胞在生产多不饱和脂肪酸中的应用。本发明优点在于
1、本发明通过对缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶基因的分子克隆和功能鉴定，证明了该基因编码的是Δ-6脂肪酸延长酶；
2、本发明为提高油料作物合成长链多不饱和脂肪酸的能力提供了理论基础，理论上可以将本发明的基因转入油料作物中，能够有效地延长￥-亚麻酸((18:3"6’9’12， y-linolenic acid, GLA)等花生四烯酸合成必需的前体物质，使这些油料作物具有合成长链多不饱和脂肪酸的能力，以提高其品质。
附图1是5 ‘-和3 ‘-末端RACE扩增的电泳图谱。M: DL 2000分子量标准； 5'-末端产物长度为913 bp ;3'-末端产物长度为634 bp。附图2是基因DNA全长结构示意图。附图3是GC-MS检测酵母的脂肪酸组成。A 没有添加底物的；B 添加GLA (C18:3A6,9,12) ;C 添加SDA (C18:4A6,9,12,15) ；& :野生型对照组；b 转空载体对照组；C 含有
MiFAE的转基因酵母Y-MiFAE。箭头指示的是添加外源的脂肪酸底物，粗箭头指示其产物。附图4是附图3中两个产物的质谱鉴定。1和2分别表示两个产物DGLA和ETA的质谱鉴定。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。 实施例1、材料
1)缺刻缘绿藻incisa Reisigl H4301)来自 CAUP (Culture collection of algae of Charles University of Prague)。在温度为 25°C、光照强度为 115 μ mol photons m_2 s—1、光/暗比为12h/12h的条件下培养，培养基为BG-Il。2)pYES2载体和酵母 INVScl 菌株(His\LeiT Jrp-及 togf 缺陷型)购自 hvitrogen 公司。酵母在YPD培养基(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖培养基)，于30°C下以220 rpm转速振荡培养。2、方法
1)取100 mg新鲜的藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。2 ) CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取基因组DNA和TRIzo 1法抽提总 RNA，-20°C保存备用。3)根据cDNA文库中筛选得到的延长酶基因的表达序列标签(EST)设计引物 5R417 (5' -RACE) CTTCCGAGTGTTCCCTCTTGCTTCTGTG (SEQ ID NO. 1)
3R18 (3' -RACE) AACCCTCACTCAGTTCCAGATGTTCCAG (SEQ ID NO. 2) 利用 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)方法扩增 5'-端和 3'-端片段。首先按照说明书操作步骤合成5' -RACE和3' -RACE的cDNA，然后应用下列反应体系和程序进行5'-端和3'-端的PCR扩增。5'-端20 μ L的反应体系包含13. 8 μ L的PCR级水、 2.0 μ L 的 IOXAdvantage 2 PCR 缓冲液、0. 4 μ L 的 dNTP、0. 4 μ L 的 5R417 (5' -RACE) (10 μΜ)、2·0 yL 的 10XUPM、1 yL 的 5' -RACE cDNA 及 0. 4 μ L 50 X Advantage 2 聚合酶混合液。3'-端的反应体系除0.4 yL的3R18 (3' RACE) (10 μ Μ)和1 yL的 3' -RACE cDNA外，其它的同5'-端反应体系。PCR反应程序为94°C预变性3 min，35个循环包含94°C变性30 s、68°C退火30 s、72°C延伸2 min，最后72°C延伸7 min。PCR产物胶回收后连接pMD19T载体，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，菌落PCR验证，菌液送到上海桑尼生物科技有限公司测序得到基因片段的序列。4)根据拼接后的序列设计引物
MiFATGGCATTGACGGCGGC (SEQ ID N0. 3)
MiRTTACTGCGGCTTTTGCTTG (SEQ ID NO. 4)
6SenseGGGAAAGCCGCTGTAACCCTCAC (SEQ ID NO. 5)
Antisense ATGCGGACAGCCACTTGCCCCAG (SEQ ID NO. 6) 其中，引物MiF和引物MiR是以cDNA为模版进行PCR扩增得到基因的ORF (开放阅读框)。25 μ L的PCR扩增反应体系包含2. 5 μ L的PCR缓冲液、2 yL&dNTP、2 μ L的Mg2+、 2 μ L的cDNA模版、引物pYF和ρ 各1 μ L、0. 25 μ L的7 《酶及14. 5 yL无菌水。PCR反应程序为94°C预变性5 min，35个循环包含94°C变性30 s、68°C退火30 s及72°C延伸2 min，最后72°C延伸10 min。引物6sense和Antisense是以DNA为模版进行PCR扩增得到延长酶基因的DNA全长。25 PL的PCR扩增反应体系包含2. 5 μ L的PCR缓冲液(Mg2+)、 2 μ L&dNTP、l μ L 的DNA 模版、引物6sense 和 Antisense 各 1 μ L、0. 2 μ L 的 7 《酶及 17. 3 μ L无菌水。PCR反应程序为94°C预变性5 min, 35个循环包含94°C变性30 s、65°C 退火30 s及72°C延伸2 min，最后72°C延伸10 min。以上PCR产物均做TA克隆，送上海桑尼生物有限公司测序得到产物序列。5 )根据pYES2载体和MiFAE基因的ORF序列(SEQ ID NO. 7 )设计引物 ρYF cgGAArrCAAAATGGCATTGACGGCGGC (SEQ ID NO. 8)
ρYR gc/TT^TTACTGCGGCTTTTGCTTG (SEQ ID NO. 9)
它们含有限制性内切酶历·ζ /ΙΙΙ (pYF)和feoRI (pYR)的酶切位点(斜体)。25 yL的 PCR扩增反应体系包含2. 5 μ L的Ex 7 《缓冲液、2 μ L的dNTP、2 μ L的Mg2+、2 yL的 cDNA模版、引物pYF和pYR各1 μ L、0. 25 μ L的Ex 7 《酶及14. 5 yL无菌水。扩增条件为94°C预变性5 min，;35个循环包含94°C变性30 s、69°C退火30 s、72°C延伸2 min，最后 72°C延伸10 min。PCR产物做TA克隆，送上海桑尼生物有限公司测序保证序列的准确性。6)从大肠杆菌DH5 α中抽提pMD19T_MiFAE质粒，用限制性内切酶历/7 /ΙΙΙ和 ^oRI进行双酶切消化反应，同时对pYES2质粒也进行历ii/IIIRI双酶切反应。反应体系为 4 PL 的 10 X H 缓冲液，4 μ L 的 0. 1% BSA，DNA 彡 2 μ g，历iiZIII 及各 1 μ L， 加无RNase水至20 μ L。37°C消化反应4 h。割胶回收酶切后的目的片段，并用T4 DNA连接酶将酶切后的i/Z/^i 片段与PYES2片段连接得到重组载体pY-MiFAE。连接反应体系为 2. 5 μ L 的缓冲液，DNA 约 0. 3 pmol (.MiFAE 基因片段)，载体 DNA 约 0. 03 pmol (pYES2 片段)，1 UL的T4 DNA连接酶，加无RNase水至25 μ L。16°C连接过夜。连接后转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，按照上述方法进行克隆、菌落PCR验证和测序。从大肠杆菌DH5ci中抽提pY-MiFAE质粒，_20°C保存备用。7)酵母感受态细胞制备。将酵母接种于YPD培养基中，30°C复苏培养过夜，然后按 1:100放大培养，以250 rpm转速振荡培养至细胞密度约为IXlO8 cells/mL (约4 5 h)。 冰上冷却15 min使细胞停止生长，4°C条件下以5 000 rpm转速离心5 min收集酵母细胞， 预冷无菌水洗涤细胞2次，同样条件下离心收集。20 mL预冷的1 M山梨醇洗涤细胞1次， 然后溶于0.5 mL预冷的1 M山梨醇，调整细胞的浓度在IXIOki cells/mL。冰上保存细胞 (或是4°C)，便于电击使用。8)电穿孔仪(Bio-Rad)电击，将重组的载体pY_MiFAE转化酵母INVScl感受态细胞。取在冰上预冷的待转化的DNA (pY-MiFAE)约5 10 μ L (5^200 ng)与感受态细胞混勻，并与0. 2 cm的电击杯一起冰上预冷，然后将DNA-细胞混合液转移到预冷的电击杯轻轻混勻，冰浴5 min后，选择程序Sc2电击一次，移走电击杯，立刻加入1 mL预冷的IM山梨醇， 轻轻转移到新的YPD培养基中，30°C轻微振荡5 h，将菌液涂布于含有1 M山梨醇的尿嘧啶缺陷合成培养基(SC-U)上，30°C倒置静置培养48-72 h，挑取菌落于液体SC-U培养基中培养。菌落PCR验证后，用含21葡萄糖或21棉籽糖的SC-U培养基保存菌种。9)将保存的菌液接种YPD培养基中，30°C下以220 rpm转速振荡培养。然后离心收集菌液，重悬于洲半乳糖的YPD培养基中，分别加入亚油酸、α-亚麻酸、Υ-亚麻酸和SDA等底物至终浓度为0. 005% (170 μ M-180 μ Μ)，并加入表面活性剂1% Tergitol type NP-40，30°C下以180 rpm转速振荡培养48 h。离心收集酵母菌体，经去离子水洗涤3次后液氮冻存。10)将液氮冻存的酵母冷冻干燥，然后进行脂肪酸甲酯化。称取约25 mg酵母粉末于酯化瓶中，加入2 ml含洲硫酸的甲醇溶液。充氮气后，于85°C水浴锅酯化反应1 h， 便于将结合的脂肪酸分子充分解离并甲基化。酯化反应后，向上述酯化瓶中分别加入1 mL 去离子水和1 mL正己烷，充分混勻，然后在5500 rpm下离心10 min。收集上清液至样品瓶中，氮气浓缩，4°C保存备用。11)采用Angilent 6890 plus型气相色谱仪进行脂肪酸组成分析，色谱柱为HP-5 型毛细管柱(30 mX0.25 mm)；升温程序为50°C保留1 min，25°C/min升温至200°C，然后 3°C/min升温至230°C，最后保留18 min ；分流比为50:1 ；氮气、氢气、空气的流速分别为30 mL/min、450 mL/min、40 mL/min。进样量为 1 μ L012) GC-MS检测生成的产物
确认由Δ 6脂肪酸延长酶作用生成的产物，采用GC-MS检测。GC 的色谱柱为 HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox (30 m X 250 ymXO. 25 μ m) 连接MS四极杆，150 C (最大值200 C)。升温程序50°C保持1 min，以10°C /min升到 150°C保持1 min，然后再以4°C /min升到250°C保持3 min，运行时间40 min。氦为载气体，初始值50°C，压力7.6522 psi，流速1 mL/min，平均速率36. 445 cm/sec，滞留时间 1.3719 min，流速1 mL/min,运行时间40 min。MS采集参数选用EMV模式，跟踪检测的离子能为69. 922eV03.结果
1)利用RACE扩增得到M/MF基因的ORF(SEQ ID NO. 7)，cDNA和DNA全长序列为(SEQ ID NO. 10)，请参照附图1和附图2，在GenBank上序列登录号EU846098和FJ851689。i///^万基因的DNA全长序列中有三段内含子，从全长序列的第509位开始为第一段内含子，见SEQ ID NO. 11 ；从全长序列的第673位开始为第二段内含子，见SEQ ID NO. 12 ；从全长序列的第 786位开始为第三段内含子，见SEQ ID N0. 13。2)选用pYES2载体通过限制性内切酶Λ /7 /ΙΙI和的基因操作成功的构建了 MiFAE基因的表达载体pY-MiFAE。将JfoT^万基因放在pYES2载体的GALl启动子下游，应用半乳糖诱导基因过表达。3)采用电穿孔仪电击的方法成功的将重组的表达载体pY-MiFAE转化酵母INVkl 中。pYES2载体上有编码尿嘧啶的UM3基因，酵母INVScl是His—、LeiT、Trp\ Ura缺陷型菌株，因此转入pY-MiFAE质粒的酵母能够在尿嘧啶缺陷的合成培养基(SC-U)上生长。4)培养基中添加外源底物，经半乳糖诱导后，GC-MS检测甲酯化的脂肪酸，请参照附图3和附图4。结果显示始州万基因表达产物在酵母中能将外源γ-亚麻酸(α8:3Δ6’9’12) 和C18:4Δ6'9'12'15分别延长为C203Δ8’“’14和C204Δ8’“’14’17，且转化效率分别为24%和似％ (表1)。但是i///^万基因编码蛋白对亚油酸(C18:2"9’12)和0-亚麻酸((18:3"9’12’15)没有延长作用(表1)。以上结果证明iZ/拟万基因编码的脂肪酸延长酶对底物具有选择特异性，该基因编码的是Δ-6脂肪酸延长酶。表1转基因酵母Y-MiFAE在添加不同脂肪酸底物培养后，细胞中脂肪酸组分(占总脂肪酸的％)的比较
_ IoOO未添AD C^fPi j ι iftteKIII LA(18 2 ) 2211Μ0Λ96 | 13 812+0 525ΑΙΑ(1 3s 3) 18 ·0 S51ijLACl8 .!ω ) 19 742+0 05SDA(18 46)3) 2+0 SMtl 545Ιβ ω ι41 24±1078 J 212SS±3^6523.53 !) 13623JS ±L0418 004 234±QJ39 J 5 052+011352St±00 35J43+JIIS5 3 27+ 0 2 1 218 Iwfl1 146+0 82 J 12 74+t\.>710Λ5+0 55210-758+0595525IS JGC.— J 2S 206+2 S52ISJoJ31 T2S+0.60 ISIefi— 丨-23 861+0 IS ΙΖ4@3- l·3 W± I !J320 '2 <ι- l·10 3β320 3 β— - 4SS±8 0e2204β3ι N1U15ι sao WS 41 05
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种编码缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括a、SEQID NO. 10所述的核苷酸序列，或b、与a所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述的载体是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述的载体是PYES2载体。
4.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自于下列一种宿主细胞a、用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞；b、用权利要求4所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。
6.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是酵母细胞。
7.根据权利要求1所述的DNA序列、权利要求2或3所述的重组表达载体或权利要求 4或5所述的宿主细胞在生产多不饱和脂肪酸中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种编码缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶的DNA序列，所述的DNA序列包括a、SEQIDNO.10所述的核苷酸序列，或b、与a所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明还提供该核苷酸序列的重组表达载体和基因工程化的宿主细胞及其用途。本发明优点在于通过对缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶基因的分子克隆和功能鉴定，证明了该基因编码的是Δ-6脂肪酸延长酶；为提高油料作物合成长链多不饱和脂肪酸的能力提供了理论基础，理论上可以将本发明的基因转入油料作物中，能够有效地延长γ-亚麻酸等花生四烯酸合成必需的前体物质，使这些油料作物具有合成长链多不饱和脂肪酸的能力，以提高其品质。
文档编号C12N1/15GK102226196SQ20111012826
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者于水燕, 刘士成, 吴洪, 周志刚, 李慧 申请人:上海海洋大学, 新奥科技发展有限公司