专利名称：一种编码缺刻缘绿藻δ15脂肪酸去饱和酶的dna序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA序列，具体地说，是一种编码缺刻缘绿藻Δ 15脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用。
背景技术：
ω 3 长链多不饱和脂肪酸(ω 3 polyunsaturated fatty acid, ω 3 PUFA)主要包括 α -亚麻酸(α-Iinolenic acid，C183Δ9’ 12’ 15，ALA)、二十碳五烯酸(eicosapentenoic acid, 020:5Δ5' 8’ “’ 14’ 17，ΕΡΑ)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，C206Δ4’ 7’ “’ 13’ 16' 19, DHA)。它在人体中有多种生理学及药理学活性，可预防心脑血管疾病、抑制肿瘤生长等。例如，DHA和EPA参加到神经元细胞膜的卵磷脂中，使细胞膜的液态流动性变好，通透性增加；DHA对大脑神经细胞的分裂、增殖、神经传导、突触的生长和发育起着重要的作用， 是大脑合成和智商开发的必需物质，尤其对婴儿的视力及神经发育非常关键。ω 3 PUFA还可降低多核白细胞及肥大细胞膜磷脂中花生四烯酸(arachidonic acid, C20:4"5’ 8' “’ 14， ArA)的含量，使过敏反应发生时其释放量减少，从而降低白三烯的生成，减少炎症。虽然ω3 PUFA对人体健康具有重要的作用，但是ω3 PUFA却是人类的必需脂肪酸，即人体自身并不能合成ω3 PUFA，而必须从食物中获得。因海产品中ω3 PUFA的含量较高，因此，目前ω3 PUFA的商业来源主要是海产品，如市场上的鱼油。但鱼油存在腥味重、口感不佳、含胆固醇及芥酸等缺点，再加上海洋鱼类资源的不足，因而寻找合适的ω3 PUFA原料是营养学、卫生学、生物学等方面研究人员急待解决的问题。其中，植物中的ALA在合适的酶催化下，可转化为EPA和DHA，同样具有鱼油类似功能，且性质稳定、易获取、不含胆固醇和芥酸等特点，因而近来对植物ALA的研究特别重视与关注。缺刻缘绿藻i/^im)是一种单细胞绿藻，属于绿藻门、 Trebouxiophyceae纲，细胞常聚集在一起形成类似非定形群体的细胞团。研究发现该藻含有ALA、EPA等ω 3 PUFA,与其他微藻比较，该藻PUFA含量较高，有利于通过微藻生物反应器工业化生产PUFA，实现微藻产品的高值化。在微藻的PUFA合成代谢途径中，微藻脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase， FAD)是PUFA合成的关键酶类，而ω 3脂肪酸去饱和酶(ω 3 fatty acid desaturase, ω 3 FAD)则是微藻FAD中的一种。在微藻中，ω 3 FAD主要包括Δ 15 FAD、Δ 17 FAD等。其中 Δ 15 FAD可催化缺刻缘绿藻的亚油酸(linoleic acid,C182Δ9' 12，LA) Δ 15位去饱和转化为ALA，A17 FAD可催化缺刻缘绿藻的ArA产生EPA，从而进入ω 3 PUFA代谢途径。因此， 克隆和鉴定微藻PUFA合成的关键酶类——ω 3 FAD，对通过基因工程方法大规模生产ω 3 PUFA意义重大。中国专利文献CN 200710300675. 8，公告日2011年9月7日，公开了一种海洋
微藻△ 5脂肪酸去饱和酶、其编码基因其应用，该发明提供的一种海洋微藻△ 5脂肪酸去饱和酶可有效地催化ETA (20:4Δ8’"’14’17)生成EPA (20:5Δ5’8’"’14’17)；中国专利文献CN200810115245. 3，公告日2010年12月22日，公开了一种海洋微藻Δ 6脂肪酸去饱和酶、其编码基因其应用，该发明提供的一种海洋微藻△ 6脂肪酸去饱和酶可有效地催化LA生成 SDA (18:4Δ6’9’12’15)。但是关于编码缺刻缘绿藻Δ 15 FAD的DNA序列及其应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种编码缺刻缘绿藻△ 15脂肪酸去饱和酶的DNA序列。本发明的再一的目的是，提供一种重组表达载体。本发明的另一的目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。本发明的另一的目的是，提供一种上述DNA序列、重组表达载体和宿主细胞的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是 所述的DNA序列包括
(a)SEQ ID NO. 10所述的核苷酸序列，或
(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是
所述的载体是由上述核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。所述的质粒是pYES2质粒。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是 所述的宿主细胞选自于下列一种宿主细胞
(a)用上述核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞； (b )用上述重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。所述的宿主细胞是酵母细胞。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是
所述的DNA序列、所述的重组表达载体或所述的宿主细胞在生产长链多不饱和脂肪酸中的应用。所述的长链多不饱和脂肪酸是ω 3长链多不饱和脂肪酸。所述的长链多不饱和脂肪酸是α -亚麻酸。本发明优点在于
1、本发明克隆了缺刻缘绿藻的ω 3 FAD基因并对其进行了功能鉴定，证实其可以编码 Δ 15 FAD酶，将LA催化成为ALA。2、本发明为阐明缺刻缘绿藻的PUFA合成代谢途径奠定了基础。3、本发明为提高油料作物合成PUFA的能力提供了理论基础，为在生物体内进行遗传操作以实现《3 PUFA的高效合成创造了条件，如将该基因转入到油料作物中，能够有效地将LA去饱和为ALA，使这些油料作物具有合成ω3 PUFA的能力，以提高其品质。
附图1是5'-和3'-末端RACE扩增和特异性目的条带的电泳图谱。附图2是缺刻缘绿藻ω 3 FAD基因全长结构示意图。附图3是未添加底物组的酵母脂肪酸成分检测结果。附图4是添加底物LA (α8:2Δ9’ 12)组的酵母脂肪酸成分检测结果。附图5是酵母脂肪酸成分的GC-MS图谱。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。 实施例1、材料
(1)缺刻缘绿藻incisa Reisigl) H4301 来自 Culture collection of algae of Charles University of Prague。在温度为 25°C、光照强度为 115 μ mol photons m_2 s—1、光/暗比为14 h/10 h的条件下培养，培养基为BG-Il。(2) pYES2质粒载体和酵母INVScl菌株(His\ LeiT、Tr1T及JJra—缺陷型)均购自hvitrogen公司。酵母用YPD培养基，28°C，200 rpm转速振荡培养。2、方法
(1)取100 mg新鲜的藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。(2) CTAB法提取基因组DNA和Trizol法抽提总RNA，_20°C保存备用。取1_5 μδ RNA，用反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行cDNA第一链合成，作为基因克隆的PCR反应模板。(3)根据莱茵衣藻和普通小球藻ω3 FAD氨基酸序列(GenBank登录号分别为ABL09485和ΒΑΒ78717)的保守区TMFWALF和HHDIGTH，设计简并引物序列上游弓丨物(SEQ ID NO. 1) :5，-ACCATGTTCTGGGC(C/T)CT(G/C)TT-3，，下游弓丨物(SEQ ID N0. 2) :5，-TG(G/C)GTGCC(A/G)ATGTCGTGGTG-3‘(在附加的序列表中，y 表示 C/ T，s表示G/C，r表示A/G)，用于缺刻缘绿藻ω3 FAD基因cDNA片段的克隆。然后应用下列反应体系和程序进行PCR扩增。25 PL的反应体系包含10XPCR缓冲液
Π 2. 5 μ , dNTP (各 10 mM) 2 μ ，引物各 1.0 μ (10 μΜ)，模板 1.0 μ ，Taq 酶 0· 5 μ
(TaKaRa公司)，无RNase水17 μ 。PCR反应程序为94°C预变性2 min，然后30个循环包括94°C变性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸1 min，最后72°C延伸10 min。将PCR产物胶回收纯化后，与PMD19T载体(Promega公司)连接后转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆，菌落PCR验证后，将阳性克隆菌液送至上海桑尼生物科技有限公司测序得到缺刻缘绿藻ω3 FAD基因片段的序列。(4)根据获得的缺刻缘绿藻ω 3 FAD基因cDNA片段序列设计基因特异性引物GSP 1 (SEQ ID Ν0· 3) :5，-ATGTGTGCGGTGGCTGATCCTCCAGC-3，，
GSP 2 (SEQ ID Ν0· 4) :5，-CTTCTCCAGCAACAAGACGCTCAACAAC-3，。根据 SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司)的使用说明分别建立5 ‘ -RACE和3 ‘ -RACE反转录体系， 然后根据降落PCR原理进行扩增。25 PL的5' -RACE反应体系包括17 μ 的PCR级水、2.5 μ 的 IOXAdvantage 2 PCR缓冲液、0. 5 μ 的 dNTPs、0. 5 μ GSP1、2. 5 μ 的 10XUPM、 1.5 μ 的5' -RACE模板即步骤(2)获得的cDNA第一链、0. 5 μ 的50XAdvantage 2聚合酶混合液。3'-端的反应体系除0.5 PLWGSP 2和1.5 μ 的3' -RACE cDNA外，其它的同5'-端反应体系。反应程序为94°C变性30 s，72°C延伸150 s，5个循环；94°C变性 30 s，70°C退火 30 s，72°C延伸 150 s，5 个循环；94°C变性 30 s，68°C退火 30 s，72°C延伸150 s，30个循环；72°C延伸7 min。然后电泳检测、胶回收纯化、TA克隆并测序，序列拼接获得缺刻缘绿藻ω 3 FAD基因的cDNA全长序列。(5)根据步骤(4)获得的缺刻缘绿藻ω3 FAD基因的cDNA全长序列， 分别在该基因的5 ‘ -UTR和3 ‘ -UTR设计引物上游引物(SEQ ID NO. 5) 5'-AAACCCGGCAACAATGCA-3，，下游引物(SEQ ID NO. 6) :5，-AGAATCAGAACCCGAAGC-3，，克隆 ω 3 FAD基因的DNA全长序列。25 μ 的PCR扩增反应体系包含2. 5 μ 的10 X PCR缓冲液，2 μ WdNTP (各 10 mM)，1.5 μ 的 Mg2+ (25 mM)，各 1.0 μ 的引物(10 μΜ)，1. 0 μ 模板，0.5 μ Taq酶(TaKaRa公司)及无RNase水15. 5 μ 。PCR反应程序为94°C预变性5 min ；然后 ；35个循环包括94°C变性1 min，55°C退火1 min，72°C延伸2 min ；最后72°C延伸10 min。 以上PCR产物经回收纯化后，均作TA克隆，选择阳性克隆送至上海桑尼生物有限公司测序得到缺刻缘绿藻ω 3 FAD基因的DNA全长序列。(6)根据pYES2载体(Promega公司)和缺刻缘绿藻ω 3 FAD基因的ORF序列设计引物上游引物(SEQ ID NO. 7 ) 5，-cgGAA77TATGCAGGCCCCCACTATGT-3，，下游引物(SEQ ID NO. 8):5，-gc/T7^6^CTACACATCCGAGCCACTG-3，，其中，斜体 G^TTT 和斜体 TCTAGA 分别代表 ^^肌和^^^的酶切位点。以缺刻缘绿藻ω 3 FAD cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系如下2. 5 μ L 的 10 X PCR 缓冲液，2 μ L 的 dNIPs，1. 5 yL&Mg2+(25 mM), 1. 0 μ L 模板， 上下游引物各1 PL，16 μ L的无RNase水，0.25 μ L的Taq酶(5U/μ L)。PCR反应条件为95°C预变性5 min ;36个循环包含94°C变性1 1^11、661退火1 min ；72°C延伸^iiin，最后72°C延伸7 min。PCR产物经回收纯化后作TA克隆后，送阳性克隆至上海桑尼生物有限公司测序确保序列的准确性。(7)从大肠杆菌DH5a中抽提pMD19T_co3 FAD质粒，用限制性内切酶I和损aI进行双酶切消化反应，同时对pYES2质粒也进行^b0RI /损aI双酶切反应。反应体
系为4 PL 的 10 X M 缓冲液，4 μ L 的 0. 1% BSA，DNA 彡 2 μ g,EcoRlR Xbal # 1 yL，加
无RNase水至20 μ L。37°C消化反应4 h。割胶回收酶切后的目的片段，并用T4 DNA连接酶将酶切后的ω3 FAD基因片段与pYES2片段连接得到重组载体ρΥ_ω3 FAD。连接反应体系为2. 5 μ L的缓冲液，ω 3 FAD基因DNA片段约0. 3 pmol，载体pYES2的DNA消化片段约0.03 pmol,l PLWT4 DNA连接酶，加无RNase水至25 μ L0 16°C连接过夜。连接后转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，按照上述方法进行克隆、菌落PCR验证和测序。从大肠杆菌 DH5a中抽提ρΥ-ω3 FAD质粒，_20°C保存备用。(8)酵母感受态细胞的制备。将酵母接种于YPD培养基中，28°C复苏培养过夜，然后按1 100放大培养，以250 rpm转速振荡培养至细胞密度约为1 X IO8细胞/mL (约4_5
6h)。冰上冷却15 min使细胞停止生长，4°C条件下以5 000 rpm转速离心5 min收集酵母细胞，预冷无菌水洗涤细胞2次，同样条件下离心收集。20 mL预冷的1 M山梨醇洗涤细胞 1次，然后溶于0. 5 mL预冷的1 M山梨醇，调整细胞的浓度在1 X 101°细胞/mL。冰上保存细胞(或是4°C )，便于电击使用。(9)电穿孔仪(Bio-Rad)电击，将重组的载体ρΥ_ω3 FAD转化酵母感受态细胞。 取在冰上预冷的待转化的ρΥ-ω 3 FAD重组质粒DNA约5_10 μ L (5-200 ng)与感受态细胞混勻，并与0. 2 cm的电击杯一起冰上预冷，然后将DNA-细胞混合液转移到预冷的电击杯轻轻混勻，冰浴5 min后，选择程序电击一次，移走电击杯，立刻加入1 mL预冷的IM山梨醇，轻轻转移到新的YPD培养基中，28°C轻微振荡证，将菌液涂布于含有1 M山梨醇的尿嘧啶缺陷合成培养基(SC-U)上，倒置静置培养48-72 h，挑取菌落于液体SC-U培养基中培养。菌落PCR验证后，用含21葡萄糖或2%棉籽糖的SC-U培养基保存菌种。(10)将保存的菌液接种YPD培养基中下以220 rpm转速振荡培养。然后离心收集菌液，重悬于21半乳糖的YPD培养基中，分别加入底物LA (C18:2co6)和ArA (C20:4co6)至终浓度为 0. 005%(170 μ M-180 μ Μ)，并加入表面活性剂 1% Tergitol type NP-40，10°C下以150 rpm转速振荡培养72 h。离心收集酵母菌体，经去离子水洗涤3次后液氮冻存。(11)将液氮冻存的酵母冷冻干燥，然后进行脂肪酸甲酯化。称取约25 mg酵母粉末于酯化瓶中，加入2 ml含洲硫酸的甲醇溶液。充氮气后，于82°C水浴锅酯化反应1 h， 便于将结合的脂肪酸分子充分解离并甲基化。酯化反应后，向上述酯化瓶中分别加入1 mL 去离子水和1 mL正己烷，充分混勻，然后在5500 rpm下离心10 min。收集上清液至样品瓶中，氮气浓缩，4°C保存备用。(12)采用Angilent 6890 plus型气相色谱仪进行脂肪酸组成分析，色谱柱为 HP-5型毛细管柱(30 mXO. 25 mm)；升温程序为50°C保留1 min，25°C /min升温至200°C， 然后3°C/min升温至230°C，最后保留18 min ；分流比为50:1 ；氮气、氢气、空气的流速分别为 30 mL/min、450 mL/min、40 mL/min。进样量为 1 μ L0(13) GC-MS 检测生成的产物。GC 的色谱柱为 HP-INNOWax Polyethylene Glyco (30 mX320 ymXO. 25 μ m)，连接MS四级杆，150 C(最大值200 C)。升温程序50°C保持1 min,以10°C /min升到150°C后保持1 min，然后再以4°C /min升到230°C后再保持5 min, 运行时间37 min。氦为载气体，初始值50°C，压力7. 6522 8丨，流速2.6891 mL/min，平均速率 59. 763 cm/s，滞留时间 0. 83664 min，流速 2. 6891 mL/min，运行时间 37 min。MS 采集参数选用EMV模式，跟踪检测的离子能为69. 922 eV。3、结果
(1)利用RACE方法扩增得到ω 3 FAD基因的ORF序列，5 ‘-和3 ‘-末端RACE扩增和特异性目的条带的电泳图谱如图1所示。图中，M代表DL 2000分子量标准;A图为5’-末端产物，长度为650 bp ；C图为3’-末端产物，长度为1759 bp ;B图为目的条带，长度为671 bp。经测序得到ω 3 FAD基因的ORF序列如SEQ ID NO. 9所示。克隆并测序得到DNA全长序列如SEQ ID NO. 10所示。缺刻缘绿藻ω 3 FAD基因全长结构如图2所示。(2)选用pYES2载体通过限制性内切酶I和损a I的基因操作，成功地构建了 ω3 FAD基因的表达载体ρΥ-ω 3 FAD。将ω3 FAD基因组装在pYES2载体的GALl启动子下游，应用半乳糖诱导基因过表达。(3)采用电穿孔仪电击的方法成功地将重组的表达载体ρΥ_ω3 FAD导入酵母 INVScl中。由于酵母INVScl是His-、Leu-、Trp-、toa-缺陷型菌株，而pYES2载体上有编码尿嘧啶的URA3基因，因而转入ρΥ-ω 3 FAD质粒的酵母能够在尿嘧啶缺陷的合成培养基 (SC-U)上生长，进而筛选获得转基因的酵母细胞。(4)培养基中分别添加外源底物LA和ArA，经半乳糖诱导后，GC-MS检测酵母甲酯化的脂肪酸。未添加底物组的酵母脂肪酸成分检测结果如图3所示，图中箭头指示酵母自身合成的脂肪酸成分；添加底物υν(α8:2Δ9’ 12)组的酵母脂肪酸成分检测结果如图4所示， 图中粗箭头指示的是添加的外源脂肪酸底物，细箭头指示其产物。在图3和图4中，a代表野生型对照组，b代表转空载体对照组，c代表含有ω 3 FAD的转基因酵母ρΥ-ω 3 FAD组。 GC-MS图谱如图5所示。比较了转基因酵母在添加不同脂肪酸底物培养后，细胞中脂肪酸组分的含量(占总脂肪酸％)，结果如表1所示
表权利要求
1.一种编码缺刻缘绿藻Δ15脂肪酸去饱和酶的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括(a)SEQ ID NO. 10所述的核苷酸序列，或(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述的载体是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述的质粒是PYES2质粒。
4.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自于下列一种宿主细胞(a)用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞；(b)用权利要求2或3所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。
6.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是酵母细胞。
7.权利要求1所述的DNA序列、权利要求2或3所述的重组表达载体或权利要求4或 5所述的宿主细胞在生产长链多不饱和脂肪酸中的应用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的长链多不饱和脂肪酸是ω3长链多不饱和脂肪酸。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的长链多不饱和脂肪酸是α-亚麻
全文摘要
本发明涉及一种编码缺刻缘绿藻Δ15脂肪酸去饱和酶的DNA序列，所述的DNA序列包括(a)SEQIDNO.10所述的核苷酸序列，或(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明还提供了含有上述核苷酸序列的重组表达载体和基因工程化的宿主细胞及其用途。本发明的优点在于克隆了缺刻缘绿藻的脂肪酸去饱和酶基因并对其进行了功能鉴定，为阐明缺刻缘绿藻的长链多不饱和脂肪酸合成代谢途径奠定了基础，并为在生物体内进行遗传操作以实现ω3长链多不饱和脂肪酸的高效合成创造了条件。
文档编号C12N1/19GK102492700SQ20111037917
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者于水燕, 吴洪, 周志刚, 李慧, 李春阳, 欧阳珑玲, 陈思弘 申请人:上海海洋大学, 新奥科技发展有限公司