专利名称：一种腺苷酸环化酶、其编码基因、载体、菌株及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种腺苷酸环化酶、其编码基因、载体、菌株及应用。
背景技术：
^FMSI—(cyclic adenosine monophosphate, cAMP) ^Μ^Γ^&Μ^ .^] 一种具有生理活性的物质，其作为细胞内的第二信使，对糖代谢、脂肪代谢、核酸合成、蛋白质合成等发挥着重要的调节作用。临床上cAMP用于治疗慢性充血性心力衰竭、肺心病、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；对改善风湿性心脏病的心悸、气急、胸闷等症状有一定的作用；可提高急性白血病结合化疗的疗效，亦可用于急性白血病的诱导缓解；此外，对老年慢性支气管炎、各种肝炎和银屑病也有一定疗效。cAMP也可作为药物中间体制备二丁酰环磷酸腺苷和环磷酸腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的生理及药理作用。cAMP亦可用于畜禽饲料添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。cAMP的生产方法有化学合成法、发酵法和酶法三种，目前国内外产业化生产全部采用以AMP为原料的化学合成法。化学合成法所涉及的试剂昂贵，且采用大量的吡啶作为溶剂，对人体的皮肤及呼吸道有刺激性，对人体危害很大，并造成环境污染，而且合成对工艺要求很高。生产原料和试剂价格较高、生产成本偏高。利用液化短杆菌、小杆菌、棒状杆菌、节杆菌等以发酵法制备cAMP也存在限制，如产率较低，关键酶腺苷酸环化酶的高效表达机制不清，离子环境与细胞活性的关系以及调节机制有待进一步研究。酶法即以腺苷酸环化酶为酶源催化生产cAMP。腺苷酸环化酶(E. C. 4. 6. 1. 1)在 Mg2+参与下，可催化ATP生成cAMP和PPi，是cAMP生物合成的关键酶。因此，开发以基因工程为手段，克隆高活性的腺苷酸环化酶基因，构建工程菌株大量表达腺苷酸环化酶，以ATP 为原料一步生产cAMP，是cAMP合成的一条可行途径。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种高效表达腺苷酸环化酶的基因。本发明的另一个目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的又一个目的是提供包含上述重组载体的宿主细胞及其制备方法。此外，本发明的还一个目的是提供上述基因、重组载体和宿主细胞的应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供了一种用于编码腺苷酸环化酶的DNA序列，其具有如SEQ ID NO. :1所示的碱基序列。本发明还提供了一种腺苷酸环化酶，具有如SEQ ID NO. :2所示的氨基酸序列。另一方面，本发明提供一种用于表达腺苷酸环化酶的重组载体，其含有上述的DNA 序列。优选地，所述重组载体为融合型表达载体，优选为pET28a。
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又一方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。更优选地，所述大肠杆菌的保藏编号为CGMCC No. 4706，已于2011年3月M日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所(邮编100101)。本发明还提供了制备上述宿主细胞的方法，其包括构建上述的重组载体，并利用该重组载体转化宿主细胞。优选地，所述方法包括构建包含上述的DNA序列的重组载体pEI^Sa，利用该重组载体通过热击转化大肠杆菌，并根据产物表达量筛选菌株。还一方面，本发明提供了上述的DNA序列、上述的重组载体、或者上述的宿主细胞在生产腺苷酸环化酶中的应用。优选地，所述腺苷酸环化酶具有如SEQ ID NO. :2所示的氨基酸序列。此外，本发明提供了一种腺苷酸环化酶的生产方法，其包括采用上述的DNA序列、 上述的重组载体、或者上述的宿主细胞来生产腺苷酸环化酶。优选地，所述腺苷酸环化酶具有如SEQ ID NO. :2所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种环磷酸腺苷的生产方法，其包括采用上述的DNA序列、上述的重组载体、或者上述的宿主细胞生产的腺苷酸环化酶催化腺苷三磷酸来生产环磷酸腺苷。优选地，所述腺苷酸环化酶具有如SEQ IDN0. :2所示的氨基酸序列。综上所述，本发明提供了一种高效表达腺苷酸环化酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO :1所示(以下又称为cya基因)，该腺苷酸环化酶cya基因长度为112^p，编码374 个氨基酸和一个终止密码子。本发明还提供了一种表达载体，其含有上述核苷酸序列如 SEQ IDNO :1所示的基因。该表达载体优选含有如SEQ IDNO 1所示基因的分泌型表达载体pET28a-Cya。本发明又提供了一种宿主细胞，含有上述表达载体。该宿主细胞优选含有 pET28a-cya表达载体的大肠杆菌。上述宿主细胞更优选表达腺苷酸环化酶的大肠杆菌工程菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号CGMCC No. 4706。本发明还提供了构建宿主细胞的方法，通过基因步移从节杆菌(ArthrcAacter A302)提取cya 基因，构建重组表达质粒载体pEI^8a-Cya，将重组质粒热击转化大肠杆菌Rosetta，然后进行诱导表达，筛选到一株产酶量最高的菌株CGMCCNo. 4706。此外，本发明还提供了上述高效表达腺苷酸环化酶的基因在生产cAMP中的应用。上述应用具体表现为利用重组工程菌 CGMCC No. 4706生产cAMP，其方法如下培养重组菌，利用IPTG或乳糖诱导重组质粒中腺苷酸环化酶基因cya的表达，收集菌体，超声破碎细胞，得到的上清作为粗酶液。在Mg2+存在下，以ATP为底物，以粗酶液作为催化剂，催化生成cAMP。可见，本发明首次发现了节杆菌(本实验室命名为ArthrcAacter A302)中腺苷酸环化酶的基因cya，并实现了腺苷酸环化酶基因在大肠杆菌Rosetta中的高效表达。重组工程菌株能够高效表达腺苷酸环化酶基因cya，表达可溶性的腺苷酸环化酶，将其应用于生产 cAMP，取得了良好的效果。IPTG诱导表达重组大肠杆菌，酶活为10U/mg;乳糖自诱导表达重组大肠杆菌，酶活为7U/mg。将该重组大肠杆菌应用于生产腺苷酸环化酶，能以ATP为原料一步生成cAMP，具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点，而且清洁无污染，能实现cAMP生产过程的节能、降耗、减排。
牛物材料的保藏节杆菌(ArthrcAacter sp. )A302,已于2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中科院微生物研究所(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 3584。重组工程菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Rosetta(pEI^8a_cya)，已于 2011 年3月M日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所(邮编100101)，保藏编号 CGMCC No. 4706。
图1为cya全长基因PCR的电泳结果，其中泳道1为2000bp Marker，泳道2为PCR产物。图2为重组质粒的构建及验证的电泳结果，其中图2A为质粒双酶切验证的电泳结果，泳道1为pET28a-cya重组质粒双酶切产物；泳道2为2000bp Marker ；图2B为质粒PCR 验证的电泳结果，泳道1为以pET28a-Cya重组质粒为模板得到的PCR产物；泳道2为以水为模板得到的PCR产物；泳道3为2000bp Marker。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。除非另外指明，以下各实施例中所使用的生物材料、载体、菌株、试剂、试剂盒等均可通过常规商购途径获得，其中涉及的生物基因工程操作技术，如质粒提取、酶切消化、片段回收、核酸片段与质粒载体连接反应及克隆和筛选等，均为本领域内的常规操作或参照相应产品的说明书进行操作。实施例1节杆菌Arthrobacter A302的筛选以从土壤中分离得到的产环磷酸腺苷的菌株为出发菌株，将经N+离子束诱变(低能离子注入机靶室内真空度为2X 10_4，注入能量为20kev，剂量为5X 1013ions ^nT2. s—1)后的孢子悬浮液经无菌水稀释100倍后，取0. Iml涂布于牛肉膏平板培养基上30°C下培养3 天，从中挑选单菌落在牛肉膏斜面培养2天。转接一环于装有30mL液体种子培养基(葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL摇瓶中，于30°C 下250rpm摇床培养20小时。再转接4mL于装有40mL液体发酵培养基(葡萄糖50g/L， K2HPO4 10g/L, KH2PO4 10g/L，MgSO4 lg/L，尿素 5g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 摇瓶中，于 30°C T^Orpm摇床发酵培养72小时。经过初筛，得到88株比出发菌株产量高的突变株。用同样的条件下进行复筛，最终得到产量最高的菌株A302，环磷酸苷产量最高产量达到2. 4g/ L，比原始菌株的1. 2g/L提高2倍。目前该菌株A302已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3584，保藏日期为2010年1月18日。关于节杆菌 A302 (Arthrobacter sp.)的详细信息，可参见本申请人2010年6月4日提交的中国发明专利申请 201010191515. 6。实施例2节杆菌腺苷酸环化酶基因cya的克隆1、节杆菌基因组的提取将节杆菌(Arthrobacter) A302接种于30mL培养基(培养基组成(g. L—1)如下葡萄糖10g，蛋白胨10g，酸水解酪蛋白10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，氯化钠3g，补蒸馏水至1L) 中，30°C培养至对数生长期，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自北京盖宁金诺生物技术有限公司)提取基因组。2、扩增保守序列根据NCBI数据库中已有的腺苷酸环化酶的氨基酸序列，设计扩增保守序列的简并引物如下S220 5，-GCTCTCCGCCCGGAA(A/G)(A/C/T)T(A/G/C/T)TGG(A/C)G-3，AS1 5，-CAGCCGGGCGGC(A/G/C/T)A(A/G/T)(A/G)TT(A/G/C/T)AC-3，PCR反应体系如下
ddH2033. 5 (μυ
基因组2
S2203
ASl3
10 倍 buffer5
dNTPs1
DMSO2. 5
Taq E0. 5
总体积50PCR条件如下94°C变性5min ；按如下参数循环30次94°C变性lmin，52°C退火30s，72°C延伸 30s ；最后 72°C延伸 IOmin0简并引物PCR扩增得到长度为约750bp的片段，与预期长度相近，凝胶电泳分离纯化此片段并进行胶回收。将胶回收产物连接到PMDIST-vector (购自TAKARA公司)，连接产物转化采用氯化钙法制备的大肠杆菌Dffia感受态细胞，涂布于氨苄抗性平板。挑取LB平板上的单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的50mL离心管中，37°C， 220rpm下培养8_12小时。利用质粒提取试剂盒(购自上海申能博彩生物科技有限公司) 提取质粒，并委托金斯瑞科技(南京)有限公司测序，保守序列长度为768bp，其核酸序列见 SEQ IDNO :3。3、基因步移1)C端步移根据上述所得的768bp保守序列设计C端步移三轮PCR的引物如下SPl :5’ -TGGACGCCCTCGAAGAAGTACTGGT-3’SP2 5' -CCCGGCGCATGAACGAAAAAACCCT-3‘
SP3 :5’ -TCCTGTACATCGCAGAAACCCCCGC-3，以基因组为模板，扩增所需的其它试剂及简并引物采用Genomewalking kit (购自 TAKARA公司)，第一轮PCR体系如下以第-
ddH20 基因组 SPl APl
10 倍 buffer dNTPs DMSO LA Taq
总体积
27. 5 (|aL) 2 1 1 5 8 5
0. 5 50
-轮PCR产物的100倍稀释液为模板，第二轮PCR反应体系如下
ddH20 模板 SP2 APl
10 倍 buffer dNTPs DMSO LA Taq 总体积
28. 5 (|aL) 1 1 1 5 8 5
0. 5 50以第二轮PCR产物的50倍稀释液为模板，第三轮PCR反应体系如下
ddH2028. 5 (μυ
模板1
SP31
API1
10 倍 buffer5
dNTPs8
DMSO5
LA Taq0. 5
总体积50三轮PCR的反应条件分别如下
权利要求
1.一种用于编码腺苷酸环化酶的DNA序列，其具有如SEQ ID NO. :1所示的碱基序列。
2.一种腺苷酸环化酶，其具有如SEQ ID NO. :2所示的氨基酸序列。
3.一种用于表达腺苷酸环化酶的重组载体，其含有权利要求1所述的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为融合型表达载体，优选为pED8a。
5.一种宿主细胞，其含有权利要求3或4所述的重组载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌；优选地， 所述大肠杆菌的保藏编号为CGMCC No. 4706。
7.制备权利要求5或6所述宿主细胞的方法，其包括构建权利要求3或4所述的重组载体，并利用该重组载体转化宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括构建包含权利要求1所述 DNA序列的重组载体pED8a，并利用该重组载体通过热击转化大肠杆菌，并根据产物表达量筛选菌株。
9.权利要求1所述的DNA序列、权利要求3或4所述的重组载体、或者权利要求5或6 所述的宿主细胞在生产腺苷酸环化酶中的应用。
10.一种腺苷酸环化酶的生产方法，其包括采用权利要求1所述的DNA序列、权利要求 3或4所述的重组载体、或者权利要求5或6所述的宿主细胞来生产腺苷酸环化酶。
11.一种环磷酸腺苷的生产方法，其包括采用权利要求1所述的DNA序列、权利要求3 或4所述的重组载体、或者权利要求5或6所述的宿主细胞生产的腺苷酸环化酶催化腺苷三磷酸来生产环磷酸腺苷。
全文摘要
本发明提供一种腺苷酸环化酶、其编码基因、载体、菌株及应用。本发明提供的用于编码腺苷酸环化酶的DNA序列，其具有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。此外，本发明还提供了该DNA序列编码的腺苷酸环化酶，包含该DNA序列的重组载体，包含该重组载体的宿主细胞，以及它们在生产腺苷酸环化酶中的应用。本发明的大肠杆菌基因工程菌株可以高效表达腺苷酸环化酶，其诱导酶活可达到为7U/mg或10U/mg。将该菌株应用于生产环磷酸腺苷，具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点。
文档编号C12R1/19GK102212538SQ20111012874
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者何颖, 吴菁岚, 应汉杰, 李楠, 柏建新, 熊健, 谢婧婧, 陈勇, 陈晓春 申请人:南京工业大学