生产四氢叶酸的重组质粒、基因工程菌株构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种用于生产四氢叶酸的重组质粒和一种高产四 氢叶酸的基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌的构建方法。本申请同 时涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备发酵生物质生产四氢叶酸的生物产品中的用 途。
【背景技术】
[0002] 叶酸(folic acid)也叫维生素 B9,是一种水溶性维生素。叶酸是人体在利用糖分 和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的 形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。
[0003] 植物和微生物细胞能利用自身的喋呤、对氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸在叶酸合成 酶的作用下从头合成叶酸，而人和其他高等哺乳动物缺乏完整的叶酸合成系统，只能通过 食物摄取叶酸。随着科学技术的日益发展，采用一些方法来提高食物中叶酸含量具有很大 的吸引力和极其重要的意义。
[0004] 目前国内外主要依靠化学方法合成四氢叶酸。此过程中涉及到毒性物质，并且产 品的分离纯化也有不便，整个生产流程对环境有一定的污染性，成本高。而近年来对叶酸合 成代谢途径的研究较为清楚，这为通过生物工程手段进行改造以提高叶酸含量奠定了基 础。相比而言，用生物方法生产四氢叶酸具有不可替代的优势，因为生物方法不像化学法一 样，它对环境的污染可以减少到最低，而且对于生产工艺、反应条件、原料等方面的要求也 较化学法更加简便，因此在未来有很广泛的发展前景。
[0005]目前通过代谢工程的方法已在植物中提高了多种维生素的含量，由于叶酸对人体 健康的重要性及其代谢途径的明了，叶酸的生物强化进展相对比较大。所涉及到的植物包 括:拟南芥、莴苣、番茄、谷类作物(水稻、玉米）、大豆。在拟南芥中Hossain等人通过大肠杆 菌来源的GCHI基因 folE转化拟南芥，使转基因植株的蝶呤和叶酸含量分别提高了1250倍、 2-4倍（Proc Natl Acad Sci USA，2004，101:5158-5163，Hossain et al·)。在谷类作物（水 稻、玉米）中Storozhenko等人考虑到植物来源的GCHI在植物体中会受到反馈抑制，为了避 免pABA、蝶呤的过量积累，选择AtGCHI、AtADCS在水稻中进行胚乳特异性表达，大大提高了 水稻胚乳中的叶酸含量。其中At ADCS水稻的叶酸含量降低了 6倍;AtGCHI水稻的叶酸含量没 有明显的变化;AtGCHI /At ADCS水稻的叶酸提高了 15-100倍。与野生型中50 %的叶酸被多聚 谷氨酰化不同，AtGCHI/AtADCS转基因水稻中只有2.6 % -14 %的叶酸被谷氨酰化，说明转基 因水稻中的叶酸生物利用率更高（Proc Natl Acad Sci USA，2007,101:5158-5163， Storozhenko et al.)〇
[0006]现有利用转大豆GTPCHI和ADCS基因协同增效作用提高植物叶酸含量的方法，如公 布号CN201010249764.6中所述，公开的方法是构建大豆GTPCHI和ADCS基因串联的共表达载 体，然后导入目的植物中共表达。转大豆GTPCHI和ADCS基因协同增效作用能够明显提高转 基因植株中叶酸的含量，因此，它可以作为一种生产高含量叶酸转基因植物的方法，人类可 通过饮食这类植物直接获得天然的叶酸，解决叶酸摄入缺乏的现象，并克服了长期服用叶 酸片剂带来的不良副作用。
[0007] 因此，在植物中构建基因表达用于高产四氢叶酸已经有了很大的进展，但是用植 物作为载体有很多不足：（1)植物培养不如微生物那般快捷高效，生产周期较长。（2)对产品 的实时监测也不如微生物那般便利。这导致植物中构建基因表达生产四氢叶酸很难在工业 上广泛量产。
[0008] 目前，利用微生物生产四氢叶酸亦是一种高产四氢叶酸新思路。将大肠杆菌叶酸 代谢途径中的关键酶5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的基因 metF插入载体pET-22b，构建重组 质粒pET-22b-metF，将其转化至E. coliBL21 (DE3)中获得基因工程菌，结果显示，metF在大 肠杆菌中的表达对大肠杆菌生物量基本没有影响，而L-5-甲基四氢叶酸的产量提高了28% (Pharmaceutical Biotechnology，2011，18(3):201 ~205，liu et al·)。把编码MTHFR全长 的DNA重组到表达载体pET-28a( + )中，导入宿主菌E. coli BL21 (DE3)得到重组菌，实现利用 基因工程方法生产L-5-甲基四氢叶，结果显示，重组菌生产的L-5-甲基四氢叶酸量约为原 始菌的2.5倍（Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2012,33(3): 185~198， liu et al.)。尽管目前利用微生物生产四氢叶酸的产量并不高，但是微生物法有不可替代 的优势：（1)它不仅较化学法生产更加环保安全高效，而且相比于利用植株生产四氢叶酸， 微生物生产周期很快，可多次循环再利用。（2)微生物法中可对生产过程中的任何环节实时 监测，且利用微生物灵活高效。因此，我们尝试一种可以更加高产四氢叶酸的基因工程菌的 构建。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种用于生产四氢叶酸，并降低生产成本的重组质粒和一 种高产四氢叶酸的基因工程菌。本发明的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌的 构建方法。
[0010] 本发明所用菌株是本实验室保存的野生型大肠杆菌W3110。本发明提供的重组大 肠杆菌B S W 0 3，是含有一定拷贝数的携带完整的G T P环化水解酶I、二氢新蝶呤醛缩酶 (DHNA)、羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)三个基因的重组质粒的基因工程菌株W3110。
[0011] 综上，本发明的基本技术构思是:将GTP环化水解酶I、二氢新蝶呤醛缩酶(DHNA)、 羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)这三个酶的基因插入到质粒载体pTrc99a上，再构建工 程菌BSW03,通过提高三个基因的表达以促进代谢流向四氢叶酸积累的方向，从而提高大肠 杆菌BSW03生产四氢叶酸的能力。
[0012] 针对本发明的发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0013] -方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒是携带有GTP环化水解酶I基因 的PMD19-T载体(pMD-GTP)。优选地，该重组质粒是携带完整的包括GTP环化水解酶I基因编 码序列的PMD19-T载体，该基因的序列如SEQ ID No.l所示。
[0014] 另一方面，本发明提供了 一种重组质粒，该重组质粒是携带有二氢新蝶呤醛缩酶 (DHNA)基因的pMD19-T载体(pMD-DHNA)。优选地，该重组质粒是携带完整的包括二氢新蝶呤 醛缩酶(DHNA)基因编码序列的pMD19-T载体，该基因的序列如SEQ ID No.2所示。
[0015] 另一方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒是携带有羟甲基二氢蝶呤焦 磷酸激酶(HPPK)基因的pMD 19-T载体(pMD-HPPK)。优选地，该重组质粒是携带完整的包括羟 甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)基因编码序列的pMD19-T载体，该基因的序列如SEQID No. 3所示
[0016]另一方面，本发明提供多种重组质粒，包括将前述的重组质粒PMD-GTP和大肠杆菌 质粒pTrc99a分别用双切酶酶切，将切下的GTP基因片段连接的到质粒pTrc99a中而得到的 pTrc99a-G;将前述的重组质粒pMD-DHNA和前述得到的pTrc99a-G分别用双切酶酶切，将切 下的DHNA基因片段连接的到质粒pTrc99a-G中而得到的pTrc99a-GD;以及将前述的重组质 粒pMD-HPPK和前述得到的pTrc99a-⑶分别用双切酶酶切，将切下的HPPK基因片段连接的到 质粒 pTrc99a-GD 中而得到的 pTrc99a-GDH。
[0017]另一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是将前述GTP、DHNA、HPPK三个基 因置于一个质粒载体上，即前述得到的pTrc99a-GDH。
[0018]另一方面，本发明提供一种四氢叶酸高产基因工程菌，所述工程菌是通过将前述 的pTrc99a-GDH重组质粒转入到原始菌株大肠杆菌W3110中而得到的。
[0019]另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-GTP的构建方法，所述方法包括:首 先设计引物:GTP up: -5' AGGCCATGGATGCCATCACTCAGTAAAGA 3'-，划线处