一种提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法

一种提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法
【专利摘要】本发明提供了一种提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，包括以下步骤：(1)提取：取肉试料采用乙腈提取两次，两次提取的上清液分别用正己烷进行分配，然后合并乙腈层，加入正丙醇5 mL，50℃减压浓缩至体积为300~600μL，得到残余液；(2)净化：往残余液中添加乙腈复溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的复溶液全部过碱性氧化铝SPE柱，而后用乙腈?水进行洗脱，收集洗脱液，过滤得到试样溶液，供高效液相色谱测定。该方法简单易操作，而且可以提高高效液相色谱测定磺胺类药物残留中的准确度。
【专利说明】
一种提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法
技术领域
[0001] 本发明涉及肉中磺胺类药物残留测定方法，尤其涉及一种提高肉中磺胺类药物残 留测定准确度的前处理方法。
【背景技术】
[0002] 磺胺类药物（sulfanilamides, SAs)结构上类似对氨基苯甲酸(PABA)，可与PABA 竞争性作用于细菌体内的二氢叶酸合成酶，从而阻止以PABA为原料合成细菌所需的四氢叶 酸，进而抑制细菌蛋白质的合成达到抑菌效果。该类药物抗菌谱广、抗菌效果明显、性质稳 定价格便宜，因而大量用于防治畜禽细菌性感染疾病。然而，磺胺类药物在动物体内无法代 谢完全，其残留量可通过食物链进入人体，进而对人体健康构成危胁。鉴于此，欧美、日本和 我国对磺胺类药物的最大残留限量均作了规定(残留总量不得超过l〇〇yg/kg)。由此，畜禽 产品中磺胺类药物残留的检测也就成了农产品质量安全部门常设的监测项目之一。《农牧 发[2001]38号文中方法之五:动物源食品中磺胺类药物残留的检测方法一一高效液相色 谱法》是现行畜禽产品安全监测常用的检测方法，主要用于鸡肉中7种磺胺药物检测和能力 验证。不过，2013年和2015年广东省农业厅农产品质量安全监管处对省内承担监测任务的 单位进行的能力验证结果表明，考试使用该方法的合格率均为60%~68%。和其它考核项目相 比，磺胺类的合格率总是偏低，省厅每年都有组织进行该项目的培训，但是培训效果仍然不 明显。上述方法的浓缩净化具体为： 提取:称取(5±0.05) g试料，置于50 mL聚丙稀离心管中，加无水硫酸钠4 g和乙腈25 mL，祸动混合15 s，中速振荡20 min，2500 r/min离心5min。上清液移至分液漏斗中，加入 30 mL正己烷，振摇2 min后，静止5 min，分离乙腈层。用25 mL乙腈将沉淀物重复提取1 次，乙腈层经同一份正己烷分配，合并乙腈层于100 mL鸡心瓶中，加入正丙醇5 mL，50°C减 压浓缩至近干。
[0003] 净化：用3 mL乙腈-水(95 + 5)溶解残留物过碱性氧化铝SPE柱，不收集，用乙腈-水(95 + 5) 5 mL洗涤鸡心瓶，并过SPE柱，吹去柱内滞留的液体。用5 mL乙腈-水（75 + 25)洗脱待测物至10 mL容量瓶中，用0.017 mol/L磷酸定容至10 mL，用0.45 M微孔滤 膜过滤，收集滤液作为试样溶液，供高效液相色谱测定。
[0004] 经过本发明人反复研究发现，之所以磺胺类的合格率低，主要是样品前处理的浓 缩净化环节存在缺陷。在该方法中提取后期提取物需浓缩至干，在浓缩过程耗时且易爆沸。 浓缩残留物与3 mL复溶液乙腈-水(95 + 5)重新复溶，由于复溶液中的水含量较大，所得的 复溶液中含水量大于5%以上，使药物的回收率变低，从而影响最终检测结果。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法， 该方法简单易操作，而且可以提高高效液相色谱测定中的准确率。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种提高肉中磺胺类药物残留测定准确 度的前处理方法，包括以下步骤： (1) 提取:取肉试料，采用乙腈提取两次，两次提取的上清液分别用正己烷进行分配， 然后合并乙腈层，加入正丙醇5 mL，50°C减压浓缩至体积为300~600 yL，得到残余液； (2) 净化:往残余液中添加乙腈复溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的复溶液全部 过碱性氧化铝SPE柱，而后用乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，过滤得到试样溶液，供高效液 相色谱测定。
[0007] 本发明所述步骤（1)具体操作为:称取5±0.05 g肉试料置于聚丙烯离心管中，加 无水硫酸钠4 g和乙腈25 mL，祸动混合15 s，中速振荡20 min，2500 r/min离心5 min，上 清液移至分液漏斗中，加入30 mL正己烧，振摇2 min后，静止5 min，分离乙腈层，用25 mL 乙腈将沉淀物重复提取1次，乙腈层经同一份正己烷分配，合并乙腈层于100 mL鸡心瓶 中，加入正丙醇5 mL，50°C减压浓缩至体积为300~600 yL，得到残余液。
[0008] 本发明所述步骤(2)具体操作为:往残余液中添加乙腈复溶，并控制溶液含水量在 5%以下，所得的复溶液全部过碱性氧化铝SPE柱，不收集，用乙腈-水洗涤鸡心瓶，并过碱性 氧化铝SPE柱，吹去柱内滞留的液体，用5 mL乙腈-水洗脱待测物至10 mL容量瓶中，用 0.017 mol/L磷酸定容至10 mL，用0.45M1微孔滤膜过滤，收集滤液作为试样溶液，供高效 液相色谱测定。
[0009] 所述步骤(2)中，往残余液中添加乙腈复溶后，溶液中含水量在2.5%以下。
[0010] 所述步骤(2)中残余液与乙腈的比例根据不同检测项目有不同的体积比例，优选 地，若检测项目为除了 SDM和SQ的其余5种，即磺胺嘧啶(SD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二 甲嘧啶（SM2)、磺胺甲氧嗪（SMP)和磺胺甲噁唑（SMZ)，所述残余液(V1):乙腈(V2 )=1: 20，此 时SD、SMP、SMM、SMZ四种的回收率均不低于90 %。若7种磺胺全检且回收率均在89%以上，则 所述残余液(VI):复溶液乙腈(V2)=l:40。上述的VI为残余液体积，V2为乙腈体积。
[0011] 所述步骤(2)中，洗涤鸡心瓶的乙腈-水的乙腈和水的体积比为95:5,用于洗脱的 乙腈-水溶液的乙腈和水的体积比为75: 25。
[0012]本发明的有益效果是： 本发明在提取步骤的减压浓缩中没有浓缩至干，而是保留一定体积的水，在净化步骤 中只添加乙腈进行复溶，这样有效地控制复溶液中水含量，从而提高7种磺胺的回收率，大 大地提高了后续高效液相色谱法检测的准确度。
【附图说明】
[0013]图1是不同含水量对7种磺胺SPE柱保留率的影响的条形图。
【具体实施方式】
[0014] 以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施 例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。
[0015] 试验例1 试验方法： 1)7种磺胺100 yg/L混合标准溶液介质不同含水量的配制一取5个洁净离心管(规格 10 mL)，依次加入七种含磺胺混合标准溶液(见上述提及的7种，浓度均为200 yg/L)、加入 超纯水、加入乙腈，混匀，步骤详见表1。所得的混合标准溶液用作为下一步的上样液。
[0016] 2)碱性氧化铝SPE柱对7种磺胺介质不同含水量保留的试验---取5只碱性氧化铝 柱（规格:500 mg/6mL)，各处理水平上样液分别过柱，不收集，吹去柱内滞留的液体，用5 mL75%乙腈水洗脱，液体收集在容量瓶中，用流动相(0.017 mol/L磷酸-乙腈(80 + 20))定 容至10 mL，混匀，过膜，供HPLC测定用。
[0017] 3)HPLC 测定： 色谱柱:反相&8柱，250\4.6臟，粒径5111]1;流速：11]11/1]1；[11;检测波长:27()111]1;进样量 50 yL。测定方法：以色谱峰面积积分值定量，外标法计算浓度和保留率。检测结果见图1。
[0018] 从图1可以看出：当水分含量从2.5%上升到5%时，碱性氧化铝柱对7种磺胺药物的 保留情况为:SD、SMP、SMM、SMZ四种的保留率大于95%，SM 2保留率下降到70%、SDM和SQ分别下 降到41%和47%;当含水量上升到10%时，7种磺胺药物的保留率下降到0~31%;当含水量为15% 时，除了SD和SMP仍有10%左右的保留外，其余5种全部流失；当含水量为20%时，7种磺胺无一 保留。结论:选用碱性氧化铝柱进行净化时，样品溶液中的水含量不能超过5%。
[0019] 试验例2 鸡肉中含有70%左右的水，在用乙腈提取其中的磺胺类药物残留时，水分也进入到了提 取液中。鸡肉中含水量的测定方法为，称取鸡肉样品5.00克于事先烘干并在干燥器中冷却 至室温的铝盒中，置于103°C烘箱中干燥4小时，取出置干燥器中，冷却至室温称重，结果如 表2。
[0020] 从表2可以看出：5克鸡肉样品含水3.46~3.66 g之间。若用50 mL乙腈提取鸡肉中 磺胺类药物，则提取液中水分含量均在5%以上，因而需要在提取后期将提取液浓缩至体积 为300~600 yL，以便在净化步骤中可以将含水量在5%以下。
[0021] 实施例1 (1)提取:称取5±0.05 g试料置于聚丙稀离心管中，加无水硫酸钠4 g和乙腈25 mL， 祸动混合15 s，中速振荡20 min，2500 r/min离心5 min，上清液移至分液漏斗中，加入30 mL正己烷，振摇2 min后，静止5 min，分离乙腈层，用25 mL乙腈将沉淀物重复提取1次，乙 腈层经同一份正己烷分配，合并乙腈层于100 mL鸡心瓶中，加入正丙醇5 mL，50°C减压浓 缩至体积为300~600 yL，得到残余液； (2)净化:往残余液中添加乙腈复溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的复溶液全部 过碱性氧化铝SPE柱，不收集，用5 mL乙腈-水(95+5)洗涤鸡心瓶，并过碱性氧化铝SPE柱，吹 去柱内滞留的液体，用5 mL乙腈-水（75+25)洗脱待测物至10 mL容量瓶中，用0.017 mol/L磷酸定容至10 mL，用0.45 ym微孔滤膜过滤，收集滤液作为试样溶液，供高效液相色 谱测定。
[0022] 检测项目为除了 SDM和SQ的其余5种，即磺胺嘧啶（SD)、磺胺间甲氧嘧啶（SMM)、磺 胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺甲氧嗪（SMP)和磺胺甲噁唑（SMZ)，残余液(VI):乙腈(V2)=l:20。上 述的VI为残余液体积，V2为乙腈体积。
[0023] HPLC测定:采用《农牧发[2001]38号文中方法之五:动物源食品中磺胺类药物残 留的检测方法一一高效液相色谱法》中记载的方法进行测定。具体地，色谱条件：色谱 柱C18柱，250X4.6 mm，粒径5wn;流速一1 mL/min;检测波长一270 nm;进样量50 yL。 测定方法：以色谱峰面积积分值定量，外标法计算浓度和保留率。
[0024] 实施例2 (1) 提取:称取5±0.05g试料置于聚丙稀离心管中，加无水硫酸钠4g和乙腈25mL，祸 动混合15s，中速振荡20min，2500r/min离心5min，上清液移至分液漏斗中，加入30mL正己 烷，振摇2min后，静止5min，分离乙腈层，用25mL乙腈将沉淀物重复提取1次，乙腈层经同 一份正己烷分配，合并乙腈层于100mL鸡心瓶中，加入正丙醇5mL，50°C减压浓缩至体积为 300~600此，得到残余液； (2) 净化:往残余液中添加乙腈复溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的复溶液全部 过碱性氧化铝SPE柱，不收集，用5mL乙腈-水(95+5)洗涤鸡心瓶，并过碱性氧化铝SPE柱，吹 去柱内滞留的液体，用5mL乙腈-水（75+25)洗脱待测物至10mL容量瓶中，用0.017mol/L 磷酸定容至10mL，用0.45 wii微孔滤膜过滤，收集滤液作为试样溶液，供高效液相色谱测 定。
[0025] 检测项目为7种磺胺，即磺胺嘧啶(SD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDM)、 磺胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺甲氧嗪（SMP)、磺胺甲噁唑（SMZ)、磺胺喹噁啉（SQ)，若7种磺胺全 检，则所述残余液(VI):复溶液乙腈(V2)=l: 40。上述的VI为残余液体积，V2为乙腈体积。上 述的VI为残余液体积，V2为乙腈体积。
[0026] HPLC测定:采用《农牧发[2001]38号文中方法之五:动物源食品中磺胺类药物残 留的检测方法一一高效液相色谱法》中记载的方法进行测定。具体地，色谱条件:色谱柱一 C18柱，250 X4.6mm，粒径5wii;流速 lmL/min;检测波长 270nm;进样量50yL。测定方法： 以色谱峰面积积分值定量，外标法计算浓度和保留率。
【主权项】
1. 一种提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，其特征是，包括以下步骤： (1) 提取:取肉试料采用乙腈提取两次，两次提取的上清液分别用正己烷进行分配，然 后合并乙腈层，加入正丙醇5mL，50°C减压浓缩至体积为300~600yL，得到残余液； (2) 净化:往残余液中添加乙腈复溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的复溶液全部 过碱性氧化铝SPE柱，而后用乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，过滤得到试样溶液，供高效液 相色谱测定。2. 根据权利要求1所述提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，其特征是， 所述步骤（1)具体操作为:称取5 ± 0.05g肉试料置于聚丙烯离心管中，加无水硫酸钠 4g和 乙腈25mL，祸动混合15s，中速振荡20min，2500r/min离心5min，上清液移至分液漏斗中，加 入30mL正己烷，振摇2min后，静止5min，分离乙腈层，用25mL乙腈将沉淀物重复提取1次， 乙腈层经同一份正己烷分配，合并乙腈层于IOOmL鸡心瓶中，加入正丙醇5mL，50°C减压浓 缩至体积为300~600yL，得到残余液。3. 根据权利要求1或2所述提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，其特征 是，所述步骤(2)具体操作为:往残余液中添加乙腈复溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得 的复溶液全部过碱性氧化铝SPE柱，不收集，用乙腈-水洗涤鸡心瓶，并过碱性氧化铝SPE柱， 吹去柱内滞留的液体，用5mL乙腈-水洗脱待测物至IOmL容量瓶中，用0.017mol/L磷酸 定容至IOmL，用0.45μηι微孔滤膜过滤，收集滤液作为试样溶液，供高效液相色谱测定。4. 根据权利要求3所述提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，其特征是， 所述步骤(2)中，往残余液中添加乙腈复溶后，溶液中含水量在2.5%以下。5. 根据权利要求4所述提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，其特征是， 所述步骤(2)中，检测磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑 时，所述残余液Vl:乙腈V2)=l: 20，上述的Vl为残余液体积，V2为乙腈体积。6. 根据权利要求5所述提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，其特征是， 所述步骤(2)中，洗涤鸡心瓶的乙腈-水的乙腈和水的体积比为95:5,用于洗脱的乙腈-水 溶液的乙腈和水的体积比为75: 25。7. 根据权利要求4所述提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，其特征是， 所述步骤(2)中，检测磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪、 磺胺甲噁唑和磺胺喹噁啉时，所述残余液Vl:复溶液乙腈V2=l: 40，上述的Vl为残余液体积， V2为乙腈体积。8. 根据权利要求7所述提高肉中磺胺类药物残留测定准确度的前处理方法，其特征是， 所述步骤(2)中，洗涤鸡心瓶的乙腈-水的乙腈和水的体积比为95:5,用于洗脱的乙腈-水 溶液的乙腈和水的体积比为75: 25。
【文档编号】G01N30/02GK105891389SQ201610215220
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】殷秋妙, 吴维煇, 王威利, 林雪贤, 张展, 续倩, 李亚菲
【申请人】广东省农业科学院农产品公共监测中心