专利名称：四氢叶酸化合物光学纯非对映异构体的制备方法
技术领域：
本发明介绍的是制备光学纯四氢叶酸化合物非对映异构体的一种新方法，该方法包括在得自细菌的甲酰四氢叶酸合成酶存在下仅仅将5，6，7，8-四氢叶酸外消旋混合物中的5，6S，7，8-四氢叶酸组分转化成10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸。
甲酰四氢叶酸及其盐已知是有药效的。见Remington's Pharmaceutical Services，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1985(Remington's)p.1023。Kerwar et al.，U.S.4，746，662揭示，注射甲酰四氢叶酸或其盐，可增强甲氨喋呤的抗关节炎功效。EPO Patnet Publication No.0，266，042，May 4，1988，介绍了用甲酰四氢叶酸纯异构体制备甲氨喋呤救援剂，与5-氟脲嘧啶合用治疗结肠直肠癌，以及治疗叶酸缺乏。Wisowaty et al.在U.S.4，500，711中描述了甲酰四氢叶酸及其盐的纯化。
甲酰四氢叶酸常规以盐的形式投药，例如碱金属和碱土金属的盐，如甲酰四氢叶酸钙盐，最好是1-异构体。
化合物N-((((2-氨基-5-甲酰基-3，4，5，6，7，8-六氢-4-氧代-6-喋啶基-甲基)氨基)苯甲酰基)-L-谷氨酸，钙盐(1∶1)，五水合物，(甲酰四氢叶酸钙USP)以分子式(Ⅰa和Ⅰb)1∶1混合物的钙盐形式出售，这两个分子式中化合物在C-6位分别具有(R)和(s)立体化学。
它主要用作如甲氨喋啶等叶酸拮抗剂的解毒剂，后者阻断二氢叶酸向四氢叶酸的转化。甲酰四氢叶酸盐用水配制，加适当的防腐剂，作注射用。如Physician's Desk Reference，43 ed.Medical Economics Company，Oradell，NJ 1989(PDR 43rd ed.)P.1124中四氢叶酸钙盐注射剂项下所述。
两种异构体的药代动力学行为有以下不同点(S)-异构体(Ⅰb)选择性地从胃肠道吸收，并比(R)-异构体(Ⅰa)有较短的血浆半衰期。
据报道(C.Temple，Jr.，J.P.Rose，W.R.Laster & J.A.Montgomery，Cancer Treatment Reports，65，1117-1119(1981))，天然存在的异构体Ⅰb，即6S非对映异构体，由于其恢复一碳代谢的有效性，在抢救治疗中是重要的。
非天然存在的5，10-甲烯四氢叶酸非对映异构体抑制从L.casei合成胸腺嘧啶核苷酸(R.P.Leary，y.Gaumont，& R.L.Kisliuk，Biochem.and Biophys，Res.Commun.，56，484-488(1974))，同一非对映异构体也抑制来自大肠杆菌(E.coli)的5，10-甲烯四氢叶酸脱氢酶(V.F.Scott & K.O.Donaldson.Biochem.and Biophys.Res.Commun.，14，523-526(1964))，以上报告连同10-甲酰四氢叶酸同一非对映异构体是来自小鸡肝脏的甘氨酰胺核苷酸甲酰基转移酶(GAR)的强力竞争性抑制剂这一观察，表明四氢叶酸一碳衍生物的非天然存在的非对映异构体既抑制嘧啶也抑制嘌呤的生物合成，从而抑制DNA的生物合成。因此，非天然存在的形式不能认为是生物学惰性的。如果这样的抑制出现在哺乳动物系统，那么就存在仅仅对天然形式(6S)的四氢叶酸特别是甲酰四氢叶酸的潜在临床需求。
非对映异构体组分Ⅰa和Ⅰb已经采用分步结晶和色谱法(J.Feeney，B.Birdsall，J.P.Albrand，G.C.K.Roberts，A.S.Bungen，P.A.Charlton & D.W.Young，Biochem.，20，1837(1981)加以分离(D.B.Cosulich，J.M.Smith，Jr.& H.P.Proglist，J.Am.Chem.Soc.，74，4215(1953))。有人报告，经二氢叶酸还原酶催化，立体专一性地还原二氢叶酸以立体特异性地提供6(S)-异构体(L.Rees，E.Valente，C.J.Suckling & H.C.S.Wood，Tetrahedron，42，117(1986))。
L.Rees，E.Valente，C.J.Sucking & H.C.S.Wood，Tetrahedron，42，117-136描述了四氢叶酸，包括甲酰四氢叶酸的手性衍生物的合成。这一系统需用来自大肠杆菌(E.coli)的二氢叶酸还原酶和还原辅助因子NADPH的广泛而昂贵的再循环。另一篇论文L.Rees，C.J.Suckling & H.C.S.Wood，J.Chem.Soc.Chem.Commun.470，(1987)(European Patent Application 0 266 042 A2)描述了6(R，S)-四氢叶酸用(-)-氯甲酸
酯酰化，生成N-5衍生物，后者作为非对映异构体混合物经分步沉淀而得到分离。各非对映异构体再分别用甲酸和溴化氢在醋酸中进行处理，接着水解，得到各5-甲酰四氢叶酸的非对映异构体。
现已发现，按照本发明可较容易地生产四氢叶酸化合物的光学纯非对映异构体。本方法有一个超过以前发表过或取得专利的方法的主要优点，即它惊人地简单，关键步骤只需使用一种酶，四氢叶酸甲酰化酶，或者叫做叶酸激活酶或甲酰四氢叶酸合成酶(FTHFS)，当使用5，6(R，S)，7，8-四氢叶酸的外消旋混合物(Ⅱa，b)时，这种酶也只是将所需的甲酰基选择性地加在6S非对映异构体上。此外，利用这种酶有超过使用二氢叶酸还原酶的一种明显的优点，因为不必应用辅助因子的广泛再生系统。
四氢叶酸甲酰化酶可由产气微球菌(Micrococus aerogenes)，柱胞梭菌(Clostridium cylindrosporum)，尿酸梭菌(Clostridiumacidi-urici)，Clostridium thermoaceticum，和其它微生物，植物和动物制取。D.H.Butlaire，Methods In Enzymology，66，585-599(1980)。
在酶促甲酰化反应中，用放射性同位素标记的甲酸铵或任何其它包括在原位制得的放射标记甲酸盐或甲酸衍生物，可以得到标记的(Ⅲb)并转化为标记的(Ⅳb)或标记的(Ⅰb)。借助于5，10-甲烯四氢叶酸脱氢酶，任何放射标记的，带有5，6S，7，8-四氢叶酸(Ⅰb，Ⅲb或Ⅳb)(最好是(Ⅳb))的甲酰基可被转化为标记的5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，后者继而在5，10-甲烯四氢叶酸还原酶的作用下可被转化为放射标记的5-甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸。应用本发明产生的放射标记的(Ⅰb)是生产放射标记的5，6S，7，8-四氢叶酸衍生物的有用化合物。
本发明方法也意外地使未被酶甲酰化的5，6R，7，8-四氢叶酸(Ⅱa)得到分离。分得的(Ⅱa)可即以本身出售(作为稀有化合物商品)，也可在类似R.G.Moran & P.D.Colman，Anal.Biochem.122，70-78(1982)描述的手续中，充当生产诸如5-甲酰基-5，6R，7，8-四氢叶酸(Ⅰa)的起始物质，该方法用甲酸，而水溶性羰二亚胺如1-乙基-3-(3'-二甲基-氨丙基)羰二亚胺可用可不用。但在(Ⅲb)转变为(Ⅳb)和/或(Ⅰb)完全后，更可取的是分离(Ⅱa)。这使得用诸如反相色谱较容易地分离各组分。而且，(Ⅱa)可在(Ⅳb)和/或(Ⅰb)存在时被修饰，因为(Ⅱa)的5位仍有活性而(Ⅳb)或(Ⅰb)的5位不活泼，生成衍生化的(Ⅱa)，例如5-羧甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸，后者可在简单的吸附步骤中从(Ⅳb)或(Ⅰb)中分离出来。
如C.Temple，Jr.，L.L.Bennett，Tr.，J.D.Rose，R.D.Elliott，J.A.Montgomery & J.H.Mangum，J.Med.Chem.，25，161-166(1982)所报导的，分得的(Ⅱa)可起反应以制备各种5-和10-位取代的，5，10双取代的，和5，10-桥接取代的5，6R，7，8-四氢叶酸衍生物。特别是，如J.A.Blair & K.J.Saunders，Anal.Biochem.，34，376(1970)提供的方法中所描述的，在碱性条件下可从(-Ⅱa)和甲醛及硼氢化钠合成5-甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸。日本专利73 32，120(1973);Chem，Abst.，80，2792×(1974)介绍，在N，N-二甲基乙酰胺中，(Ⅱa)用硫酸二甲酯可于55℃烷基化。
在上述反应中，用放射性同位素标记的甲酸或其衍生物或放射性烷基化剂取代甲酸或烷基化剂，可得到放射标记的5，6R，7，8-四氢叶酸衍生物。
按照本发明，放射标记的5，6S，7，8-四氢叶酸衍生物和放射标记的5，6R，7，8-四氢叶酸衍生物及其盐类均可分别制得，它们对于测试，例如研究酶促反应机制是有用的。
根据本发明，提供了一种四氢叶酸衍生物或其盐或酯的期望的实质纯(6R或6S)非对映异构体的制备方法，此方法包括以下步骤(a)四氢叶酸或取代的四氢叶酸或其盐或酯的6R和6S非对映异构体混合物中的6S型物酶促甲酰化，生成含下列物质的混合物10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯;可能有的未反应的5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，未反应的5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，以及采用以下两步骤之一，(b)(1)从与5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯的混合物中分出10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，然后环化和水解该10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，以生成5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，或5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，或二者均有;或(2)在有5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯的情况下，环化和水解该10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，以生成5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，或5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，或上述两者均生成;然后采用下述两种方法之一(ⅰ)衍生化5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯以生成5-取代的5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，然后分离这些组分，或(ⅱ)从5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯分离存在的5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸或5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯;在分离后如有必需，(3)化学法甲酰化、环化和水解上述未反应的5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，以生成5-甲酰基-5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，或者，用其它功能基团衍生化上述5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，以生成5-取代的5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯;如有必需，(c)将实质纯的5-甲酰基5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯或5-甲酰基-5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯转化为相应的酸、盐或酯。
本方法的产品本身例如在治疗上是有价值的，并可作为中间体制备其它有用产品，以及当放射性同位素标记时，可用于例如研究酶促反应的机制。对本技术熟练的人们会知道如何为这样的目的而使用这些化合物。
本方法更可取的是用于制备所需的实质纯5-甲酰基5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯。这些化合物作为抢救剂具有有价值的性质。特别可取的是本方法其中用于选择性甲酰化的酶是四氢叶酸甲酰化酶。还有，本方法对于制备期望的(放射标记)四氢叶酸或其盐或酯的衍生物的实质纯(6R或6S)非对映异构体有用处。这些物质可用于研究酶促反应机制。
本发明所用的起始化合物可用对生化转换技术熟练的人们所熟知的技术进行制备。用C.Temple，Tr.，R.D.Elliott，J.D.Rose & J.A.Montgomery，J.Med.Chem.，22，731(1979)的方法，经叶酸的硼氢化钠还原反应可制备Ⅱa(R)和Ⅱb(S)的混合物。
从这些物质开始，本发明方法的反应图解如图解1所示
如图解2所示，可与(Ⅲb)用色谱法分开得(Ⅱa)，(Ⅱa)用甲酸进行甲酰化，在间歇生成(Ⅰa)的情况下得到咪唑啉盐(Ⅳa)，后者在结晶化后水解产生非天然形式纯异构体的甲酰四氢叶酸(Ⅰa)。或者，(Ⅲb)和(Ⅱa)的混合物，可转化(Ⅲb)为(Ⅳb)和/或(Ⅰb)，从而产生(Ⅳb)和/或(Ⅰb)和(Ⅱa)的混合物。色谱法容易地分离此混合物的组分，即(Ⅱa)与(Ⅳb)和/或(Ⅰb)分离。
这一分离过程也构成了6R和6S四氢叶酸非对映异构体的事实上的分离。因为可用化学方法将(Ⅱa)转变为(Ⅰa)，本发明正式确立了(Ⅰb)和(Ⅰa)的一种有效分离方法，(Ⅰb)和(Ⅰa)通常地被称之为天然和非天然形式的甲酰四氢叶酸。
以下实施例阐明本发明但不意味着以任何方式限制权利要求。
操作手续 A进行柱胞梭菌(Clostridium cylindrosporum)(也称作Clostridiumsp.-ATCC No.7905)的分离和培养。
由于梭状芽胞杆菌属(Clostridium)是一种厌氧微生物，所有培养物生产、维持和处理操作都要在该菌株最少暴露于氧的条件下进行。同样，由于四氢叶酸及其衍生物的极端对氧不稳定性，涉及这些化合物的所有步骤均在无氧时处理。
1.尿酸培养基的配制。按ATCC Media Handbook-Recipe No.519所述，配制尿酸培养基。
尿酸培养基组成尿酸 3.0g酵母提取物 1.0g磷酸氢二钾 4.0g硫酸镁七水合物 0.1g硫酸铁 5.0mg＊0.04%酚红溶液 1.0g巯基乙酸钠 0.5g蒸馏水 1.0L＊0.1g指示剂需用14.9ml 0.01N氢氧化钠，用蒸馏水稀释到250ml得0.04%溶液。在配制培养基时，将尿酸悬于几乎全容积的液体中，加热至沸，用氢氧化钠调至持久的玫瑰红色(pH7.6)，pH用试纸测出。制备固体培养基时，在此培养基中加入20.0g琼脂。
将此培养基倾入带螺帽的烧瓶中至几乎全满，然后边通入无氧的氮气边煮沸。在压热灭菌处理后，立即将烧瓶盖拧得相当紧。
培养基贮于室温以避免低温下尿酸沉淀。
2.在生长培养基上接种柱胞梭菌(Clostridium cyclidrosporm)培养物。
所有步骤均在手套袋中于厌氧条件下进行。将1.0ml一份液状尿酸培养基加入得自ATCC的细菌冻干颗粒。将颗粒溶解，用一个可灭菌处理的只用一次即弃的接种环把再悬浮的培养物在尿酸平板培养基上划线。平板放入一个含H2-CO2发生袋和亚甲兰指示剂条的无氧罐中。
装有接种板的无氧罐在37℃培养。24小时内平板上生长明显，呈淡色、透明的手指样凸起从菌落幅射开来。在相差显微镜下显示典型的梭状芽胞杆菌属(Clostridium)细胞形态和芽胞形成。
3.永久性柱胞梭菌(Clostridium cylindrosporum)贮备培养物的制备。
在Hungate管(Bellco Glass Co.)中配制尿酸培养基-10ml培养基/管，作为永久性柱胞梭菌(Clostridium cylindrosporum)贮备培养物的来源。用灭菌接种环桃取上述菌落中单个菌落样本的细胞，并刺入Hungate管培养基中。这一步骤在一个含氮气的厌氧袋中进行。Hungate管放在厌氧罐中35℃培养。5天后，将这些管子从罐中取出，用弹性薄膜(parafilm)密封管帽，贮于室温直至进一步使用。
4.液体生长培养基接种物的制备半固体尿酸培养基管(2.5g/l Bacto-琼脂)接种上柱胞梭菌(Clostridium cylindrosporum)菌落，如上面提到的在35℃下培养，然后贮于室温。如下节所述，这些培养物作为液体培养基生长的接种源。
5.柱胞梭菌(Clostridium cyclindrosporum)的液体培养基培养一个软琼脂管的培养物(总量10ml)加到1升液体尿酸培养基中。所有操作均在厌氧袋中进行，整个培养物在厌氧罐中35℃培养4天。
操作手续 B进行柱胞梭菌(Clostridium cylindrosporum)的甲酰四氢叶酸合成酶粗提物制备。
象手续A一样，所有培养物生产、维持和处理操作都要在菌株最少暴露于氧的条件下进行，因为梭状芽胞杆菌(Clostridium)是一种厌氧菌。同样地，由于四氢叶酸及其衍生物的极端对氧不稳定性，涉及这些化合物的所有步骤均在无氧下进行。为此目的使用一种连接于无氧氮气源的塑料无氧袋设备。1升培养物变为混浊，颗粒状物质从培养基在析出。将培养物分成4×250ml，加入4×250ml离心瓶中，在Beckman J2-21离心机中于4℃，8，000RPM离心15分钟。
虽然培养基冷至4℃，由于尿酸被细菌所消耗，故不发生沉淀。细胞粒再悬浮于4×25ml冰冷的蒸馏水中，如上进行离心。此颗粒在检测甲酰四氢叶酸合成酶前应于-20℃冷冻5天。
冻结的颗粒在总量4.0ml的缓冲液(0.05M磷酸二氢钾，0.05M2-巯基乙醇(加1M氢氧化钾调至pH7.5))中融化，将颗粒混和，于室温下间歇旋动60分钟使溶解。由于细胞溶化，细胞粒显而易见地变得粘稠。室温下出现自溶。将细胞溶化物于17，000RPM离心30分钟，上清液保留在冰上并检测甲酰四氢叶酸合成酶。
操作手续 C用Buttlaire“Purification and Properties of Formyltetrahydrofolate Synthetase”，Enzymology Vol.66，p.585，(1980)提供的方法，进行甲酰四氢叶酸合成酶测定。
实施例 1用最近文献方法(C.Temple，Jr.，R.D.Elliott，J.D.Rose & J.A.Montgomery，J.Med.Chem.22，731(1979))，应用硼氢化钠，还原叶酸至5，6(R.S)，7，8-四氢叶酸。
实施例 210-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸的生成配制适合于5，6S，7，8四氢叶酸的酶促甲酰化，生成10甲酰基5，6S，7，8-四氢叶酸的下述反应混合物100ml 1.0M三羟乙基胺盐酸盐(pH8.0)，100ml 0.5M三磷酸腺苷(pH8.0)，100ml 0.5M氯化钾，100ml 0.1M氯化镁六水合物，和200ml 0.2M甲酸铵(pH8.0)。全部5g一小瓶的5，6(R，S)，7，8-四氢叶酸(Sigma;69%纯度，批号117F-5013)悬浮于200ml 0.2M Tris-HCl/0.05M2巯基乙醇(pH7.0)，加入约15ml 1M氢氧化钾使之溶解。将澄清的溶液倒入2升玻璃瓶内的上述混合物中，加入蒸馏水(约200ml)，使总反应混合物为1.0升。
加入4ml含“甲酰四氢叶酸合成酶”(FTHFS)的粗酶提取物，反应开始，使反应在室温下(22℃)进行。周期性地取出样品，用高压液相色谱法(HPLC)监测反应进程。HPLC使用的是反相柱(C-18)，用甲酸及30分钟内从12%到25%的甲醇线性梯度洗脱。柱洗脱液于282nm处监测，在12分钟时检出5，6(R，S)，7，8-四氢叶酸，在16分钟时检出5，10-次甲基-四氢叶酸。反应在18小时后完成。这时，用曲线下面积测得占原始量48%的5，6(R，S)，7，8-四氢叶酸被剩下。从代表5，10-次甲基四氢叶酸的HPLC色谱图计算出反应混合物中有相当量为1585mg的10-甲酰基5，6S，7，8-四氢叶酸，这说明理论值的92%发生转化，这个理论值是考虑到开始的3450mg5，6(R，S)，7，8-四氢叶酸中仅1725mg可被酶促转化反应所利用。理论值的50%是在5小时后被转化的。
实施例 310-甲酰基5，6S，7，8-四氢叶酸向5-甲酰基
-5，6S，7，8-四氢叶酸的转化实施例2的反应混合物再监测一天，显示其组成不变。将100ml一份的混合物转入一个三颈瓶中，用硫酸调节溶液的pH至6.5。用氮脱气后，将瓶浸入水浴，于90-95℃加热2小时。然后在氮气下于40℃反应过夜。16小时后此反应混合物具有棕色外观。取样品经HPLC分析，用反相柱(C-18)，0.1M甲酸及30分钟内由12%到25%的甲醇线性梯度洗脱。柱洗脱液于282nm处检测。HPLC分析表明，对于5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸峰和5-甲酰基5，6S，7，8-四氢叶酸峰，就曲线下面积而言，转化率为90.2%。应该是不发生变化的5，6R，7，8-四氢叶酸的面积，相对于起始物质的面积(48%)，减少到33.1%。
反应混合物的样品经泵加于制备性HPLC反相柱(Dynamax 60A-C18，8μm，2.1×30cm)，然后用0.1M含水甲酸和甲醇梯度以13ml/分钟流速展开60分钟。得到微黄色的5-甲酰基5，6S，7，8-四氢叶酸，总得率82%，它在酸性洗脱条件(0.1M含水甲酸和甲醇)下可转化为5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，后者处于3-6mg/ml浓度时，在收集瓶中形成凝胶。本样品的对映体纯度经HPLC测定，用手性柱(Diacel Chiracel OD)，以0.5%甲酸铵(pH＝3.8)和25%甲醇等强(isocratically)洗脱。记录保留时间为15.2分钟，在甲醇中的光学旋光性如下化合物 浓度(%) 旋光性(88%甲酸溶液) (αD26℃)5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸 0.611 +42实施例 45，10-次甲基5，6S，7，8-四氢叶酸转化为
5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸和5，6R，7，8-四氢叶酸从实施例2得到的反应混合物的剩余部分用硫酸将pH调至8.0-5.0，引起10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸快速环化生成5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，后者置于室温下缓慢起水解，生成5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸。在调节pH前反应混合物中检不出后者。
反应用HPLC跟踪，用反相柱(C-18)，以0.1M甲酸及在30分钟内以12%到25%的甲醇线性梯度进行洗脱。HPLC对反应的监测揭示，在室温下反应5天后，原来的5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸中70%以上转变为5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸，而在这段时间内反应混合物中5，6R，7，8-四氢叶酸的浓度保持不变。然后将甲酰化产物(5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸和5，10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸)和未甲酰化的5，6R，7，8-四氢叶酸用制备性HPLC反相柱(Dynamax 60A-C18，8μm，2.1×30cm)进行分离，用0.1M含水甲酸和甲醇梯度以13ml/分钟的流速展开60分钟。两种制剂(各相当于50ml反应混合物)被测得产量如下分离得到的化合物(mg) 产率(%) 相对产率5，10-次甲基5，6S，7，8-四氢叶酸(22.6) 12.9 6.55-甲酰基-5，6S，7，8四氢叶酸(118.2) 67.5 33.85，6R，7，8-四氢叶酸(145.5) 83.1 41.6＊将分离得到的5，6R，7，8-四氢叶酸立即干燥，并用甲酸进行甲酰化(如下如所述)以获得5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸，该物质与6S型物不同，在稀甲酸中结晶析出。
实施例 5
5，6R，7，8-四氢叶酸甲酰化生成晶状的5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸将冻干的色谱纯5，6R，7，8-四氢叶酸253mg样品溶于50ml含2%三氟乙酸的97%甲酸中，在反应瓶内放在室温氮气下，不加搅拌。反应经HPLC分析，用反相柱(C-18)，以0.1M含水甲酸及在30分钟内以12%到25%的甲醇线性梯度进行洗脱，于282nm处检测。3小时后，如HPLC色谱图上出现的代表5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸的新峰所判定的，全部5，6R，7，8-四氢叶酸已起了反应。大部分甲酸由于蒸发而被除去，在偶尔旋动混合物的情况下将30ml 0.1M含水甲酸缓慢加入。然后将溶液在冷库里贮存过夜，生成黄色的微细针状物，使溶液呈现固体状。将结晶收集在玻璃砂芯漏斗上，用丙酮洗涤，真空干燥，得到218mg黄色结晶物质。
结晶形5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸的对映体纯度是用手性柱(Diacel Chiracel OD)进行测定的，用0.5%甲酸铵(pH3.8)和25%甲醇等强洗脱。产物5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸在18.2分钟时被洗脱。
在88%甲酸中的溶液测得的光学旋光性如下浓度(%) 旋光度化合物 (88%甲酸溶液) (αD26℃)5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸 0.619 -47实施例 6在有5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸和/或5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸存在时5，6R，7，8-四氢叶酸的衍生化为了改进L.Rees，C.J.Suckling & H.C.S.Wood，J.Chem.Soc.Chem.Commun.470(1987)所述方法，将(-)氯甲酸
酯加入从实施例4所得反应混合物的样品中，调节到pH7，这导致仅仅5，6R，7，8-四氢叶酸的羧甲基化，留下5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸和/或5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸未起反应。此反应用HPLC监测。将反应混合物通过一个充填着xAD-2的柱完成5-
氧羰基-5，6R，7，8-四氢叶酸与未反应组分的有效分离。5-
氧羰基-5，6R，7，8-四氢叶酸被树脂吸附，而5-甲酰基-5，6R，7，8-四氢叶酸或5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸通过柱子流出。
实施例 7用制备性HPLC纯化5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸，5，6R，7，8-四氢叶酸及其它衍生物将实施例4的部分反应混合物(50或100ml)通过加样泵直接加于反相柱(Dynamax 60A-C18，8μm，2.1×30cm)，然后用0.1M含水甲酸和甲醇以13ml/分钟的流速，梯度展开60分钟。所用的梯度以5%的甲醇浓度开始，展开12分钟后达到10%。然后10%的甲醇浓度保持恒定10分钟，这时(展开22分钟)起甲醇的水平直线上升，在38分钟时达到18%，此后进一步上升，在展开52分钟时达到25%。这一浓度不再继续提高至展开结束。在319nm处检测柱流出液，因为5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸和5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸在此波长下有相同的吸收系数。
在这些制备条件下，5，6R，7，8-四氢叶酸在11-17.5分钟之间洗脱而5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸在39.5-44.5分钟之间洗脱。5，10-次甲基5，6S，7，8-四氢叶酸谱带的洗脱是极浓度依赖性的，在20-30分钟之间以拖尾峰出现。当超过140ml反应混合物，若相当于700mg以上物质上柱时，5，6R，7，8-四氢叶酸谱带和5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸谱带不能被完全分离。
将5，6R，7，8-四氢叶酸和5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸的各洗脱区带收集在玻璃瓶中，将瓶浸入于冰使该液体立即冻结。然后将冻结的各组分冷冻干燥，5，6R，7，8-四氢叶酸得到灰白色粉末，5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸得到黄白色的粉末。对这些粉末进行HPLC分析，用反相柱(Dynamax 60A-C18，8μm，2.1×30cm)以0.1M含水甲酸和甲醇梯度展开。从曲线下面积表明，5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸纯度为97%，5，6R，7，8-四氢叶酸纯度为93%。由于5，6R，7，8-四氢叶酸的不稳定性，将它通过化学甲酰化作用转变为较稳定的5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸。为对付5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸的稳定性问题，将此化合物按实施例8所述转变为其钙盐。
实施例 85-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸钙和5-甲酰基-5，6R，7，8-四氢叶酸钙的制备在对C.Temple，Jr.R.D.Elliott，J.D.Rose & J.A.Montgomery，J.Med.Chem.，22，731(1977)发表的生成外消旋5-甲酰基-5，6(R，S)，7，8-四氢叶酸钙的方法加以改进上，将制得的5-甲酰基-5，6，7，8-四氢叶酸用乙醚洗涤以除去可能含有的甲酸铵。然后将62mg洗过的物质溶于32ml脱气的甲醇(无盐甲酰基-5，6，7，8-四氢叶酸易溶于甲醇)，加入约1ml氯化钙的甲醇溶液(每ml甲醇中含72mg氯化钙)。此盐的加入使一种米色的沉淀立即形成，将其收集在玻璃砂芯漏斗上真空干燥。干燥后的产量是60.5mg(理论产量的90%)。
若将此过程重复用于6R物质，则得到5-甲酰基-5，6R，7，8-四氢叶酸钙。
不考虑任何非紫外(uv)吸收物质的存在，用UV/HPLC测定制得的化合物的纯度。在5，10-次甲基-5，6(R，S)，7，8-四氢叶酸衍生物阶段用HPLC测定对映体的纯度，用手性柱(Diacel Chiracel OD)以0.5%甲酸铵(pH3.8)和25%甲醇等强洗脱。5，10-次甲基-5，6S，7，8四氢叶酸先洗出，保留时间为15.2分钟，而5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸在18.2分钟中洗出。
制得的化合物与其如文献中报道的配成10M或12M盐酸溶液，不如配成甲酸溶液，以记录它们的光学旋光性质，因用甲酸酸性减弱和对叶酸类的溶解能力增大。上述制剂的样品显示如下光学旋光性浓度(%) 旋光度化合物 (88%甲酸溶液) (αD26℃)5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸＊ 0.611 +425，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸＊＊ 0.619 -47＊色谱法分得5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸，它处于洗出的0.1M甲酸混合物中时转变为5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，然后固化形成凝胶，后者再冷冻干燥。
＊＊原分离得未转化的5，6R，7，8-四氢叶酸，在冷却干燥后立即如前所述用甲酸进行甲酰化。收集从稀甲酸混合物中结晶出来的生成物5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸，用丙酮洗涤，真空干燥。从253mg5，6R，7，8-四氢叶酸中，收集得到218mg结晶的5，10-次甲基-5，6R，7，8-四氢叶酸。
实施例 9放射性同位素标记的甲酰基叶酸及其衍生物的制备若用放射性同位素标记的甲酸铵或其它放射标记的甲酸衍生物取代甲酸铵重复实施例2的手续，则获得放射标记的10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸。若使之经受包括实施例3-8的手续，可得到相应的放射性标记的酸和盐。
上述各专利、出版物和试验方法收编在此作为参考文献。
前面的详细说明书对那些在本技术范围内熟练者提出了很多明显的变动。例如，代替甲酰四氢叶酸钙，可产生甲酰四氢叶酸锶和甲酰四氢叶酸钠。四氢叶酸甲酰化酶可由Clostridium acidi-urici精制而得。所有这些明显的改进包括在所附权利要求书的全部预期的范围之中。
权利要求
1.一种制备5，6(R或S)，7，8-四氢叶酸或其盐或酯期望的实质纯(6R或6S)非对映异构体的方法，该方法包括以下步骤(a)酶促甲酰化四氢叶酸或取代的四氢叶酸或其盐或酯的6R和6S非对映异构体混合物的6S型物，以形成含10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，未反应的5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯(若存在的话)；未反应的5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯的混合物，并(b)(1)在与5，6R，7，8-四氢叶酸其盐或酯的混合物中分离出10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，然后环化和水解所述的10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，使产生5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，或5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，或前面二者均有；或(2)在存在5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯时，环化和水解所述10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，使产生5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，或5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯；或前面二者均有，此后进行以下两步之任一步(i)衍生化5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯使生成5-取代的-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯然后分离这些组分；或用(ii)从-5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯混合物中分离出所含5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸和所含5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，分离后，如所希望，可(3)化学甲酰化、环化和水解所述未反应的-5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯使产生5-甲酰基-5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，或者可用其它功能基因衍生化所述-5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯使生成5-取代的-5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，如果希望的话可(c)转化实质纯的5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯或5-甲酰基-5，6R，7，8-四氢叶酸或其盐或酯成为相应的酸、盐或酯。
2.一种如权利要求1所限定的方法，其特征为用于选择性甲酰化的酶包括一种四氢叶酸甲酰化酶。
3.一种如权利要求2所限定的方法，其特征在于，所述四氢叶酸甲酰化酶是由Clostridium sp.ATCC No.7905或其一种突变体精制而成的。
4.一种如权利要求1所限定的方法，其特征在于，未反应的5，6R，7，8-四氢叶酸的化学甲酰化是在羰二亚胺存在下用甲酸进行的。
5.一种如权利要求1所限定的方法，其特征在于，转化步骤(c)包括转化叶酸衍生物为相应的盐。
6.一种如权利要求5所限定的方法，其特征在于，所述的盐包括一种钙盐、一种镁盐、一种锶盐、一种铁盐、或上述任何盐的混合物。
7.一种如权利要求1所限定的方法，其特征在于，所述酶促甲酰化反应在一种含放射性同位素标记的甲酸或一化学相当物的反应混合物中进行。
8.一种用于制备期望的实质纯5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其一种盐或一种酯的方法，其特征在于，该过程包括如下步骤(a)用酶促甲酰化一种5，6，7，8-四氢叶酸或其一种盐或酯的6R和6S非对映异构体混合物的6S型物使形成一种混合物，包含10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢呋酸或其一种盐或一种酯;未反应的5，6S，7，8-四氢叶酸或其一种盐或一种酯(如果存在的话);和未反应的5，6R，7，8-四氢叶酸或其一种盐或一种酯，和(b)在存在5，6R，7，8-四氢叶酸或其一种盐或一种酯时，环化和水解所述的10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其一种盐或一种酯，使形成5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸，或5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或它们的盐或酯，或前二者都有，此后(c)在与5，6R，7，8-四氢叶酸或其一种盐或一种酯的混合物中分离出所含5，10-次甲基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其盐或酯，如果需要的话(d)转化实质纯的5-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸或其一种盐或一种酯为相应的酸、盐或酯。
9.一种如权利要求8所限定的方法，其特征在于，用于选择性甲酰化的酶包括一种四氢叶酸甲酰化酶。
10.一种如权利要求9所限定的方法，其特征在于，所述四氢叶酸甲酰化酶是由Clostridium sp.ATCC No.7905，或其一种突变体精制而成的。
11.一种如权利要求8所限定的方法，其特征在于，转化步骤(d)包括转化叶酸衍生物为相应的盐。
12.一种如权利要求11所限定的方法，其特征在于，所述的盐包括一种钙盐、镁盐、锶盐、铁盐、或任何上述盐的混合物。
全文摘要
本发明描述了一种制备四氢叶酸化合物的光学纯非对映异构体的方法，例如，在甲酰四氢叶酸合成酶存在下，仅仅将5，6，7，8-四氢叶酸外消旋混合物中的5，6S，7，8-四氢叶酸组分转化为10-甲酰基-5，6S，7，8-四氢叶酸，接着是环化，水解和衍生化。对于制取(放射标记)四氢叶酸衍生物及其盐或酯所期望的实质纯(6R或6S)对映体，此方法也是有用的。
文档编号C07D475/04GK1052509SQ9010961
公开日1991年6月26日 申请日期1990年11月27日 优先权日1989年12月11日
发明者策尔哈德·施林曼, 斯图尔特·艾伦·罗森菲尔德 申请人:美国氰胺公司