专利名称：(6s)-和(6r)四氢叶酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及制备N-〔4-〔〔(2-氨基-1，4，5，6，7，8-六氢-4-氧代-(6S)-蝶啶基)-甲基〕氨基〕苯甲酰基〕-L-谷氨酸(以下称为(6S)-四氢叶酸)及其盐和制备N-〔4-〔〔(2-氨基-1，4，5，6，7，8-六氢化-4-氧代-(6R)-蝶啶基)-甲基〕苯甲酰基〕-L-谷氨酸(以下称(6R)-四氢叶酸)及其盐的方法。
四氢叶酸衍生物含有2个不对称中心。在此情况下，由于由叶酸、N-(蝶酰)-L-谷氨酸合成这些衍生物，在谷氨酸基中含有的旋光碳原子以L形式存在，而通过在蝶酰基的5，6位置上的双键的氢化反应而形成的在6位置上的旋光碳原子是以外消旋的(6R，S)形式存在，因此，四氢叶酸的合成衍生物由两种非对映体的1∶1的混合物组成。在自然界，例如在肝脏中，只发现一种非对映型的四氢叶酸盐，即(6S)型的5，6，7，8-四氢叶酸盐。
四氢叶酸盐，如5-甲酰基-5，6，7，8-四氢叶酸(甲酰四氢叶酸)的钙盐或5-甲基-5，6，7，8-四氢叶酸的钙盐，作为药物，主要用来治疗巨红细胞叶酸贫血症，作为解毒药主要用来提高叶酸拮抗物的耐药力，特别是癌的治疗(甲酰四氢叶酸抢救法)中的氨基蝶呤和氨甲蝶呤的耐药力，用来提高5-氟尿嘧啶的治疗效果和用来治疗自身免疫疾病，例如治疗银屑病和类风湿性关节炎，以及用来提高化疗中的某些杀寄生虫药的耐受性，例如三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺甲噁唑的耐受性。
四氢叶酸是用来制备各种各样四氢叶酸衍生物的基本物质。
制备(6S)-或(6R)四氢叶酸的努力，迄今已得出以下方法-酶催化法-物理化学法-化学法酶催化法包括化学上正常进行的还原法，由叶酸还原成7，8-二氢叶酸，随后例如按照L.Rees在Tetrahedron 42(1)，117-36(1986)中所述的方法或按EP-A2-0，356，934的方法进行酶催化还原，由此生成(6S)-5，6，7，8-四氢叶酸。但是，在反应步骤上使这些方法只能停止在7，8-二氢叶酸阶段是困难的，因此在酶催化阶段只有很少的时-空产率，而且需要象还原了的烟酰胺腺嘌呤磷酸二核甙(NADPH)之类的昂贵辅助成分和需要一种建立起来的通常是复杂工作方法。迄今所知的用酶催化制备旋光纯的四氢叶酸的方法不适合于工业规模的制备。
有人也试图借助于色谱法分离非对映体对。(见J.Feeney等，Biochemistry，20，1837，(1981)。这些方法不适于在工业规模上制备这些非对映体。
从这类物理化学方法中也知道叶酸在手性电极上的一种非对称还原(见S.Kwee et al.，Bioelectrochem.Bioenerg.7，693-698，(1980))。由于还原反应中所允许的叶酸浓度(通常是10-3M)还原反应发生后只能困难地实现除去非对称的诱导物，这些还原反应，不管怎样，也不能用于工业化生产。
在化学合成领域，在旋光性催化剂存在下，就存在叶酸的非对称加氢的可能性，例如根据P.H.Boyle等在J.Chem.Soc.Chem.Commun.(1974)，10，375-6中的方法。但是这需要使用很昂贵的催化剂。这些催化剂在发生均匀催化作用后，只能在损耗大量产品的情况下被分离出来。
因此至今还没有在工业上可以利用的，用于获得旋光纯的四氢叶酸的方法。
因此，本发明的目的是要研究出一种简单的在工业上可用的并且经济的制备旋光纯的四氢叶酸的方法。
现意外地发现，在加入磺酸或硫酸后，可从(6R，S)-四氢叶酸或其盐的水溶液中沉淀出相应的旋光的四氢叶酸加成盐，这可通过过滤得到，非对映体加成盐可从滤液中分离出来。然后通过重结晶和/或析出四氢叶酸，接着使其转化成盐的方法对这两种盐进行化学和光学提纯。更令人意外的是，通过其它盐例如盐酸加成盐的制备/重结晶没有检测出光学的富集，而在磺酸或硫酸加成盐的结晶时却发生了光学离析(见W.Frick，et al.，Helv.Chim.Acta，57，2658-61(1974)。甚至用其它一些强酸例如氢溴酸、氢碘酸、硝酸、磷酸、甲酸、草酸、一氯-，二氯-和三氯乙酸，也没能得到四氢叶酸的一种差向异构体的增浓。
本发明涉及制备(6S)-和(6R)-四氢叶酸及它们的磺酸或硫酸加成盐的方法，其特征是使(6R，S)-四氢叶酸与磺酸或硫酸反应，将得到的酸加成盐进行分步结晶，如果需要，可通过用碱处理，使(6S)-和/或(6R)-四氢叶酸从得到的非对映体酸加成盐中释出，并加以分离。
这里所用的(6R，S)-四氢叶酸可以是分离出的产物，或者最好是就地直接使用叶酸的还原产物。
适于本发明方法的磺酸有含有6-14个碳原子的芳族磺酸，含有7-9个碳原子的芳脂族磺酸或含有2-3个碳原子的脂族磺酸。适用的芳族磺酸主要为苯磺酸、甲苯磺酸、二甲苯磺酸、硝基苯磺酸、氯苯磺酸、硝基甲苯磺酸、萘磺酸、取代的萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、苯并咪唑磺酸、取代的苯并咪唑磺酸(例如2-苯基苯并咪唑-5-磺酸)以及许多其它芳族磺酸化合物。
适合的芳脂族磺酸主要是甲苯磺酸，适合的脂族磺酸主要为甲磺酸和乙磺酸。
本发明方法优先选用的加成盐是苯磺酸加成盐、甲苯磺酸加成盐和硫酸加成盐。
结晶过程在极性介质中进行。适合的介质特别是水或水和较低级的水溶性脂族羧酸的混合物，特别是乙酸和乳酸或液态水溶性酰胺如甲酰胺，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，1-甲基吡咯烷酮、2-哌啶酮。混合物通常含有至少50%的水。使用这种混合物通常会提高产品的旋光纯度，但会降低收率。最佳反应条件取决于所希望达到的目的和特殊的原料，是可通过系统试验毫无困难地确定的。
由于四氢叶酸对氧化物用的敏感性，建议使用氧化抑制剂，如2-巯基乙醇。
在结晶过程中，通常是(6S)-四氢叶酸的加成盐首先沉淀出来，非对映的(6R)-化合物富集于滤液中。
旋光富集的四氢叶酸可以很容易通过加碱，从盐中再析出来。
提出化学和光学纯化的又一可能性是用(6S)-或(6R)-四氢叶酸及其与强碱强酸生成的盐变得很容易接受而且特别经济。
本发明也涉及(6S)-或(6R)-四氢叶酸及其与磺酸或与硫酸生成的加成盐的用途。这些四氢叶酸及其加成盐是按照旋光纯的5，10-亚甲基四氢叶酸及其与强碱或强酸生成的盐的制备方法，通过用甲醛处理获得的。这里要考虑是由(6S)-四氢叶酸与甲醛反应获得5，10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸和用类似方法由(6R)-四氢叶酸获得5，10-亚甲基-(6S)-四氢叶酸。
下面是说明
具体实施例方式以下HPLC方法(高效液相色谱法)用来测定四氢叶酸的纯度及5-甲酰-，5-甲基-及5，10-亚甲基四氢叶酸的纯度。
洗脱液A 0.03M Na2HPO4+0.03M KH2PO4水溶液洗脱液B 1份(0.03M Na2HPO4+0.03M KH2PO4水溶液)3份甲醇然后用H3PO4调节至pH7.8梯度25分钟内洗脱液B由2%到95%柱ODS(Hypersil)检测器UV-300nm以下HPLC方法用来测定(6S)-含量衍生作用将四氢叶酸或加成盐溶于1∶1的乙腈/水中，与2，3，4，6-四-O-乙酰(基)-β-D-吡喃葡萄糖基异硫氰酸盐反应。
洗脱液2.5份乙腈1.5份甲醇6.0份0.02M的柠檬酸柱RP-8(Lichrosphere)检测器UV-270nm实施例1在60℃和氨气保护下，将14.3克甲苯-4-磺酸(150摩尔%)溶于含有0.1%2-巯基乙醇的440毫升水中。于五分钟内导入25克纯净的(6R，S)-四氢叶酸，将获得的悬浮液冷却至40℃，在2-5小时后过滤出沉淀产物，用水洗，然后用乙醇洗涤。
获得含86.7%(6S)的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐16.9克(用高效液相色谱法(HPLC)测定)。
将得到的产品在110毫升N，N′-二甲基甲酰胺和220毫升水的混合物中重结晶，获得含97.5%(6S)的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-碘酸加成盐(用HPLC法测定)。〔α〕25D＝-60.6°(C＝0.5%在DMF中)。
为了释出(6S)-四氢叶酸，将含有0.1%2-巯基乙醇的170毫升水在氨气保护下冷却至10℃。淋入5克(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐，将4毫升2N的氢氧化钠溶液滴入此悬浮液中。冷却至2℃后，滤出沉淀产物，用水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含97.7%(6S)的(6S)-四氢叶酸3.7克(用HPLC法测定)。
〔α〕25D＝-44.5°(C＝1%在水中)实施例2在20℃和氨气保护下将13克甲苯-4-磺酸(135摩尔%)溶于由200毫升醋酸和含有0.2%2-巯基乙醇的200毫升水组成的溶液中，迅速加入25克纯净的(6R，S)-四氢叶酸。以少量纯正的(authentic)(6S)-四氢叶酸-甲苯-4-磺酸加成盐作为晶种加入溶液，5小时后，过滤出沉淀物，用醋酸/水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含93.6%(6S)的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐12.7克(用HPLC法测定)。
在25℃和氮气保护下，将10.0克所得到的(6S)-四氢叶酸-甲苯-4-磺酸加成盐悬浮在100毫升水中，并用30%的氢氧化钠溶液调节到pH＞3.5。然后用37%的盐酸将所得到的溶液的pH值调到1以下。经过12个小时后，过滤出沉淀物，用水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含99.7%(6S)的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐8.9克(用HPLC法测定)。
〔α〕25D＝-62.0°(C＝0.5%在DMF中)。
实施例3在27℃和氮气保护下，将14.3克甲苯-4-磺酸(150摩尔%)溶入由22毫升L(+)一乳酸和含有0.2%巯基乙醇的220毫升水组成的溶液中。迅速加入25.0克纯净的(6R，S)-四氢叶酸。以少量纯正的(6S)-四氢叶酸-甲苯-4-磺酸加成盐作为晶种加入溶液并冷却到20℃，经过15至20小时后，过滤出沉淀物，用乳酸/水先涤，然后用乙醇洗涤。
获得含92.5%(6S)的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐15.1克(用HPLC法测定)。
实施例4在27℃和氮气保护下，将14.3克甲苯-4-磺酸(150摩尔%)溶于由110毫升1-甲基-2-吡咯烷酮和含0.4%2-巯基乙醇的110毫升水组成的溶液中。迅速加入25.0克纯净的(6R，S)-四氢叶酸。用200毫升水将此溶液稀释并冷却至20℃，经过15-20小时后，过滤出沉淀产物，用1-甲基-2-吡咯烷酮/水洗涤然后用乙醇洗涤。
获得含94.7%(6S)的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐13.3克(用HPLC法测定)。
实施例5在27℃和氮气保护下，将11.5克甲苯-4-磺酸(150摩尔%)溶于由90毫升N，N′-二甲基甲酰胺和含0.4%2-巯基乙醇的90毫升水组成的溶液中，迅速加入20克纯净的(6R，S)-四氢叶酸。用180毫升水稀释此溶液并冷却至20℃，经过15-20小时后，用N，N′-二甲基甲酰胺/水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含91.4%(6S)的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐11.3克(用HPLC法测定)。
实施例6在27℃和氮气保护下，将11.5克甲苯-4-磺酸(150摩尔%)溶于由100毫升N，N′-二甲基乙酰胺和含0.4%2-巯基乙醇的80毫升水组成的溶液中。迅速加入20克纯净的(6R，S)-四氢叶酸。用160毫升水将此溶液稀释并冷却至20℃，经过15-20小时后，过滤出沉淀产物，用N，N′-二甲基乙酰胺洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含91.5%(6S)的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐11.0克(用HPLC法测定)。
实施例7在70℃和氮气保护下，将12克苯磺酸(150摩尔%)溶于含有0.1%2-巯基乙醇的440毫升水中。在5分钟内加入25克纯净的(6S，R)-四氢叶酸，并将所得到的悬浮液冷却至60℃。经过2-5小时后，过滤出沉淀产物，用水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含92.4%(6S)的(6S)-四氢叶酸的苯磺酸加成盐13.8克(用HPLC法测定)。
在25℃和氮气保护下，将所得到的10.0g(6S)-四氢叶酸-苯磺酸加成盐悬浮于100克水中并用30%的氢氧化钠溶液将其调节到pH＞3.5。然后再用37%的盐酸将所得到的溶液的pH值调到1以下。经过12个小时后，过滤出沉淀产物，用水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含99.8%(6S)的(6S)-四氢叶酸的苯磺酸加成盐9.0克(用HPLC法测定)。
〔α〕25D＝-63.5°(C＝1%，在DMF中)。
如果用55摩尔%苯磺酸和50摩尔%盐酸代替所使用的150摩尔%苯磺酸，在相同的结晶条件下，获得含91.6%(6S)的(6S)-四氢叶酸的苯磺酸加成盐12.7克(用HPLC法测定)。
为释出(6R)-四氢叶酸，用氢氧化钠溶液将滤液的pH值调节到3.5。冷却到5℃后，过滤出沉淀产物，用水洗涤，然后用乙醇洗涤。
在50℃和氮气保护下，将所得到的10克滤渣溶于由含0.1%2-巯基乙醇的150毫升水和39毫升2N硫酸组成溶液中。经1.5小时缓慢地冷却到20℃之后，接着让其静置12小时，过滤出沉淀产物，用水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含97.7%(6R)的(6R)-四氢叶酸的硫酸加成盐9.7克(用HPLC法测定)。
实施例8首先在60℃下将30毫升2M硫酸加到由含有0.2%2-巯基乙醇的130毫升水和164毫升冰醋酸组成的溶液中。在5分钟内加入20克纯净的(6R，S)-四氢叶酸。使此获得溶液冷却至50℃。一小时后，过滤出沉淀产物，用水/冰醋酸洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含65.5%(6S)的(6S)-四氢叶酸的硫酸加成盐11.0克(用HPLC法测定)。
通过将10克(6S)-四氢叶酸的硫酸加成盐两次在1∶3的二甲基甲酰胺/水中重结晶，获得含94.3%(6S)的(6S)-四氢叶酸的硫酸加成盐3.9克(用HPLC法测定)。
实施例9按照文献中所述的方法(例如按照R.L.Blakley等在《Folates and Pterins》1，93-104(1984)中所述的方法)使就地制成的(6R，S)-四氢叶酸进一步直接和甲苯-4-磺酸进行反应
在25℃和氮气保护下将50克叶酸悬浮于200毫升水中(例如，按照C.Temple在《J.Med.Chem.》22，731(1979)中所述的方法)，用大约40克30%氢氧化钠溶液将溶液的pH值调到12。加入溶于110毫升水中的25克硼氢化钠(630摩尔%)后，将此反应混合物加热到70-75℃并在此温度下保持90分钟。冷却至25℃后，将溶于200毫升冰醋酸中的30克甲苯-4-磺酸(150摩尔%)滴加到上面获得的(6R，S)-四氢叶酸钠盐中。然后用96克37%浓度的盐酸将溶液的pH值调节到1以下。过12个小时后，过滤出沉淀产物，用醋酸/水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含95.4%(6S)和纯度为82%的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐32.9克(用HPLC法测定)。
将上面获得的3.0克(6S)-四氢叶酸-甲苯-4-磺酸加成盐在25℃和氮气保护下悬浮在30毫升水中并用约3克30%氢氧化钠溶液调节到pH11.6。将溶于36毫升冰醋酸中的0.9克甲苯-4-磺酸(120摩尔%)滴加到如此获得的溶液中。然后用2.2克37%盐酸调节此溶液的pH值到1以下。过12小时后，过滤出沉淀物，用醋酸/水洗涤，然后用乙醇洗涤。
获得含98.9%(6S)和纯度为100%的(6S)-四氢叶酸的甲苯-4-磺酸加成盐1.81克(用HPLC法测定)。
实施例10用等当量的苯磺酸代替实施例9中的甲苯-4-磺酸，用相似的方法可以制备(6S)-四氢叶酸的苯磺酸加成盐。
获得含94.2%(6S)和纯度为80%的(6S)-四氢叶酸的苯磺酸加成盐。
实施例11用等当量的硫酸替代实施例9中的甲苯-4-磺酸，用相似的方法也可以制备(6S)-四氢叶酸的硫酸盐。
获得含69.2%(6S)和纯度为85%的(6S)-四氢叶酸硫酸盐27.1克(用HPLC法测定)。
实施例12～18以下的(6S)-四氢叶酸加成盐均可用类似于实施例1-8中所述的方法进行制备12(6S)-四氢叶酸的甲磺酸加成盐。
13(6S)-四氢叶酸的乙磺酸加成盐。
14(6S)-四氢叶酸的苯甲磺酸加成盐。
15(6S)-四氢叶酸的樟脑-10-磺酸加成盐。
16(6S)-四氢叶酸的萘-1-磺酸加成盐。
17(6S)-四氢叶酸的萘-2-磺酸加成盐。
18(6S)-四氢叶酸的萘-1，5-二磺酸加成盐。
实施例19在20℃和氮气保护下按照实施例8的方法获得的50克(6S)-四氢叶酸的硫酸加成盐和200毫升2N氢氧化钠溶液一起溶解在500毫升水中。在加入7.5毫升36%的甲醛(125摩乐%)后，将275毫升冰醋酸和275毫升2N硫酸的混合物加到此溶液中。冷却至2℃后，过滤出沉淀产物，并用乙醇洗涤。
获得含99.6%(6R)和纯度为98.6%的5，10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸39.6克(用HPLC法测定)。
实施例20在约25℃和氮气保护下，将按照实施例10的方法获得的28克(6S)-四氢叶酸的苯磺酸加成盐和30%的氢氧化钠溶液一起加入130毫升水中，在加入44毫升36%浓度的甲酸后，将该溶液分成二份，用3克NaBH4将其中的一半进行处理。经过12个小时后，加入10毫升37%的盐酸将其酸化。过滤出沉淀产物并分别用水和乙醇洗涤。
获得含99.5%(6S)和纯度为95.8%的5-甲基-(6S)-四氢叶酸11克(用HPLC法测定)。
另一半溶液用过量的氯化钙处理，过滤出沉淀产物并分别用水洗和乙醇洗涤。
获得含99.7%(6S)和纯度为96.2%的5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸钙盐(用HPLC法测定)。
权利要求
1.(6S)-和(6R)-四氢叶酸及其磺酸加成盐或硫酸加成盐的制备方法，其特征在于使(6R，S)-四氢叶酸与磺酸或硫酸反应，将生成的酸加成盐进行分步结晶，如有必要，可用碱处理使(6S)-和/或(6R)-四氢叶酸从非对映酸的加成盐中释出并加以分离。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于结晶过程在一种极性介质中进行，最好是在水中或在水与较低级的水溶性脂族羧酸的混合物中进行，特别是在水和乙酸、乳酸的混合物中进行，或在水与液态水溶性酰胺的混合物中，尤其在水和甲基吡咯烷酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺的混合物中进行。
3.按照权利要求1或2中的一项所述的方法，其特下在于作为磺酸使用的有含6至14个碳原子的芳族磺酸、含7至9个碳原子的芳脂族磺酸或含1至3个碳原子的脂族磺酸。
4.按照权利要求1，2或3中的一项所述的方法，其特征在于作为酸加成盐使用的有苯磺酸加成盐、甲苯-4-磺酸加成盐或硫酸加成盐。
5.(6S)-四氢叶酸苯磺酸盐和(6R)-四氢叶酸苯磺酸盐。
6.(6S)-四氢叶酸甲苯-4-磺酸盐和(6R)-四氢叶酸甲苯-4-磺酸盐。
7.(6S)-四氢叶酸硫酸盐和(6R)-四氢叶酸硫酸盐。
8.(6S)-四氢叶酸的甲磺酸、乙磺酸、苯甲磺酸、2-莰酮-10-磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸和萘-1，5-二磺酸的加成盐。
9.把按照权利要求1、2、3或4中之一项制备的(6S)-或(6R)-四氢叶酸或它们的磺酸加成盐或硫酸加成盐用作制备旋光纯的5，10-亚甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸或5-甲酰基四氢叶酸及其强碱或强酸盐的原料。
10.把(6S)-或(6R)-四氢叶酸的磺酸盐或硫酸盐用作某种药物的成分，或用作制备某种药物的原料。
全文摘要
本发明涉及(6S)-和(6R)-四氢叶酸及其磺酸加成盐或硫酸加成盐的制备方法，其特征在于使(6R，S)-四氢叶酸与磺酸或与硫酸进行反应，将生成的酸加成盐进行分步结晶，如果需要，可用碱处理，使(6R)-四氢叶酸从产生的非对映酸加成盐中释出并加以分离。本发明还涉及(6S)-和(6R)-四氢叶酸与磺酸或与硫酸生成的新颖的酸加成盐，涉及把它们用作药物或制备药物的原料和涉及把它们用来制备旋光的5-甲基-，5-甲酰-和5，10-亚甲基-四氢叶酸及其与强碱及与强酸的加成盐。
文档编号C07B57/00GK1063285SQ9210024
公开日1992年8月5日 申请日期1992年1月15日 优先权日1991年1月16日
发明者H·R·米勒, M·厄尔曼, J·康狄, G·默德尔 申请人:埃普罗瓦股份公司