专利名称：伯克氏菌的制备及其在高效溶磷微肥中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种伯克氏菌的制备及其在高效溶磷微肥中的应用，是一种磷素肥料增效剂，属于现代农业科学技术领域中的土壤培肥技术。
背景技术：
磷是一切生命存在的必需元素。在土壤一植物一动物生态系统中，磷是不可替代的营养元素，没有磷就没有细胞，没有植物，没有粮食，没有人类社会的可持续性发展。作为植物生长必需的三大营养元素之一，由于磷肥施入土壤后，90%左右的有效磷与土壤中的钙、铁、铝等固定成溶解性极低的磷酸化合物，植物很难吸收利用，当季植物利用率仅为 5% 25%。而土壤和作物根际存在大量能够溶解难溶性磷酸盐的微生物。向土壤接种这些溶磷菌，能够活化土壤难溶性磷和提高化学磷肥的利用率，显著地增强土壤供磷能力，增加作物吸收磷量，提高作物生物量和产量。近十几年来，随着农业生产的不断发展，农业生产对磷肥的需求日益增大。但是由于农田大量施用化肥，导致土壤中有机肥和无机肥的比例严重失调，土壤板结及恶化也越来越严重，土壤产出能力下降。因此，开辟新肥源，发展微生物肥料已成为当务之急。除了人工施用化学磷肥以外，施用能够分解土壤中难溶态磷的微生物，使其在作物根际形成一个磷素供应较充分的微区，改善作物磷元素的供应，也是一个重要途径。溶磷微生物自1903年被发现与报道以来，至今已有100多年的研究历史。前苏联研究者上世纪50年代就从土壤中筛选出溶磷菌株，并命名为解磷巨大芽抱杆菌iBacillus megatherium var. phosphaterium),远销到美国和埃及研究其效果。但其效果仅仅局限于无土栽培和小面积栽培，当施用到大面积栽培环境时，其效果甚微，而且在不同区域得到不同的结果。所以说溶磷菌肥料发展不快，应用还不普遍，其中最主要的是溶磷微生物种类多，分解机制不尽相同且复杂，虽然有一些研究，但不够深入，溶磷机理不十分明确，施入土壤后的消长动态，溶磷作用发挥的条件不十分了解。目前就土壤固定态P的微生物利用和转化研究中，对土壤微生物溶解难溶性磷酸盐的机制有几种认识，但都不能成为定论。其研究都是针对个别微生物，缺乏对整个溶磷微生物菌群的全面认识，研究的内容和深度还很不够。溶磷微生物与环境间相互作用的研究有待于进一步拓展。因此，针对有效磷缺乏、土壤潜在磷源丰富的现状，筛选高效解磷微生物，研制解磷微生物肥料并应用于农业生产，充分利用土壤潜在磷源，这对于缓解磷资源短缺、减少环境污染、发展持续高效高产农业具有深远的战略意义，也是国内外土壤肥料及植物营养学界研究的热点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种伯克氏菌的制备。本发明的另一个目的在于提供一种伯克氏菌在制备高效溶磷微肥中的应用，其作为微肥用于玉米生长促进剂，不仅能改善植物磷素营养，还能促进土壤中有益微生物的代谢活动，显著改善植物根部营养，达到增产效果；利用微生物来活化土壤固定态磷和提高化学磷肥利用率，无疑是节约资源、保护环境行之有效的方法。
本发明的技术方案是这样实现的1、伯克氏菌的制备，其特征在于具体步骤如下
土壤样本的采集采集种植玉米的贫磷土壤放入塑料袋中，置于4°C的冰箱保存；菌株 (伯克氏菌)的分离及筛选，筛选培养基葡萄糖10. 0克，(NH4)2SO4 0. 5克，NaCl 0. 3克，KCl 0. 3 克，MgSO4 · 7Η20 0. 3 克，FeSO4 .7H2O 0. 03 克，MnSO4 · 4Η20 0. 03 克，( (PO4) 2 10. 0 克， 酵母粉0. 5 g琼脂粉15 g，PH值7.0 7. 2，水1000 mL ；在121°C条件下灭菌20min然后制作平板固体培养基备用；将土壤样品在无菌条件下分别进行10倍梯度稀释，制成10 — 1 10一6系列稀释液，然后分别取0. 1 mL不同稀释度的样品以平板划线法涂布于以上制作的筛选平板培养基二8°C培养3 d后，选取产生透明圈(溶磷圈)较大的菌落转接到溶磷平板培养上，菌株纯化后，挑出，斜面保藏；伯克氏菌溶磷能力的测定以上述溶磷培养基为主要成分制作液体培养基，然后分别量取100 mL分装在250 mL三角瓶中，加入1 mL已培养24 h的菌液，28° C 30° C，120 r/min摇床培养，分别在48 h、72 h、96 h及120 h， 取上清液进行钼锑抗比色法测定菌株溶解无机磷能力；菌株的鉴定对筛选获得的菌株进行了 DNA测序和16S rRNA系统发育树构建，鉴定为伯克氏菌，其序列见附件；伯克氏菌在溶磷微肥的应将能够活化和溶解土壤多种难溶磷、提高磷肥利用率的伯克氏菌进行菌体发酵培养成一级种子液，然后通过二、三级扩繁培养制备发酵液(发酵液的菌体密度为2亿 /ml)，最后选择适宜的载体和稳效助剂进行吸附制备固体溶磷生物肥料(溶磷固体肥料的菌数含量为2亿/克)，或者在液体发酵液中加入乳化剂和分散剂制成液面喷施的溶磷生物肥料产品；该产品在农作物上应用具有促进作物生长、提高磷肥利用率和增加作物产量的功能。本发明的积极效果是对壤难溶性磷活化的活化率可以达到10. 94% 13. 03%, P素利用率达到21. 75% - 37. 98%，在玉米上应用可减少三分之一的磷肥用量；溶磷微生物肥料具有成本低、效果好、增强植物抗病能力、不污染环境、充分利用潜在磷素资源等优点。
图1为土壤中筛选的伯克氏菌产生的溶磷圈。图2为伯克氏菌生产的葡聚糖酸的高效液相色谱图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述 实施例1
(一)高效溶磷微生物菌株的筛选及鉴定 1、菌株的筛选
从我省中部地区采取种植玉米的土壤样品，用稀释平板分离法，在无菌操作条件下取土样lg，用无菌水以10倍梯度稀释成 ο—1 10_6稀释液，取稀释液0. ImL涂布基础培养基平板观°C培养，分离筛选到功能菌株M株(表1)。2、菌株溶磷能力的测定
以磷酸钙为唯一磷源，对分离筛选的菌株进行溶磷能力测定。结果表明，分离获得的菌株58. 3的菌株具有较强的综合能力(如图1所示)，其中溶磷能力最强的是来源于黑土的14号和M号菌株，其次是来源于黑土的15、16、17、18号菌株和来源于黑钙土 22号菌株(如表1)。以磷酸钙为磷源上形成的溶磷圈说明筛选的菌株具有较强的溶磷效果(如图 2所示)。总体趋势是长期不施磷肥的土壤中溶磷菌的活性较强。3、菌株的鉴定
分别对综合能力较强的4、5、12、13、、14、18和24号菌株进行了 DNA测序和16S rRNA系统发育树构建，分别鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain Q1)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis serovar kurstaki strain AR-10)、焚光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens PfO—1)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus 生产禁用菌)、伯克金氏菌(Burkholderia sp. CEB01056)、Oxalobacteraceae bacterium NR186 禾口肠杆菌 (Enterobacter ludwigii strain K9)(如表 1)。( 二)溶磷菌发酵在玉米上的施用效果及其对磷素效率的影响 (1)溶磷生物肥料对玉米产量及生物学性状的影响
分别在吐丝期和收获期调查了玉米的株高、茎粗、叶面积等生物学性状及产量性状，结果列于表2。溶磷菌发酵液对玉米株高、茎粗和叶面积等生物学性状的影响结果表明，各个处理与对照(磷肥、菌液均不用)相比均有明显增加的趋势，但处理间差异不十分显著。从溶磷菌发酵液对玉米产量性状的影响结果分析，穗长、穗粒数、百粒重以处理3(全量化肥与菌液配施)最高，处理1(磷肥减量2/ 和处理2 (磷肥减量1/ 次之；从产量结果分析，全量磷肥的处理3显著高于不施磷肥的处理4 (只施菌液不施磷肥)和处理5 (CK)，但与处理1和处理2相比差异不显著.说明在本试验条件下与溶磷菌发酵液配施，磷肥用量减少1/3或2/3的处理与全量磷肥产量差异不显著，各个处理与对照相比均表现明显的增产效应。(2)溶磷生物肥料对玉米植株及土壤磷素状况的影响
分别在玉米吐丝期和收获后测定的玉米植株的养分吸收量，结果见表3、表4。吐丝期溶磷生物肥料对土壤磷素影响的测定结果表明，溶磷生物肥料对活化土壤难溶性磷、提高磷肥利用率(减少磷肥施用量)均有较为明显的作用。从试验结果可以看出， 溶磷生物肥料的施用可使土壤全磷含量的提高10. 11%，速效磷含量提高8. 09% ；而当磷肥施用量减少1/3时，土壤全磷和速效磷均高于全量磷肥的处理，尤其是土壤全磷达到差异极显著水平；当磷肥施用量减少2/3时，土壤全磷和速效磷含量低于全量磷肥和减量1/3的处理。而从植株的养分吸收效率分析，以减量1/3磷肥处理的磷吸收效率最高，菌液对土壤难溶性磷的活化效率达到13. 0%。溶磷生物肥料对玉米整个生育期植株磷素效果的影响结果表明，由于溶磷菌液的施入可使磷肥利用率达到21. 75% - 37. 98%，较目前生产上磷肥的平均利用率(20%)提高了 1. 75-17. 98百分点，同时溶磷生物肥料对土壤难溶性磷的活化效率达到10. 94%。而且，从植株养分吸收效率可以看出磷肥减量1/3的处理与全量磷肥处理吸磷量无明显差异。实施例2:
(1) 土壤样本的采集采集种植玉米的贫磷土壤放入塑料袋中，置于4°C的冰箱保存。(2)菌株(伯克氏菌)的分离及筛选
筛选培养基葡萄糖 10. O 克，(NH4)2SO4 0. 5 克，NaCl 0. 3 克，KCl 0. 3 克，MgSO4 · 7H20 0. 3 克，FeSO4 · 7Η20 0. 03 克，MnSO4 · 4Η20 0. 03 克，Ca3(PO4)2 10. 0 克，酵母粉 0. 5 g 琼脂粉15 g，PH值7.0 7. 2，水1000 mL ；在121°C条件下灭菌20min然后制作平板固体培
养基备用；
将土壤样品在无菌条件下分别进行10倍梯度稀释，制成10 —1 10 —6系列稀释液，然后分别取0. 1 mL不同稀释度的样品以平板划线法涂布于以上制作的筛选平板培养基，培养3 d后，选取产生透明圈(溶磷圈)较大的菌落转接到溶磷平板培养上，菌株纯化后，挑出，斜面保藏。(3)伯克氏菌溶磷能力的测定以上述溶磷培养基为主要成分制作液体培养基，然后分别量取100 mL分装在250 mL三角瓶中，加入1 mL已培养M h的菌液， 28° (T30° C，120 r/min摇床培养，分别在48 h、72 h、96 h及120 h，取上清液进行钼锑抗比色法测定菌株溶解无机磷能力。(4)菌株的鉴定
对筛选获得的菌株进行了 DNA测序和16S rRNA系统发育树构建，鉴定为伯克氏菌。
权利要求
1.伯克氏菌的制备，其特征在于具体步骤如下土壤样本的采集(1)采集种植玉米的贫磷土壤放入塑料袋中，置于4°c的冰箱保存；(2)菌株(伯克氏菌)的分离及筛选，筛选培养基葡萄糖 10. 0 克，(NH4)2SO4 0. 5 克，NaCl 0. 3 克，KCl 0. 3 克，MgSO4 · 7H20 0. 3 克， FeSO4 · 7H20 0. 03 克，MnSO4 · 4H20 0. 03 克，Cei3(PO4)2 10. 0 克，酵母粉 0. 5 g 琼脂粉 15 g，PH值7.0 7. 2，水1000 mL ；在121°C条件下灭菌20min然后制作平板固体培养基备用；将土壤样品在无菌条件下分别进行10倍梯度稀释，制成10 —1 10 —6系列稀释液，然后分别取0. 1 mL不同稀释度的样品以平板划线法涂布于以上制作的筛选平板培养基，培养3 d后，选取产生透明圈(溶磷圈)较大的菌落转接到溶磷平板培养上，菌株纯化后，挑出，斜面保藏；(3)伯克氏菌溶磷能力的测定以上述溶磷培养基为主要成分制作液体培养基，然后分别量取100 mL分装在250 mL三角瓶中，加入1 mL已培养M h的菌液， 28° (Γ30° C, 120 r/min摇床培养，分别在48 h、72 h、96 h及120 h，取上清液进行钼锑抗比色法测定菌株溶解无机磷能力；(4)菌株的鉴定对筛选获得的菌株进行了 DNA测序和 16S rRNA系统发育树构建，鉴定为伯克氏菌。
2.根据权利要求1所述的伯克氏菌的制备，其特征在于所述的伯克氏菌的序列为
3.伯克氏菌在溶磷微肥中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种伯克氏菌的制备及其在高效溶磷微肥中的应用，其特征在于具体步骤如下(1)采集种植玉米的贫磷土壤放入塑料袋中，置于4℃的冰箱保存；(2)菌株(伯克氏菌)的分离及筛选；(3)伯克氏菌溶磷能力的测定；(4)菌株的鉴定对筛选获得的菌株进行了DNA测序和16SrRNA系统发育树构建，鉴定为伯克氏菌。其对壤难溶性磷活化的活化率可以达到10.94%～13.03%，P素利用率达到21.75%－37.98%，在玉米上应用可减少三分之一的磷肥用量。溶磷微生物肥料具有成本低、效果好、增强植物抗病能力、不污染环境、充分利用潜在磷素资源等优点。
文档编号C12N1/20GK102226161SQ201110128569
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者于雷, 刘春光, 刘淑霞, 吴海燕, 李明姝, 王巍巍, 王洪君, 盖嘉慧, 范作伟, 金荣德, 陈宝玉, 高星爱 申请人:吉林省农业科学院