本发明涉及动物分子遗传学技术领域，尤其涉及一种zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用。
背景技术：
在自然条件下，几乎所有哺乳动物的性别比例都接近1:1，从而实现了无间断地进行稳定地繁衍后代，在自然的条件下达到生态平衡。对于畜牧生产实际而言，理想的性别比例具有十分重要的意义。利用泌乳、产蛋性状进行生产的生产企业希望得到更多的雌性个体，而产肉、产毛性状的在雄性个体上表现得优势性更加明显。一直以来，人类对控制动物后代的性别就有着极大的兴趣。目前性别控制主要从受精前和受精后两个方面进行，前者应用精子分离后再进行受精，使得在受精时就决定了后代的性别；后者采用早期胚胎性别鉴定，进行胚胎的性别筛选的方法来控制后代的性别。
哺乳动物性别决定理论认为，性染色体为“XX”的受精卵就能够发育成雌性个体，而性染色体为“XY”的就会发育成雄性。那么从根本上讲，控制家畜性别最理想的方法是先分离X、Y精子，然后再进行受精，就能人为地控制后代的性别，理论上这是在性别控制中最简单、最经济的途径。自20世纪50年代后，关于精子分离的研究报告很多，这些研究都试图利用X精子和Y精子不同的物理特性(体积、密度、电荷、运动性))，采用离心法、电泳法、离子交换法、细胞表面抗原法等不同的方法来实现精子的分离，但是都有一个共同的问题——可重复性差。而且这些差异随着环境条件的不同而发生变化，因此，许多研究结果常常不一致，甚至出现相反的结论，致使两类精子某些差异性研究存在争议。到目前为止，除了X、Y精子DNA含量具有差异可以肯定之外，其他方面的差异表现很小，甚至难以确定。但是随着分子生物学技术的不断发展，以及研究工作的继续深入，新的研究成果将会不断涌现。
目前根据哺乳动物X、Y精子DNA含量存在差异的原理，利用流动细胞检索仪进行分离X、Y精子，分离效果最好，纯度可达90％以上，但是由于设备昂贵，分离速度慢，用于受精的精子数量少、活力差等原因，远远不能满足生产上对性控精液的大量需求。相比之下，如果能够找到两种精子发育或受精过程中，甚至胚胎发育时关键性的X、Y染色体特异mRNA，结合当代新兴的分子生物学技术利用RNA干扰(RNA Interference，RNAi)的方法则有望以较低的成本，简便、快速地实现对动物的性别控制。
RNAi是一种转录后的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS)现象，通过体外人工合成或体内产生的双链RNA(Dubble-stranded RNA.dsRNA)在细胞内特异性地降解其同源的mRNA，使得相应的基因干扰，实现阻止目标基因的表达。RNAi方法能够快速、简便、有效、特异地下调细胞中的基因表达，它不但是研究基因功能的一种有力工具，而且也为特异性基因治疗提供了新的技术手段，其应用前景十分广阔。
在基因组、mRNA和蛋白水平的研究都证明，X、Y精子基因表达的确存在差异。基因表达检测研究表明，在精子形成的减数分裂粗线期，为防止一些酶类与性染色体发生作用，两条性染色体高度浓缩形成性体。性体的形成保护了性染色体，性染色体上特殊基因的表达被关闭。因此，哺乳动物成熟精子中没有mRNA的转录，然而哺乳动物成熟精子中却含有mRNA，这种差异来自精子发生过程中的转录，其翻译远落后于转录。这些mRNA是精子成熟后指导合成一些必须的蛋白，或者是受精后对卵母细胞mRNA库的补充，或作为RNAi对生育和胎儿生长发育起着关键的作用。
Hendriksen等对小鼠的研究发现，减数分裂过程中，除Xist基因表达外，几乎所有的性染色体基因都没有表达，然而减数分裂后期，一些性染色体特异基因开始表达。减数分裂后，检测到Y染色体上Ubely 和Sry基因具有较高的mRNA水平；在X精子中也检测到Ubelx基因mRNA高水平表达，同时发现X染色体特异基因Mhr6A的表达产物。另外还有人发现X、Y染色体其他特异基因的表达，如X染色体特异基因Akap82(精子尾部的骨架蛋白)及Nap-X(编码一种核相关蛋白)，Y染色体特异基因Zfy-1、Zfy-2及Y353/B。
其中Zfx/Zfy基因是染色体上编码锌指蛋白的一对等位基因，从减数分裂期开始表达，在圆形精子细胞中的含量最高。Zfx基因是ZFY(zinc finger-Y)基因家族中的一员，ZFY家族包括Zfx，Zfy和Zfa基因，他们在分子结构上非常相似。一般哺乳动物有Zfx和Zfy基因,Zfx基因位于X性染色体上,是雌、雄性哺乳动物X染色体必含的基因,Zfy基因位于Y性染色体上，两个基因位于性染色体的末端，但并不位于同源区域。Zfx基因包括一个酸性的转录激动区域，一个核定位序列和一个DNA连接区，具有13个C2H2[Cys(2)His(2)]型锌指结构。在哺乳动物细胞中，C2H2锌指结构是最常见的蛋白质结构之一。目前已发现800多种具有这种锌指结构的蛋白质，具有重要的生理功能。Zfx/Zfy编码的蛋白作为转录因子，在精子形成过程中具有一些功能并与精子的发生有关。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明实施例提供一种zfy基因的RNA干扰片段，主要目的是通过对雄性犬的生殖细胞Y精子生成的相关基因进行沉默，阻碍或者破坏Y精子的正常发育和功能。
为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种zfy基因的RNA干扰片段，其序列为GCAAGAACTTTCCTCATAT、GACAGCTGAACAAGGCTTA、GAAGTCATCAAGGTATACA或GGATGAAGATGAACTTGCA。
另一方面，本发明实施例提供了一种上述实施例所述的zfy基因的RNA干扰片段在控制犬子代性别中的应用。
作为优选，上述的应用中，以zfy基因的RNA干扰片段对犬精子细胞中的Y精子生成相关基因进行沉默，产生特定类型的精子细胞。
另一方面，本发明实施例提供了一种表达载体，所述表达载体克隆有上述实施例所述的zfy基因的RNA干扰片段。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明实施例提供的zfy基因的RNA干扰片段通过对雄性犬的生殖细胞Y精子生成的相关基因进行沉默，阻碍或者破坏Y精子的正常发育和功能。在与雌性犬交配时给与了X精子更多的受精机会，在受精前有效的控制了犬的性别从而使子一代犬产生的雌犬率大大升高。本方法对所需精子细胞不会造成损伤或者降低其活力，而且成本低廉。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
构建zfy基因的RNAi干扰载体：
所使用的zfy基因序列来自于NCBI基因库，根据RNAi设计原则和在NCBI上的比对分析结果筛选出4个siRNA片段，如表1所示，为siRNA体外转录的zfy cDNA模板。分别在每个siRNA片段的5’和3’添加Hpa I和Xhol I酶切位点，参见表3所示，然后送生物公司合成siRNA片段。正、反义链通过退火合为双链连接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen Vector(Clontech，美国)载体上，然后转化到E.coli DH5α感受态细胞中(Tiangen,中国)进行扩增，提取质粒-20℃保存。
表1 siRNA的zfy cDNA模板
zfy基因的体外干扰试验：
选取5月龄的健康雄性当地土种犬3只，通过手术在无菌条件下取出每只犬的双侧睾丸，采用两步酶消化法分离出睾丸支持细胞和生精细胞。将这些分离出的细胞放入含10％胎牛血清的HamF12/DMEM培养液中，内添加HEPES(15mol/L)、100kU/L青霉素以及0.1g/L链霉素、1ug/ml表皮生长因子、100ul ITS(胰岛素,转铁蛋白,硒酸钠){胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(10μg/ml)}、3.3×10-7mol/L视黄酸、维生素A(3.3×10-7mo/L)、10μg/ml维生素E、10-4mol/L维生素C、10-3mol/L丙酮酸、10-7mol/L睾酮、25U/L rFSH。约按1×106CELL/cm2的密度接种于放有盖玻片的六孔板中，在32℃、5％CO2、湿度为95％的条件下培养24小时，用钙离子作为转染试剂将构建好的载体转染到生精细胞中，每组重复三次。转染48小时候提取生精细胞的总RNA，用RT-PCR检测zfy基因的mRNA表达水平(相关目的基因、内参基因引物、PCR条件见表2)。挑选出干扰效果较好的干扰片段进行下一步的实验，如表3所示，以下简称pzq1(Zfy1904)、pzq2(zfy1857)、pzq3(Zfy1018)和pzq4(Zfy291)，表3为zfy基因RNAi寡核苷酸序列的BamHI和EcoRI酶切位点。
表2.荧光实时定量目的基因和内参基因引物序列及PCR条件
表3.带有Hpa I和Xhol I酶切位点的zfyRNAi序列
zfy基因的动物体内干扰试验：
选取12只成年健康雄性当地土种犬，随机平均分为3组，每组4只；27只经产健康母犬随机分为3组，每组9只。每组雄犬分别睾丸注射干扰载体Pqz1、Pqz2和等体积的生理盐水，每只睾丸注射相同体积的干扰载体0.3mg。间隔10天注射一次连续注射3次。最后一次注射5天后随机挑选27只2岁龄的经产健康当地土种雌性犬腹腔注射PMSG 5U，42-48h后注射5U HCG，然后与每组其中3只雄犬按雌雄比例3:1合笼(此时距最后一次注射质粒7d)。每日早晨，观察阴道分泌物判断雌犬是否受孕，直至受孕，然后将雌犬与雄犬分开进行单笼饲养，观察产出后代的性别比例。合笼同时将每组剩余的1只雄犬处死，取双侧睾丸提取总RNA,用RT-PCR检测各组zfy基因的mRNA表达水平，如表2所示为目的基因的引物和PCR的条件。
本发明实施例应用PLL3.7慢病毒骨架质粒载体的特异性酶切位点Hpa I和Xhol I，来优化RNAi干扰载体，只保证载体侵染活力，不进行病毒包装，确保性控试剂的生物安全性。
实验结果：
1、RT-PCR检测生精细胞中zfy基因mRNA的表达水平：
选择构建好的干扰载体pzq1、pzq2、pzq3和pzq4，转染入体外培养的犬睾丸生精细胞，通过RT-PCR，以表2所示的荧光实时定量目的基因和内参基因引物序列及PCR条件，检测体外条件下，犬生精细胞zfy基因mRNA表达量。与正常对照组相比，干扰载体pzq3和pzq4对zfy基因的mRNA无干扰抑制作用。而干扰载体pzq1、pzq2均可降低犬生精细胞中zfy基因mRNA表达量。其中干扰组pzq1的生精细胞中zfy基因mRNA表达量降低98.7％，差异极显著(P＜0.01)。
2、RT-PCR检测注射干扰试剂的睾丸组织中zfy基因mRNA的表达水平：
将体外培养条件下，细胞水平筛选的有效干扰载体pzq1、pzq2注射入犬活体睾丸，采集睾丸组织，通过RT-PCR，以表2所示的荧光实时定量目的基因和内参基因引物序列及PCR条件，检测体内条件下，犬睾丸组织zfy基因mRNA表达量。与对照组相比，pzq2组zfy基因mRNA表达量下降了8％，差异不显著。而pzq1组zfy基因mRNA表达量下降了97％，差异极显著(P＜0.01)。结果显示实验组pzq1、pzq2中zfy基因mRNA的表达水平均低于对照组(生理盐水组)，pzq1差异极显著(P＜0.01)。
3、犬体内干扰试验结果：
如表4，将体外培养条件下，细胞水平筛选的有效干扰载体pzq1、pzq2，作为性控试剂，注射入犬活体睾丸，自然交配，统计子一代犬的雌雄数量。对照组注射生理盐水，子一代雌犬率为56.52％；注射pzq2载体，子一代雌犬率为52.38％，性别偏移不显著(P＞0.05)；注射pzq1载体，子一代雌犬率为79.17％，性别偏移差异极显著(P＜0.01)。结果显示实验组pzq2子一代犬的雌犬率与对照组没有差异(P＞0.05)，而实验组pzq1的子一代雌犬率高达79.17％，差异极显著(P＜0.01)。表4显示各组后代(子一代)雌雄犬数量。
表4犬睾丸注射干扰试验子一代性别统计表
注：两组之间有任一字母相同者为差异不显著，大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著。
表5体内外性控效果最好的干扰载体寡核苷酸序列
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。