本发明涉及一种有效制备果树高分子量DNA的方法。
背景技术：
高纯度、高质量的大分子量（HMW）DNA 是复杂基因组限制性酶酶切分析和大片段基因组文库构建的前提。植物（HMW）DNA可以从原生质体和细胞核中制备。用原生质体法能制备很少被剪切的高质量（HMW）DNA，但是该方法涉及到一系列降解细胞壁、分离、包埋和裂解等复杂、昂贵、耗时的过程，往往一种优化的方法仅对某种特殊植物材料有效，而且从原生质体中制备的（HMW）DNA有相对高的叶绿体和线粒体DNA 的污染，这不仅影响到用于所建基因文库的真实性，而且影响到随后的染色体步查及基因组分析结果的可靠性。
国外有研究团队首先从包埋于琼脂糖中的植物细胞核中分离（HMW）DNA，经过改进，此法对许多植物材料都有效，且得到的（HMW）DNA浓度高，叶绿体DNA 污染少。但是在制备核和随后裂解过程，造成相对严重的DNA 降解。Fu简化了植物细胞核的制备步骤，而通过脉冲电泳（PFGE ）来回收粗提核裂解物中的（HMW）DNA，得到了无叶绿体、线粒体DNA 污染、非特异小片段含量相对低的高质量（HMW）DNA。对大多数果树，很难分离原生质体，虽然能从组培细胞中分离，但组培过程慢，费事且易造成体细胞变异。因此，大多采用从核中制备果树（HMW）DNA 2。由于大多数果树叶片富含多酚多糖类物质，它们会给（HMW）DNA的制备及随后的分析带来很大麻烦，同时在去除多酚和多糖的纯化过程中，往往会影响了核DNA 的完整性，因而影响到所建大片段基因文库的真实性。
技术实现要素：
本发明提出一种有效制备果树高分子量DNA的方法。
一种有效制备果树高分子量DNA的方法，包括以下制备步骤：
（1）取苹果或桃或杏或樱桃或柿的鲜叶；核提取缓冲液：
（2）将10g鲜叶在液氮中研成细粉，加入200ml核提取缓冲液，置于冰浴中，用磁力搅拌器搅拌l0分钟；该匀浆经两层纱布过后，以3000转/分钟的速度，离心20分钟；
（3）弃上清，将沉淀物中加入少量核洗涤缓冲液，用毛刷轻轻打散，再加入约200ml核洗涤缓冲液混匀，以60转/分钟的速度，离心5分钟，弃沉淀；
（4）将上清液于2000转/分钟的速度下离心20分钟；
（5）将该沉淀洗涤l-3次，用lml lHB（无β-mercaptoet hanol ）将粗提核混匀，于45 C 下，与等量的l % LMP 琼脂糖混合均匀；
（6）将步骤（5）产物装入凝胶块模具中，在4摄氏度温度下凝固l小时，将包埋有细胞核的凝胶块推入20倍体积的核裂解缓冲液中，50摄氏度下裂解24小时，其间更换裂解液两次；
（7）将步骤（6）产物在4摄氏度下保存于0.5mol/L EDTA，lm mol／L PSMF 中；
（8）将上述凝胶块置于大量的0.5xTBE中透析两小时，然后包埋于l % 琼脂糖凝胶的加样孔中，进行脉冲电泳，电泳结束后染色l0 分钟后获得的（HMW）DNA胶块。
优选地，电解液为：0. 5xTBE和浓度为l%（Bio- Rad）的琼纸糖凝胶混合物。
优选地，所述电泳的环境为：脉冲电压：5V/cm， 脉冲角度：l20；脉冲温度：11摄氏度，脉冲交变时间为5-l5秒；脉冲电泳时间为l8小时。
本发明一种有效制备果树高分子量DNA的方法，步骤简单，容易操作，可以从绝大多数植物中制备（HMW）DNA，具有很好的推广作用。
具体实施方式
实施例1。
一种有效制备果树高分子量DNA的方法，包括以下制备步骤：
（1）取苹果或桃或杏或樱桃或柿的鲜叶；核提取缓冲液：
（2）将10g鲜叶在液氮中研成细粉，加入200ml核提取缓冲液，置于冰浴中，用磁力搅拌器搅拌l0分钟；该匀浆经两层纱布过后，以3000转/分钟的速度，离心20分钟；
（3）弃上清，将沉淀物中加入少量核洗涤缓冲液，用毛刷轻轻打散，再加入约200ml核洗涤缓冲液混匀，以60转/分钟的速度，离心5分钟，弃沉淀；
（4）将上清液于2000转/分钟的速度下离心20分钟；
（5）将该沉淀洗涤l-3次，用lml lHB（无β-mercaptoet hanol ）将粗提核混匀，于45 C 下，与等量的l % LMP 琼脂糖混合均匀；
（6）将步骤（5）产物装入凝胶块模具中，在4摄氏度温度下凝固l小时，将包埋有细胞核的凝胶块推入20倍体积的核裂解缓冲液中，50摄氏度下裂解24小时，其间更换裂解液两次；
（7）将步骤（6）产物在4摄氏度下保存于0.5mol/L EDTA，lm mol／L PSMF 中；
（8）将上述凝胶块置于大量的0.5xTBE中透析两小时，然后包埋于l % 琼脂糖凝胶的加样孔中，进行脉冲电泳，电泳结束后染色l0 分钟后获得的（HMW）DNA胶块。
优选地，电解液为：0. 5xTBE和浓度为l%（Bio- Rad）的琼纸糖凝胶混合物。
实施例2。
一种有效制备果树高分子量DNA的方法，包括以下制备步骤：
（1）取苹果或桃或杏或樱桃或柿的鲜叶；核提取缓冲液：
（2）将10g鲜叶在液氮中研成细粉，加入200ml核提取缓冲液，置于冰浴中，用磁力搅拌器搅拌l0分钟；该匀浆经两层纱布过后，以3000转/分钟的速度，离心20分钟；
（3）弃上清，将沉淀物中加入少量核洗涤缓冲液，用毛刷轻轻打散，再加入约200ml核洗涤缓冲液混匀，以60转/分钟的速度，离心5分钟，弃沉淀；
（4）将上清液于2000转/分钟的速度下离心20分钟；
（5）将该沉淀洗涤l-3次，用lml lHB（无β-mercaptoet hanol ）将粗提核混匀，于45 C 下，与等量的l % LMP 琼脂糖混合均匀；
（6）将步骤（5）产物装入凝胶块模具中，在4摄氏度温度下凝固l小时，将包埋有细胞核的凝胶块推入20倍体积的核裂解缓冲液中，50摄氏度下裂解24小时，其间更换裂解液两次；
（7）将步骤（6）产物在4摄氏度下保存于0.5mol/L EDTA，lm mol／L PSMF 中；
（8）将上述凝胶块置于大量的0.5xTBE中透析两小时，然后包埋于l % 琼脂糖凝胶的加样孔中，进行脉冲电泳，电泳结束后染色l0 分钟后获得的（HMW）DNA胶块。
（9）所述电解液为：0. 5xTBE和浓度为l%（Bio- Rad）的琼纸糖凝胶混合物
（10）所述电泳的环境为：脉冲电压：5V/cm， 脉冲角度：l20；脉冲温度：11摄氏度，脉冲交变时间为5-l5秒；脉冲电泳时间为l8小时。