一种双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种双网络聚(N-丙烯酰基-L- α -氨基酸)/透明质酸复合水凝胶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]随着三维细胞培养技术的快速发展，水凝胶越来越受重视，因为其不仅具有与活体组织类似的多孔弹性水合网络，还利于氧、营养物质和代谢废物在其中的传输，可为细胞粘附、增殖和分化提供理想的三维微环境。水凝胶已广泛用于生物医学研宄领域，如药物或蛋白递送、细胞递送、生物粘合剂、组织工程、体外细胞三维培养等。其中，由天然高分子制备的水凝胶，如藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、胶原、丝素蛋白等，具有良好的生物相容性、生物可降解性、细胞粘附性等性质。制备水凝胶的交联方法主要包括物理交联和化学交联两种。物理交联方法通常工艺简单，但形成水凝胶强度不够高，而化学交联方法如光交联、碳二亚胺法交联、点击化学交联等可赋予凝胶高的力学性能。然而，单一化学交联方法制备的水凝胶无法满足较高应力环境下应用的要求，如骨或软骨组织等。为提高水凝胶的力学性能，新的技术手段不断出现，如双交联网络结构水凝胶、互穿网络水凝胶、纳米复合凝胶和拓扑水凝胶等。
[0003]双交联网络水凝胶由两种三维聚合物网络构成，可克服彼此缺点，具有良好的综合性能，尤其是拥有较高的力学强度，近年受到越来越多的关注。如利用聚丙烯酸改性聚乙二醇形成互穿网络结构水凝胶，可使聚乙二醇水凝胶模量提高3.2倍[Waters DJ, etal.Structure and mechanism of strength enhancement in interpenetrating polymernetwork hydrogels.Macromolecules, 2011, 44:5776-5787];由聚甲基丙稀酰化古兰糖胶和聚甲基丙烯酰胺化明胶制成的双网络水凝胶不仅具有高达6.9MPa的断裂应力，还可有效支持 NIH-3T3 纤维原细胞的生长[Shin H, et al.The mechanical properties andcytotoxicity of cell-laden double-network hydrogels based on photocrosslinkabIegelatin and gelIan gum b1macromolecules.B1materials, 2012, 33:3143-3152];再如，以中性寡聚(2，2-二甲基三亚甲基碳酸酯)-聚(乙二醇)_寡聚(2，2-二甲基三亚甲基碳酸酯)_ 二丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯化透明质酸为原料，经两步光化学交联法制备的双网络水凝胶最大压缩应力高达8.38MPa，可有效支持猪软骨细胞生长[Fan CJ, et al.A toughdouble network hydrogel for cartilage tissue engineering.Journal of MaterialsChemistry B，2013，1:4251-4258]。尽管这些水凝胶具有较高的力学性能和良好的生物相容性，但是它们无法满足细胞三维培养结束时需要细胞/基质快速分离的应用环境。因此，开发能响应刺激信号实现快速解离并具有良好力学性能和生物相容性的水凝胶，具有重要的研宄价值。
[0004]聚氨基酸(或称为多肽)是一类具有良好生物相容性、酶特异性降解性和功能性的新型材料，其含有的功能性基团如-NH2、-COOH赋予其独特的生物学性能，如碱性聚赖氨酸荷正电对蛋白质、DNA和细胞膜就有很强的亲和性、可刺激免疫球蛋白和干扰素 β 的合成、抑制肿瘤生长[Kuo YC, et al.Chondrogenesis in scaffolds withsurface modificat1n of elastin and poly-L-lysine.Colloids and SurfacesB:B1interfaces, 2012, 93:85-91];酸性聚氨基酸能诱导仿生矿化和骨细胞分化[AmosiN, et al.Acidic peptide hydrogel scaffolds enhance calcium phosphate mineralturnover into bone tissue.Acta B1materialia, 2012，8:2466-2475]。另一方面，由L- α -氨基酸丙烯酰化衍生物经自由基聚合形成的聚(N-丙烯酰基-L- α -氨基酸)，同样具有聚氨基酸的诸多性质，在生物医学领域具有良好的应用前景，然而这类材料应用于生物医学领域的研宄尚处于婴儿期，在组织工程等领域的应用极少。这类聚合物形成的水凝胶脆性和模量均较大，单独使用有一定限制。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种双网络聚(N-丙烯酰基-L- α -氨基酸)/透明质酸复合水凝胶及其制备方法。该方法制得的复合水凝胶的交联网链中含有二硫键，具有快速的还原解离性质；且该复合水凝胶的荷电状态、模量、降解性能、微孔结构等性质可灵活调控，在组织工程、三维细胞培养、体外肿瘤模型等生物医学领域应用前景广阔。
[0006]为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0007]一种双网络聚(N-丙烯酰基-L-α -氨基酸)/透明质酸复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤:
[0008]配制质量百分浓度为I %?4%的酰肼化透明质酸溶液，并将其pH值调至4?6.5 ;将N-丙烯酰基-L- α -氨基酸、N，N’ -双丙烯酰基_L_胱氨酸、水溶性光引发剂和多端羰基聚乙二醇溶于蒸馏水中配成混合物溶液；按体积比为1: (0.5?2)将混合物溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，混合均匀后置于模具中进行紫外光辐照，即得到双网络聚(N-丙烯酰基-L- α -氨基酸)/透明质酸复合水凝胶；其中混合物溶液中N-丙烯酰基-L- α -氨基酸的质量百分浓度为10%?30%，N-丙烯酰基-L-α -氨基酸、N，N’ -双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂的摩尔比为100: (2.5?15): (0.1?0.8)，酰肼化透明质酸中的酰肼基团和多端羰基聚乙二醇中的端羰基团的摩尔比为1: (0.2?I)。
[0009]所述的酰肼化透明质酸是由分子量为20万?500万的透明质酸经碳二亚胺法接枝2，2’ - 二硫代二乙酰肼、3，3’ - 二硫代二丙酰肼或4，4’ - 二硫代二丁酰肼形成的，取代度为 10%?50%。
[0010]所述的酰肼化透明质酸的合成方法如下:
[0011]将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和含二硫键的二酰肼溶于蒸馏水中配成混合溶液，混合溶液中透明质酸的质量百分浓度为0.2?2%，且透明质酸重复单元数、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、含二硫键的二酰肼的摩尔比为100: (12?55): (15?60): (96?660);将混合溶液的pH值调至4.5?5.5，室温下搅拌反应24?48小时，反应结束后，反应体系依次经透析和冷冻干燥，得到酰肼化透明质酸。
[0012]所述的N-丙烯酰基-L- α -氨基酸为N-丙烯酰基_L_谷氨酸、N-丙烯酰基_L_天冬氨酸、Νε -丙烯酰基-L-赖氨酸、NS-丙烯酰基-L-鸟氨酸、N-丙烯酰基-L-丙氨酸、N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸或N-丙烯酰基-L-缬氨酸。
[0013]所述的N-丙烯酰基-L- α -氨基酸的合成方法如下:
[0014]将L- α -氨基酸(其中L-赖氨酸和L-鸟氨酸为其铜络合物形式)溶于水中形成质量百分浓度为5%?20%的L-α -氨基酸水溶液，将其置于冰水浴中搅拌冷却，然后在0.5?2小时内滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中维持体系pH在8?9.5之间，其中滴加的氯仿溶液的体积为L-α -氨基酸水溶液体积的10%?25%，丙烯酰氯与L-α -氨基酸的摩尔比为(1.2?2):1 ;滴加完毕后在室温下继续搅拌反应4小时，随后向反应体系中加入8?12倍体积的沉淀剂(采用铜络合物时需先用L- α -氨基酸摩尔数1.5倍的8_羟基喹啉除铜)，沉淀剂为乙醇、甲醇、丙酮或四氢呋喃，然后收集沉淀物并真空干燥，得到N-丙稀酰基_L_ α -氨基酸。
[0015]所述的N，N’ -双丙烯酰基-L-胱氨酸的合成方法如下:
[0016]将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/mL?0.5g/mL的L-胱氨酸溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2:1 ;然后对L-胱氨酸溶液进行冰浴冷却，再向其中滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，其中丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为(2.1?2.3):1，滴加过程中维持体系PH = 8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持I?4小时，再在零下20°C进行冷冻干燥；将冷冻干燥得到的物质溶于pH = 2的水中，得到质量百分浓度为5%?20%的溶液，然后用6?12倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N