专利名称：一种生产透明质酸发酵液的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，涉及一种生产透明质酸发酵液的方法。
背景技术：
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一种大分子粘多糖，广 泛存在于生物体的结缔组织中。在不同组织中HA的生理作用有所不同，如在关节滑液中主 要为润滑作用；在血管壁中主要是调节通透性；在皮肤中主要表现为保水作用。另外，HA作 为聚阴离子电解质，分子上所带的大量负电荷，可调节周围正负离子的浓度，抑制多种酶的 活性，广泛应用于眼科粘性手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是预防 和减少外科手术后组织粘连中取得了较大的进展。发酵法生产透明质酸所使用的微生物常见的有化脓链球菌、兽疫链球菌、马疫链 球菌、类马链球菌、缺乳链球菌、鸡霍乳杆菌等，微生物生长的前提是有充足的碳源、能量 和生长必需的物质，但在现有技术中，所提供的营养物质主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解 物、蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出液、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐 等，然而仅有这些营养物质是不够的，实验证明，在这些营养物质存在下，微生物并不能良 好的成长，从而影响透明质酸的产量和质量。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是由于细菌发酵生产透明质酸的过程中由于营 养物质缺乏或各种营养物质之间调配不当而引起的透明质酸产量及质量的下降的问题，并 提供一种生产透明质酸发酵液的方法，采用本发明的方法即可有效解决这一问题。本发明通过以下方案解决该技术问题一种生产透明质酸发酵液的方法，以兽疫链球菌H23为发酵菌株，其步骤为a、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，得到兽疫链球菌 H23菌体；b、配置种子培养基，所述种子培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸 锰、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成，所述 缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，配置种子培养基所用的水为注射用水，种子培养基 预先用氢氧化钠调节PH值至7. 2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养， 得到兽疫链球菌H23种子培养液；C、配置发酵培养基，所述发酵培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸 钾、精氨酸、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组 成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，配置发酵培养基所用的水为注射用水，发 酵培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7. 2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发 酵培养液，得到透明质酸发酵液。本发明所采用的方法中有配置种子培养基及配置发酵培养基步骤，在这些步骤
4中，本发明为种子培养基及发酵培养基添加了微量元素液，并合理的选择了微量元素液中 的各种营养物质，该微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成。另外，本发明在发 酵培养基上还添加了精氨酸，对于有多种氨基酸缺陷的兽疫链球菌来说，其生长和代谢需 要供给各种氨基酸，均衡的供给各种氨基酸，可消除少部分氨基酸的限制，减轻过量氨基酸 的抑制，有利于菌体正常的生长和代谢，本发明所添加的精氨酸正是兽疫链球菌所缺乏的， 因此，本发明所提供的各种营养物质能够确保兽疫链球菌的生长，从而为提高透明质酸的 产量与质量打下良好的基础，下面是种子培养液与发酵培养液各营养物质的调配量种子培养基包含蔗糖浓度为10_20g/L酵母粉浓度为15. 0-25. Og/L硫酸镁浓度为1. 0-5. Og/L磷酸二氢钾浓度为1. 0-4. Og/L,硫酸锰浓度为0. 01-0. 2g/L微量元素液浓度为0. 5-10ml/L，缓冲液为10_200ml/L ；所述微量元素液中氯化钙浓度为50-5000mg/L，氯化锌浓度为10-200mg/L，硫酸 锰浓度为l_50mg/L，硫酸铜浓度为l-100ml/L ；
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10_70g/L，磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。 发酵培养基包含
蔗糖浓度为30-120g/L 硫酸镁浓度为1. 0-5. Og/L 硫酸钾浓度为0. 5-4. Og/L 微量元素液浓度为1. 0-10. 0ml/L
酵母粉浓度为15. 0-25. 0g/L 磷酸二氢钠浓度为1. 0-6. 0g/L 精氨酸浓度为0. 01-0. 2g/L 缓冲液浓度为5-200ml/L
所述微量元素液中氯化钙浓度为200-5000mg/L，氯化锌浓度为5_300mg/L，硫酸 锰浓度为l_50mg/L，硫酸铜浓度为l-200mg/L ；所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10_70g/L，磷酸二氢钠浓度为15_30g/L。为使兽疫链球菌能够迅速大量繁殖，培养种子培养基的培养条件可以是培养温 度37°C，震荡培养10-14小时。作为本发明方法中c步骤的发酵条件，发酵搅拌速度可以是200-300rpm，发酵温 度为37°C，用30%氢氧化钠溶液调节发酵培养基的酸碱度，使发酵培养基的PH值始终保持 在7.0士0. 1之间，通气量为lvvm，发酵时间为18-22小时。本发明所要解决的另一个问题就是种子培养基和发酵培养基含有热原性物质的 问题，在本发明之前，发酵法生产透明质酸的方法中种子培养基和发酵培养基多采用自来 水或纯化水进行配制，但自来水或纯化水中含有热原性物质，而热原性物质往往会在发酵 生产透明质酸的过程中产生不良反应或者与兽疫链球菌形成竞争关系，本发明使用注射用 水配置种子培养基和发酵培养基，其目的就在于从源头上杜绝热原性物质，实验证明，本发 明所使用的这一策略能够有效地提高透明质酸的质量。
具体实施例方式实施例1下面对本发明做进一步的说明以兽疫链球菌H23为发酵菌株生产透明质酸发酵液的方法，其步骤为
1、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，于37°C培养16小 时，得到兽疫链球菌H23菌体；2、配置500ml种子培养基种子培养基的组成为蔗糖10g/L，酵母粉15. Og/L，硫酸镁1. Og/L，磷酸二氢钾 1. Og/L，硫酸锰0. 03g/L，微量元素液20ml/L，缓冲液100ml/L ；其中微量元素液的组成为氯化钙1000mg/L，氯化锌100mg/L，硫酸锰30mg/L，硫 酸铜 80mg/L ；其中缓冲液的组成为磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠25g/L。配置种子培养基所用的水为注射用水，配置好的种子培养基预先用30%氢氧化钠 调节PH值至7. 2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，于37°C震荡培养 12小时，得到兽疫链球菌H23种子培养液；3、配置5L发酵培养基发酵培养基的组成为蔗糖100g/L，酵母粉15. 0g/L，硫酸镁5. 0g/L，磷酸二氢钠 5. 0g/L，硫酸钾3. 5g/L，精氨酸0. 15g/L，微量元素液10ml/L，缓冲液100ml/L ；其中微量元素液的组成为氯化钙4000mg/L，氯化锌200mg/L，硫酸锰35mg/L，硫 酸铜 160mg/L ；其中缓冲液的组成为磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠25g/L。配置发酵培养基所用的水为注射用水，并装入10L的发酵罐中，配置好的发酵培 养基预先用30 %氢氧化钠调节PH值至7. 2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发 酵培养液，接种后在搅拌转速为100-300rpm，温度为37°C，PH值为7. 0，通气量为Ivvm条件 下培养20小时，得到透明质酸发酵液，发酵过程中用30%氢氧化钠调节发酵液的PH值，使 PH值保持在7.0士0. 1之间。表1是实施例1所生产的透明质酸发酵液的质量表。表 权利要求
一种生产透明质酸发酵液的方法，以兽疫链球菌H23为发酵菌株，所述发酵方法的步骤为a、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，得到兽疫链球菌H23菌体；b、配置种子培养基，所述种子培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，配置种子培养基所用的水为注射用水，种子培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，得到兽疫链球菌H23种子培养液；c、配置发酵培养基，所述发酵培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸钾、精氨酸、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，配置发酵培养基所用的水为注射用水，发酵培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液，即可得到透明质酸发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于b步骤的种子培养液中蔗糖浓度为10-30g/L，酵母粉浓度为15. 0-25. Og/L，硫酸镁浓 度为1. 0-5. Og/L，磷酸二氢钾浓度为1. 0-4. Og/L，硫酸锰浓度为0. 01-0. 2g/L，微量元素液 浓度为 0. 5-10ml/L,缓冲液为 10-200ml/L ；所述微量元素液中氯化钙浓度为500-5000mg/L，氯化锌浓度为10-200mg/L，硫酸锰浓 度为l_50mg/L，硫酸铜浓度为l-100mg/L ；所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10_70g/L，磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于c步骤的发酵培养基中蔗糖浓度为30-120g/L，酵母粉浓度为15. 0-25. Og/L，硫酸镁浓 度为1. 0-5. Og/L，磷酸二氢钠浓度为1. 0-6. 0g/L，硫酸钾浓度为0. 5-4. 0g/L，精氨酸浓度 为0. 01-0. 2g/L，微量元素液浓度为l-10ml/L，缓冲液浓度为5_200ml/L ；所述微量元素液中氯化钙浓度为200-5000mg/L，氯化锌浓度为5_300mg/L，硫酸锰浓 度为l_50mg/L，硫酸铜浓度为l-200mg/L ；所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10_70g/L，磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。
4.根据权利要求1或2所述的一种生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于b步骤中 种子培养基的培养条件为培养温度37°C，震荡培养10-14小时。
5.根据权利要求3所述的一种生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于b步骤中种子 培养基的培养条件为培养温度37°C，震荡培养10-14小时。
6.根据权利要求1或2所述的一种生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于c步骤中 的发酵过程中，发酵搅拌速度为100-400rpm，发酵温度为37°C，用30%氢氧化钠溶液调节， 使发酵培养基的PH值在7.0士0. 1之间，通气量为lvvm，发酵时间为18-22小时。
7.根据权利要求3所述的一种生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于c步骤中的发 酵过程中，发酵搅拌速度为100-400rpm，发酵温度为37°C，用30%氢氧化钠溶液调节，使发 酵培养基的PH值在7.0士0. 1之间，通气量为lvvm，发酵时间为18-22小时。
8.根据权利要求4所述的一种生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于c步骤中的发酵过程中，发酵搅拌速度为100-400 rpm，发酵温度为37°C，用30%氢氧化钠溶液调节，使发 酵培养基的PH值在7.0士0. 1之间，通气量为lvvm，发酵时间为18-22小时。
全文摘要
本发明属于发酵技术领域，涉及一种生产透明质酸发酵液的方法，为了解决现有技术细菌发酵生产透明质酸的过程中由于营养物质缺乏或各种营养物质之间调配不当而引起的透明质酸产量及质量的下降的问题，本发明在营养物质中添加了微量元素液，并使用注射用水配制种子培养基和发酵培养基，采用这种方案后，就可有效解决上述技术问题，本发明所述生产透明质酸发酵液的方法生产的透明质酸发酵液再经过纯化处理，即可得到医药级透明质酸。
文档编号C12P19/04GK101935678SQ20091005415
公开日2011年1月5日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者付爱玲, 张延良, 曾辉, 黄宇 申请人:上海佰加壹医药有限公司