专利名称：一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及发酵液中透明质酸含量测定技术领域，特别涉及一种使用近红外光谱快速测定发酵液中透明质酸含量的方法。
背景技术：
透明质酸(Hyaluronic acid, HA)又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，具有独特的黏弹性和生理功能，是细胞外基质的主要成分，被广泛应用于医药、美容和保健食品等行业。含量是透明质酸发酵过程中的一个重要参数，对发酵菌种选育、工艺优化和发酵过程控制具有重要指导意义。目前透明质酸的含量测定方法主要是通过降解后显色，根据光吸收测定其中葡糖醛酸或者氨基葡糖的含量，从而推算透明质酸的含量。这些方法操作比较复杂，耗时耗力，条件苛刻，发酵基质对测定结果干扰严重，并且数据的提供往往滞后于生产过程，不能满足快速分析的需要。
发明内容
为了解决上述现有技术中测定发酵液中透明质酸含量的方法耗费试剂、操作复杂、发酵基质对测定结果干扰严重等问题，本发明提供了一种能够快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，本发明的方法绿色无污染，简便易行，能快速可靠的测定发酵液中透明质酸的含量。本发明是通过以下方式实现的
一种使用近红外光谱快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，包括以下步骤
(1)择取发酵条件一致的不同批次透明质酸发酵液；
(2)每隔一定时间，各取上述不同批次的发酵液，测定其中透明质酸的实际含量，并在温度一致的条件下，采用近红外光谱分析仪测得各不同批次发酵液的原始近红外光谱；
(3)采用一阶导数结合Norris5点平滑的预处理方法对原始近红外光谱进行预处理， 在7312. 7 cm^-lOOOOcm-1波段范围内，将发酵液中透明质酸的实际含量与预处理后的近红外图谱采用偏最小二乘法进行关联建立数学模型，形成快速定量发酵液中透明质酸含量的近红外光谱分析数学模型；
(4)取与步骤(1)中发酵条件一致的待测透明质酸含量的发酵液，在与步骤(2)温度一致的条件下，测其近红外光谱谱图，根据步骤(3)的近红外光谱分析数学模型，预测透明质酸含量。步骤(1)中发酵液中含有蛋白胨2wt%，酵母粉1. 5wt%，葡萄糖6wt%，磷酸氢二钾 0. 02wt%，硫酸镁0. lwt%，谷氨酸钠0. lwt%，在5吨的发酵罐内，37°C中性条件下进行发酵。步骤(2)中每隔一定时间优选为两个小时。步骤(2)中在温度一致的条件下为在4°C条件下。为了消除与待测样品性质无关的因素对近红外光谱的影响，在全光谱区域考察不同的光谱预处理方法对模型性能的影响，并采用内部交叉验证法对模型主成份数进行选取。采用剩余批次发酵液考察模型的预测能力，以校正集相关系数(R。)，交叉验证均方根误差(RMSECV)，验证集相关系数(艮)，预测均方根误差(RMSEP)为评价指标，最终选择一阶导数结合Norris 5点平滑的预处理方法，作为建模的最优预处理方法。本发明的有益效果
1、绿色无污染，简便易行，能快速可靠的测定发酵液中透明质酸的含量；
2、误差在允许的范围之内；
3、本发明方法简便易行，适于对发酵液中透明质酸含量进行快速无损无污染的定量分析，为透明质酸的发酵菌种选育、工艺优化和发酵过程控制提供快速的技术数据支持；
4、经过一阶导数N0rris5点平滑之后的光谱，消除了基线漂移，强化了谱带特征，克服了谱带重叠，有利于复杂基质中有效信息的提取。
图1为本发明采集的透明质酸发酵液近红外光谱谱图2为本发明获得的光谱在7312. 7 cm^-lOOOOcm"1范围内经过一阶导数和Norris 5 点平滑后得到的发酵液近红外光谱谱图3为发酵液中透明质酸含量模型的RMSECV与主成分数关系图； 图4为校正集样品真实值和预测值相关系数图。
具体实施例方式实施例1
(1)首先取发酵条件一致的7个批次的透明质酸发酵液，发酵液中含有蛋白胨2wt%，酵母粉1. 5wt%，葡萄糖6wt%，磷酸氢二钾0. 02wt%,硫酸镁0. lwt%，谷氨酸钠0. lwt%，在5吨的发酵罐内，37°C中性条件下进行发酵，发酵周期约M小时；
(2)根据透明质酸发酵周期，从第10个小时开始每隔2小时收集一次发酵液，在4°C的条件下，采用Thermo Fisher公司的Antaris II近红外光谱仪测得上述发酵液的原始近红外光谱，如图1所示，并采用咔唑比色法测定其中透明质酸的实际含量，详见表1，
表1发酵液中透明质酸含量
权利要求
1.一种使用近红外光谱快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，其特征是包括以下步骤(1)择取发酵条件一致的不同批次透明质酸发酵液；(2)每隔一定时间，各取上述不同批次的发酵液，测定其中透明质酸的实际含量，并在温度一致的条件下，采用近红外光谱分析仪测得各不同批次发酵液的原始近红外光谱；(3)采用一阶导数结合Norris5点平滑的预处理方法对原始近红外光谱进行预处理， 在7312. 7 cm^-lOOOOcm-1波段范围内，将发酵液中透明质酸的实际含量与预处理后的近红外图谱采用偏最小二乘法进行关联建立数学模型，形成快速定量发酵液中透明质酸含量的近红外光谱分析数学模型；(4)取与步骤(1)中发酵条件一致的待测透明质酸含量的发酵液，在与步骤(2)温度一致的条件下，测其近红外光谱谱图，根据步骤(3)的近红外光谱分析数学模型，预测透明质酸含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中发酵液中含有蛋白胨2wt%，酵母粉1. 5wt%，葡萄糖6wt%，磷酸氢二钾0. 02wt%,硫酸镁0. lwt%，谷氨酸钠0. lwt%，在5吨的发酵罐内，37 °C中性条件下进行发酵。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中每隔一定时间优选为两个小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中在温度一致的条件下为在4°C 条件下。
全文摘要
本发明涉及发酵液中透明质酸含量测定技术领域使用近红外光谱快速测定发酵液中透明质酸含量的方法择取发酵条件一致的透明质酸发酵液；隔一定时间测定透明质酸的实际含量，在温度一致条件下，用近红外光谱分析仪测各不同批次发酵液的原始近红外光谱；采用一阶导数+Norris5点平滑的方法对原始近红外光谱进行预处理，在7312.7cm-1-10000cm-1波段范围内，将发酵液中透明质酸的实际含量与预处理后的近红外图谱采用偏最小二乘法进行关联建立数学模型；取待测透明质酸含量的发酵液，测其近红外光谱谱图，根据数学模型预测透明质酸含量。绿色无污染，简便易行，能快速可靠的测定发酵液中透明质酸的含量；误差小。
文档编号G01N21/35GK102297846SQ20111021247
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者刘爱华, 张惠, 栾贻宏, 石艳丽, 臧恒昌, 董芹, 郭学平 申请人:山东福瑞达生物医药有限公司